1、基因工程常用工具酶基因工程常用工具酶限 制 性 内 切 酶DNA 连 接 酶DNA 聚 合 酶修 饰 酶限制性内切酶1、发现历史2、分类和命名3、型核酸内切酶基本特征4、酶切反应要点5、双酶切的技巧核酸酶的分类 内切酶 非专一性 外切酶 核酸酶 内切酶 RNA 外切酶 专一性 非限制性 内切酶 限制性限制性 DNA 外切酶 限制性内切酶的类型基因工程中最常用的是型酶型酶型酶的命名、书写规则1、前三个字母用 斜体，其他用 正体 表示。2、前三个字母来自于产生该酶的微生物的 拉丁名，其中，第1个为属名的第一个字母，后两个为种名的前两个字母。3、如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号
2、；4、名称最后部分往往包含罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。（示例）限制酶限制酶 来源来源 剪切方式剪切方式 Eco R I Escherichia coli RY 13 GAATTC Pst I Providencia stuartii 164 CTGCAG型核酸内切酶基本特征 1、每一种酶都有各自特异的识别序列。、每一种酶都有各自特异的识别序列。(1)序列不同 (2)长度不同：47 bp (3)但与DNA来源无关 2、识别序列一般具有回文结构。、识别序列一般具有回文结构。5 GA A T T C 3 3 C T T A AG 5 3.切割后切割后,产物产物 的特点的特点 （
3、1）5pi,3OH （2）平端 粘端 都是 5 突出 或 都是 3 突出 （3）粘端可重新通过氢键配对 4.特殊性质特殊性质 Eco R1切割型核酸内切酶的特殊性质特殊性质1、同位酶：、同位酶：识别相同序列，但切割位点不一样的酶(如Sma I 和 Xma I)2、同尾酶、同尾酶:识别位点不同，但切割出相同的末端序列（Bam H I 和 Bcl I)；3、同裂酶：、同裂酶：识别位点和切割位点都相同的酶（Hpa I 和 Hin c )；4、甲基化的调节、甲基化的调节：Msp I(所有）和Hpa (非甲基化）5、Star 活性活性（星号活性）（星号活性）：在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别
4、序列类似的序列。在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoR*。6、位置效应、位置效应 酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同（侧翼序列太短无法切）酶切反应要点 1.温度:一般37C,特殊25C(Sma I)2.对Na+要求不一样分成3类:【低盐（0)】【中盐（50 mM】【高盐（100mM)】3、尽量使反应体积最小,但 酶的用量不超过总体积的 10%(甘油抑制酶活)4.决不能用水稀释,以免变性失活。5.先配好其它试剂，最后才加酶；6.取酶立即放于冰上，用完后立即放入20C。7.使用无菌的新枪头。双酶切的技巧 1、两种酶buf 不一样 (1)选通用buf (2)先用(低盐buf
5、+E低)反应,后补高盐buf+E高反应；2.两种酶反应温度不一样：（1）先(E1+T1)反应,后（E2T2）反应；3.E1结果影响E2反应：(1)先加E2反应,后加E1反应连接酶(DNA ligase)1.作用原理 2 用途 3.操作要点连接酶的作用原理在E.coli和动植物细胞中都有此酶。能催化DNA 中相邻的3-OH和5-P之间形成磷酸二脂键。B B B B B B E.coli ligase 5 OH 3 P P P P P P NAD NMN B B B B B B T4 ligase OH P P P P P P ATP PPiFunction of T4 DNA ligase(1)
6、能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口(2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口；用途：用途：(1)通过粘端连接DNA分子；(2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接头的连接。连接酶操作要点 T：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37,因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用16（4-16）。DNA concentrations：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 Time:O/N better 平端连接:加大酶量DNA聚合酶1.Taq
7、酶2.Klenow 酶3.反转录酶4.末端转移酶Taq 酶耐热DNA聚合酶:94 能较长时间保持活性,最适温度72;方向:53底物:模板+引物+dNTP(还需Mg2+)反应速度:1 kb/min不同种类的 Taq 酶功能不同.用途:(1)PCR (2)sequence (3)TA cloneKlenow 酶特点:1.DNA聚合酶的C-端大片段(被枯草杆菌蛋白酶切割)2.MW76kD3.53聚合酶活性(合成)4.3 5外切酶活性(矫正)反转录酶(reverse transcriptase)两种:AMV(来源于鸟类肿瘤病毒)-42 反应 M.M L V(来源于鼠白血病毒)-37反应主要特点:(1)
8、RNA DNA （）(2)DNA DNA (3)外切RNA (4)不具有 纠错功能用途：(1)mRNA转录成cDNA (2)以ssDNA或RNA为模板合成杂交探针 末端转移酶(terminal transferase)1.取自小牛胸腺2.催化脱氧核苷酸与DNA的3-OH结合 引物或底物是带有3-OH基的ssDNA或带有突出的双链DNA。不要求模板。3.两种反应：Mn2+或Mg2+ssDNAOH+ndNTP DNA-(pdN)n+nppi Co2+dsDNAOH+ndNTP DNA-(pdN)n+nppi4、用途：加一个同源多聚物，便于未知序列的操作。修饰酶 1、T4多核苷酸激酶 2、碱性磷酸化
9、酶 3、核酸酶 (1)核酸酶 Bal 31 (2)核酸外切酶 (3)单链核酸酶S1 4、DNA甲基化化酶甲基化化酶 T4多核苷酸激酶(Kinase)作用原理：催化ATP的 Pi转移到DNA或RNA的5-OH,使之磷酸化。用途：放射性标记 DNA链的5末端，探针标记注意：（1）铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA不能溶解于含铵盐的缓冲液中。（2）低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。（3）该酶很难纯化,酶制品经常不纯。碱性磷酸化酶作用原理：切除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5磷酸基团,变成5 OH。来源：（1）细菌碱性磷酸酶(BAP)：BAP活性更高,对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制BAP活性。（2）牛小肠碱性磷酸酶(CIP)：除去CIP可用蛋白酶K降解p 用途：（1）从DNA片段上除去5磷酸以防自身连接。（2）在放射性标记DNA 5末端前，除去磷酸。核酸酶S1(nuclease S1)1、是单链(ssDNA,ssRNA)特异性核酸酶。2、产物5pi3.pH4.5 ,Zn2+用途：(1)分析RNADNA杂合结构(内含子）；(2)除去DNA的单链末端，生成平端；(3)切断双链DNA 的发夹结构。DNA甲基化化酶 (1)保护不受切割(2)帮助切割帮助切割(Dpn1)
