1、一、基本概念一、基本概念1，发酵一词的来源，发酵一词的来源 “发酵发酵”（Fermentation）一词是拉）一词是拉丁语丁语“发泡发泡”（fervere）的派生词，它）的派生词，它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时产描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时产生气泡的现象。产生气泡的现象是由浸生气泡的现象。产生气泡的现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。二氧化碳所引起的。2，狭义，狭义“发酵发酵”的定义的定义 在生物化学或生理学上发酵是指微生在生物化学或生理学上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量
2、的一种方式，或者更严格地说，生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。原产能反应。工业上所称的发酵是泛指利用微生工业上所称的发酵是泛指利用微生物在物在有氧或者无氧有氧或者无氧条件下的生命活动条件下的生命活动来大量生产或积累来大量生产或积累微生物细胞、酶类微生物细胞、酶类和代谢产物和代谢产物的过程。的过程。空气空气净化处理筛选菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵碳源、氮源、无机盐等营养物质灭菌产物分离纯化成品FERMENTATIONProcess ControlFermentation engineering上游工程上游工程UP
3、STREAM PROCESSES下游工程下游工程DOWNSTREAM PROCESSESUPSTREAM PROCESSES-genetics,cell-media formulation-sterilization-InoculationFERMENTATIONProcess Control上游工程上游工程Fermentation engineeringDOWNSTREAM PROCESSES-product extraction,purification&assay-waste treatment-by product recoveryFERMENTATIONProcess Control
4、下游工程 Fermentation engineering菌种筛选菌种筛选摇瓶试验摇瓶试验发酵罐中试发酵罐中试发酵生产发酵生产类固醇生物转化类固醇生物转化底物底物葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶化学制剂化学制剂柠檬酸柠檬酸代谢产物的类别代谢产物的类别n初级代谢产物：初级代谢产物：氨基酸、核苷酸、蛋白氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等。质、核酸、脂类和碳水化合物等。n次级代谢产物：次级代谢产物：有些微生物的稳定期培有些微生物的稳定期培养物中所含有的化合物，并不在营养期养物中所含有的化合物，并不在营养期时出现，而且未见到对细胞代谢功能有时出现，而且未见到对细胞代谢功能有明显的影响。例如，抗生
5、素。明显的影响。例如，抗生素。4 4、微生物的生物转化、微生物的生物转化n定义：定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。但具有更在经济价值的化合物。n最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。一特定部位进行化学反应而形成的。第二节第二节 发酵的基本过程发酵的基本过程下游加工过程的一般流程下游加工过程的一般流程（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液发酵液初
6、步纯化初步纯化细胞碎片分离细胞碎片分离细胞破碎细胞破碎细胞分离细胞分离高度纯化高度纯化成品加工成品加工预处理预处理胞外产物胞外产物（加热、调（加热、调pH、絮凝）、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（匀浆、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）胞内产物胞内产物提取提取精制精制产品的收得率和质量控制产品的收得率和质量控制。第三节第三节 发酵菌种的选育发酵菌种的选育2、细菌的繁殖及菌落
7、、细菌的繁殖及菌落繁殖：主要二分裂繁殖：主要二分裂细胞伸长细胞伸长DNADNA分子分子 复制复制形成隔膜形成隔膜子细胞子细胞分离分离球形球形杆形杆形弧形弧形螺旋形螺旋形基内菌丝：基内菌丝：深入培深入培养基内，吸收营养养基内，吸收营养气生菌丝：气生菌丝：伸展在伸展在空气中空气中孢子丝：孢子丝：气生菌丝气生菌丝分化，具孢子分化，具孢子放线菌是产抗生素的主要菌类之一，从微放线菌是产抗生素的主要菌类之一，从微生物中发现的抗生素有生物中发现的抗生素有60%来自放线菌，迄来自放线菌，迄今由该菌产生的抗生素已达今由该菌产生的抗生素已达4000多种，已有多种，已有十种为常用药，如链霉素、四环素、红霉素、十种为
