1、第七章产物的提取与精制概论概论v下游加工过程在发酵工程中的地位下游加工过程在发酵工程中的地位v下游加工过程的定义下游加工过程的定义 发酵产品系通过微生物发酵过程、酶反应过发酵产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得。从上述发酵液、程或动植物细胞大量培养获得。从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程称为下游加工过程(Down stream processing)。它由一些化学工程的单几操作。它由一些化学工程的单几操作组成，但由于生物物质的特性，有其特殊要求，组成，但由于生物物质的特性，有其特殊要求，而且其中
2、某些单元操作一般化学工业中应用较而且其中某些单元操作一般化学工业中应用较少。少。v地位地位传统发酵工业传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠如抗生素、乙醇、柠檬酸檬酸)，分离和精制部份占整个工厂，分离和精制部份占整个工厂投资费用的投资费用的60%。对重组对重组DNA发酵、精制蛋白质的费发酵、精制蛋白质的费用可占整个生产费用的用可占整个生产费用的80%90%。v下游加工过程的特点下游加工过程的特点v1、成分复杂：细胞、代谢产物、残余培养基、成分复杂：细胞、代谢产物、残余培养基v2、产品浓度低：传统发酵一般、产品浓度低：传统发酵一般110v3、失活问题、失活问题v4、不稳定性、不稳定性v5、纯度和生物安
3、全问题、纯度和生物安全问题v6、收率低：、收率低：50左右左右发酵工业下游技术的一般工艺过程发酵工业下游技术的一般工艺过程v下游加工过程由各种化工单元操作组成。下游加工过程由各种化工单元操作组成。由于生物产品品种多，性质各异，故用到由于生物产品品种多，性质各异，故用到的单元操作很多，其中如蒸馏、萃取、结的单元操作很多，其中如蒸馏、萃取、结晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操作，理论比较成熟，而另一些则为新近发作，理论比较成熟，而另一些则为新近发展起来的单元操作，如细胞破碎、膜过程展起来的单元操作，如细胞破碎、膜过程和色层分离等，缺乏完整的理论，介于两和色层分
4、离等，缺乏完整的理论，介于两者之间的有离子交换过程等。者之间的有离子交换过程等。一般工艺过程一般工艺过程v一般说来，下游加工过程可分为一般说来，下游加工过程可分为4个个阶段：培养液阶段：培养液(发酵液发酵液)的预处理和固的预处理和固液分离；初步纯化液分离；初步纯化(提取提取)；高度纯化；高度纯化(精制精制)；成品加工。；成品加工。v工艺过程的划分：工艺过程的划分：预处理和固液分离预处理和固液分离：目的是除去发酵液中的菌体细胞目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。和不溶性固体杂质。初步分离初步分离：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序
5、创造有利条件后道精制工序创造有利条件 高度纯化高度纯化：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。成品制作成品制作：成品形式由产品的最终用途决定。：成品形式由产品的最终用途决定。v选择下游加工工艺的原则选择下游加工工艺的原则：是胞内产物还是胞外产物是胞内产物还是胞外产物 原料中产物和主要杂质浓度原料中产物和主要杂质浓度 产物和主要杂质的物理化学特性及差异产物和主要杂质的物理化学特性及差异 产品用途和质量标准产品用途和质量标准 产品的市场价格产品的市场价格 废液的处理方法等废液的处理方法等 第一节第一节 发酵醪的预处理和菌体分离发酵醪的预处理和菌体分离目目
6、 的的v（1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率离固形物的速度，提高固液分离器的效率v（2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液体）（多数是液体）v（3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。操作。一、一、发酵液的预处理发酵液的预处理v采用理化方法设法增大虚浮液中固体粒子采用理化方法设法增大虚浮液中固体粒子的大小、或降低粘度，以利于过滤。的大小、或降低粘度，以利于过滤。v去除会影响后续提取的高价无机离子。去除会影响后续提取的高价无
7、机离子。v发酵醪预处理的要求发酵醪预处理的要求:v（1）菌体的分离）菌体的分离v（2）固体悬浮物的去除）固体悬浮物的去除v（3）蛋白质的去除）蛋白质的去除v（4）重金属离子的去除）重金属离子的去除v（5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除v（6）改变发酵醪的性质）改变发酵醪的性质v（7）调节适宜）调节适宜pH值和温度值和温度预处理的方法预处理的方法1，凝聚和絮凝技术凝聚和絮凝技术2，杂蛋白质的去除，杂蛋白质的去除3 3，高价无机离子的去除方法高价无机离子的去除方法（一）凝聚和絮凝技术（一）凝聚和絮凝技术v凝聚和絮凝能有效改变细胞、菌体和蛋白质凝聚和絮
8、凝能有效改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。v常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。胶体粒子的去除。v但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。个概念，其具体处理过程也是有差别的。v1、凝聚作用、凝聚作用 凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和凝聚是指在某
9、些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。过程。v凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷），理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷），因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。机盐类、金属氧化物类。v常用的无机盐类凝聚剂有：常用的无机盐类凝聚剂有：Al2（SO4）318H2O（明矾）、（明矾）、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3：
10、Al(OH)3、FeSO4、Ca(OH)2或石灰等。或石灰等。v2、絮凝作用、絮凝作用v絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。胶粒形成粗大的絮凝团的过程。v常用的絮凝剂常用的絮凝剂v聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠磷酸氢二钠v絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质速度的提高，还在于能有效地去