8、常用药，如链霉素、四环素、红霉素、金霉素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素等。金霉素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素等。分布与人类关系分布与人类关系二、优良菌种的选育二、优良菌种的选育是变异的一类。凡指细胞内或病毒粒内遗传是变异的一类。凡指细胞内或病毒粒内遗传物质的分子结构突然发生的可遗传的变化。物质的分子结构突然发生的可遗传的变化。可自发或诱导产生。可自发或诱导产生。狭义的突变：狭义的突变：专指基因突变（点突变）。专指基因突变（点突变）。广义的突变：广义的突变：包括基因突变和染色体畸变。包括基因突变和染色体畸变。从自然界从自然界分离到的、没有发生过突变的菌株。分离到的、没有发生过突变的菌株。条件致死突
9、变型（株）条件致死突变型（株）1 1 突变类型突变类型 突变株的表型突变株的表型选择性选择性突变株突变株非选择性非选择性突变株突变株营养缺陷型（株）营养缺陷型（株）抗性突变型（株）抗性突变型（株）形态突变型（株）形态突变型（株）抗原突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）产量突变型（株）突变的类型很多，按突变后极少数突变株的表型能否在选择突变的类型很多，按突变后极少数突变株的表型能否在选择培养基上迅速选出和鉴别，可分为：培养基上迅速选出和鉴别，可分为：1）.营养缺陷型（营养缺陷型（auxotroph）某一野生菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因某一野生菌株因发生基因突变而丧失合成一
10、种或几种生长因子、碱 基 或 氨 基 酸 的 能 力，因 而 无 法 在 基 本 培 养 基子、碱 基 或 氨 基 酸 的 能 力，因 而 无 法 在 基 本 培 养 基（minimum medium，MM）上正常生长繁殖的变异类型。）上正常生长繁殖的变异类型。2）.抗性突变型（抗性突变型（resistant mutant）野生菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物野生菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。理因子的抗性变异类型。3）.条件致死突变型（条件致死突变型（conditional lethal mutant）某菌株经基因突变后，在某种条件下可正
11、常地生长繁殖，而某菌株经基因突变后，在某种条件下可正常地生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变类型。如：温度敏感突在另一条件下却无法生长繁殖的突变类型。如：温度敏感突变株（变株（Ts突变株）。突变株）。4）.形态突变型（形态突变型（morphological mutant）由基因突变引起的个体或菌落形态的变异类型。由基因突变引起的个体或菌落形态的变异类型。5）.抗原突变型（抗原突变型（antigenic mutant）由基因突变引起的细胞抗原结构发生变化的变异类型。由基因突变引起的细胞抗原结构发生变化的变异类型。6）.产量突变型（产量突变型（metabolite quantitative
12、 mutant）因基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的因基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。若产量明显高于原始菌株者，称为正突变；反之称负突变株。若产量明显高于原始菌株者，称为正突变；反之称负突变。突变。2 基因突变的特点基因突变的特点自发性：自发性：可自发地发生突变。可自发地发生突变。不对应性：不对应性：突变性状与引起的原因间无直接对应突变性状与引起的原因间无直接对应关系。关系。稀有性：稀有性：通常自发突变的频率在通常自发突变的频率在10-6 10-9间。间。独立性：独立性：某基因的突变率不受他种基因突变率的某基因的突变率不受他种基因突变率的影响。影响
13、。可诱变性：可诱变性：自发突变的频率可因诱变剂的影自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提高（响而大为提高（10 105倍）。倍）。稳定性：稳定性：基因突变后的新遗传性状是稳定的。基因突变后的新遗传性状是稳定的。可逆性：可逆性：野生型菌株某一性状可发生正向突野生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发生相反的回复突变。变，也可发生相反的回复突变。1、自然选育、自然选育 自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然选育：不经人工处理，利用微生物的自自然突变然突变进行菌种选育的过程。进行菌种选育的过程。自然突变分为自然突变分为正变正变和负变。和负变。n以微生物的自然变异作为基础的生产选以微生物的自然变异作为