11、除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量提高了滤液质量影响絮凝的因素絮凝剂的添加量发酵液的pH絮凝剂的分子量搅拌转速搅拌时间絮凝剂加量对絮凝效果(滤速)的影响料液中，絮凝剂浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量反而会引起吸附饱和，在每个胶粒上形成覆盖层而使胶粒产生再次稳定现象。发酵液pH对阴离子聚丙烯酰胺絮凝效果的影响溶液pH的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，由于链节上相邻离子基团间的电排斥作用，而使分子链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。（二）杂蛋白质的去除方法（二）杂蛋白质的
12、去除方法v1等电点沉淀等电点沉淀蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去。蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去。v2变性沉淀变性沉淀 使蛋白质变性的方法有：加热、大幅度改变使蛋白质变性的方法有：加热、大幅度改变pH，加有机溶，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、加重金属离子如剂（丙酮、乙醇等）、加重金属离子如Ag、Cu2、Pb2 等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。过氯酸等及表面活性剂。v3.加各种蛋白质沉淀剂加各种蛋白质沉淀剂 加入某些化学试剂使蛋白质与之形成复合物沉淀加入某些化学试剂使蛋白质与之形成复合物沉淀v4吸附
13、吸附 在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。预处理的方法预处理的方法3，高价无机离子的去除方法，高价无机离子的去除方法v钙离子，可用草酸。钙离子，可用草酸。v镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提取。可用于环丝氨酸的提取。v铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁
14、士蓝沉淀。蓝沉淀。二、发酵液的固液分离二、发酵液的固液分离v微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。碎片以及残余的固体培养基成分。v固液分离是指将发酵液（或培养液）中的悬固液分离是指将发酵液（或培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去（一）影响过滤速度的因素（一）影响过滤速度的因素v1、发酵液中粒子的直径、发酵液中粒子的直径v2、发酵液黏度、发酵液黏度培养基的组成未用完培养基的数量消沫油发酵周期菌种对过滤速度影响
15、菌种对过滤速度影响v真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可达达10m，发酵液容易过滤，不需特殊处理。，发酵液容易过滤，不需特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过滤机过滤。故可采用鼓式真空过滤机过滤。v放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。如链霉素发酵液菌丝仅如链霉素发酵液菌丝仅0.51.0m左右，还含左右，还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。般需经预处理，以
16、凝固蛋白质等胶体。v细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因准，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难准，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。培养基的组成对过滤速度影响培养基的组成对过滤速度影响v用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难；过滤困难；v发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。基也会使过滤困难。发酵周期对过滤的影响发酵周期对过滤的影响v正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在正确
17、选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞自治后的菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞自治后的 分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发酵虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降低。最终造成成品质量降低。改善过滤性能的方法改善过滤性能的方法v等电点等电点v蛋白质变性蛋白质变性v吸附吸附v凝聚和絮凝凝聚和絮凝v加入助滤剂加入助滤剂v直接在发酵液中形成填充直接在发酵液中形成填充-凝固剂凝固剂v酶解作用酶解作用（二）固
18、（二）固液分离设备液分离设备v不同性状约发酵液应选择不同的固不同性状约发酵液应选择不同的固液分离液分离设备。常用于发酵液的分离设备有：设备。常用于发酵液的分离设备有：板框压滤机板框压滤机真空鼓式过滤机真空鼓式过滤机离心分离机离心分离机 v板框压滤机板框压滤机优点：优点：板框压滤机的过滤面积大；过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差；结构简单，价格低，动力消耗少等优点。缺点缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。v鼓式真空过滤机鼓式真空过滤机优点优点能连续操作，能实现自动化控制v缺点缺点压差较小，主要适用于霉菌发酵液的
19、过滤。v离心分离离心分离 v优点优点分离速度快，效率高，操作时卫生条件好等优点，适合于大规模的分离过程。v缺点缺点投资费用高，能耗较大。三、细胞的破碎与分离三、细胞的破碎与分离v微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等，如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。称为胞外产物。v还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化酶，碱还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等，称为胞内产物。性磷酸酯酶等，称为胞内产物。v对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获对于胞外产物只需直接将发酵