14、基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅变频率仅10-6-10-10左右，而且生产效率比左右，而且生产效率比较低。较低。采样采样增殖培养增殖培养纯种分离纯种分离平板粗筛平板粗筛初筛和复筛初筛和复筛毒理试验毒理试验目的菌种目的菌种n诱变育种：指用物理或化学诱变育种：指用物理或化学诱变诱变剂处理均匀而剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的然后采用简便、快速和高效的筛选筛选方法，从中方法，从中挑出少数符合育种目的的突变株，以供生产和挑出少数符合育种目的的突变株，以供生产
15、和科学实践使用。科学实践使用。效价：指有效成分的浓度。效价：指有效成分的浓度。1ug/ml 称为称为1 单位单位1945时间时间1943194319431947195519711977目目 前前发酵单位发酵单位(Uml1)100250500 850 850 80002 万万5万万 5万万10万万 从青霉素产量看诱变育种从青霉素产量看诱变育种（1 1）碱基的置换）碱基的置换点突变点突变一对碱基被另一对碱基置换。一对碱基被另一对碱基置换。1）转换）转换 DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤（一个嘧啶被另一链中的一个嘌呤被另一个嘌呤（一个嘧啶被另一 个嘧啶）所置换。个嘧啶）所置换。2）颠换）颠换 DNA
16、链中的一个嘌呤被另一个嘧啶（一个嘧啶被另一链中的一个嘌呤被另一个嘧啶（一个嘧啶被另一 个嘌呤）所置换。个嘌呤）所置换。碱基置换的两种类型碱基置换的两种类型转换（实线，对角线）和颠换（虚线，纵横线）转换（实线，对角线）和颠换（虚线，纵横线）（2）移码突变）移码突变 分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误ABC ABCABCABCABCABCABCABCAB+ABC ABCCBA CBA CBA CBA CBAABC BCA BCA BCABCABCABCABCA增添一个碱基增
17、添一个碱基缺少一个碱基缺少一个碱基DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入）或缺失，而序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入）或缺失，而使其后面的全部遗传密码发生改变，而引起转录和转译错误。使其后面的全部遗传密码发生改变，而引起转录和转译错误。染色体缺失，重复，易位，倒位等，即为染色体畸变。染色体缺失，重复，易位，倒位等，即为染色体畸变。（3 3）染色体畸变）染色体畸变染色体结构畸变的类型染色体结构畸变的类型 汇总汇总缺失（缺失（interstitial deletion,delinterstitial deletion,del）12345675123467123456712345
18、671234567重复（重复（duplication,dupduplication,dup）12345671234567123456751234671234567臂内倒位（臂内倒位（paracentricparacentric inversion inversion）123456756565656565665臂间倒位（臂间倒位（pericentricpericentric inversion inversion）1234567123456734124356734343434RAB1234567相互易位（相互易位（reciprocal translocationreciprocal transl
19、ocation）RAB12345677B插入（插入（insertion,insinsertion,ins）RAB1234567RAB1234567B567菌悬液菌悬液出发菌株出发菌株菌体的稀释液菌体的稀释液接种接种培养培养接种分离接种分离紫外线紫外线使用使用UV照射最为方便。取照射最为方便。取5ml单细胞悬液置于直径单细胞悬液置于直径6cm的培养皿中，的培养皿中，开盖照射；开盖照射；时间不短于时间不短于10 20s，也不长于，也不长于10 20min。挑选优良菌株挑选优良菌株15W、30cm5mL（2）使用化学诱变剂的优缺点：）使用化学诱变剂的优缺点：大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射
20、更有效。大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。（3）诱变育种步骤）诱变育种步骤出发菌株的选择出发菌株的选择处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备诱变处理诱变处理中间培养中间培养分离和筛选分离和筛选野生型菌种对诱变处理较敏感，容易达到好的效果野生型菌种对诱变处理较敏感，容易达到好的效果；每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高积累较多的提高；出发菌种开始时可以同时选出发菌种开始时可以同时选23株，处理比较后，将株，处理比较后，将更适合的菌种留作继续诱变；更适合的菌种留作继续诱变；选择多种不同的诱变剂选择多种不同的诱变剂。