20、液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，v对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。分离。4，微生物细胞的破碎技术，微生物细胞的破碎技术v机械方法机械方法高压匀浆器 珠磨法撞击破碎法 超声波破碎 v非机械方法非机械方法 酶解渗透压冲击冻结和融化干燥法化学法高压匀浆器 采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂高压匀降的排出阀v
21、珠磨法珠磨法 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。解决。超声波法超声波法细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的
22、悬浮细胞上造成了剪切应滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。碎。对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果级差。级差。该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。撞击破碎法撞击破碎法一种改进的高压方法
23、是将浓缩的菌体悬一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至浮液冷却至-25C至至-30 C形成冰晶体，形成冰晶体，利用利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。的变形所引起的。该法的优点是适用的范围广，破碎率高，该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，率高，该法对冷冻该法对冷冻融解敏感的生化物质不适融解敏感的生化物质不适用。用。渗透压冲击是较温和的一种破
24、碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。v冻结-融化法v将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。v对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻
25、干燥适用于较不稳定的生化物质。干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。化学法用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。酶解法利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。自溶作用是
26、酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。破碎方法的选择破碎方法的选择v选择合适的破碎方法需要考虑下列因素：选择合适的破碎方法需要考虑下列因素：细胞的数量；细胞的数量；所需要的产物对破碎条件所需要的产物对破碎条件(温度、化学试温度、化学试剂、酶等剂、酶等)的敏感性；的敏感性；要达到的破碎程度及破碎所必要的速度，要达到的破碎程度及破碎所必要的速度，尽可能采用最温和的方法；尽可能采用最温和的方法；具有大规模应
27、用潜力的生化产品应选择具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。适合于放大的破碎技术。第二节第二节 发酵产物的提取发酵产物的提取v提取的目的是除去与目标产物理化性能有很提取的目的是除去与目标产物理化性能有很大差异的物质，使产物浓缩，并明显提高产大差异的物质，使产物浓缩，并明显提高产品的纯度，常用的方法有沉淀法、树脂法、品的纯度，常用的方法有沉淀法、树脂法、吸附法、蒸馏法、萃取法、膜分离技术和凝吸附法、蒸馏法、萃取法、膜分离技术和凝胶层析法等等。胶层析法等等。一、沉淀法一、沉淀法v沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法。由沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法。由于其浓缩作用常
28、大于纯化作用，因而沉淀法通常作于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。分离等方法进一步提高其纯度。v沉淀法由于成本低、收率高沉淀法由于成本低、收率高(不会使蛋白质等大分子不会使蛋白质等大分子失活失活)、浓缩倍数高和操作简单等优点，是下游加工、浓缩倍数高和操作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。过程中应用广泛的值得注意的方法。v根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：根据
29、所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：盐析法；盐析法；等电点沉淀法；等电点沉淀法；有机溶剂沉淀法；有机溶剂沉淀法；非离子型聚合物沉淀法；非离子型聚合物沉淀法；聚电解质沉淀法；聚电解质沉淀法；高价金属离子沉淀法。高价金属离子沉淀法。（一）盐析法（一）盐析法v在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。为盐析。v盐析法成本低，不需要特别昂贵的设备；操盐析法成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；不会引起蛋白质变性，经透作简单、安全；不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生
30、物活性的纯化蛋白析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。质。v但是效果不理想，通常只是作为初步的分离但是效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化。纯化，还需要结合其它的纯化。v盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；v盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；v盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水盐离子引
31、起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。分子的极化，使水活度降低。盐析的机理盐析的机理盐析机理示意图盐析机理示意图 2、影响蛋白质盐析效果的主要因素、影响蛋白质盐析效果的主要因素v1）盐析剂的选择）盐析剂的选择v2）盐析剂的加入量）盐析剂的加入量v3）温度和）温度和pHv4）操作方式）操作方式（二）等电点沉淀法（二）等电点沉淀法v两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础进同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础进行分离的方法既等电点沉淀法。行分离的方法既等电点沉淀法。v利用等电点法沉
32、淀蛋白时必须了解制备物对酸碱的利用等电点法沉淀蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整金属离子时，必须注意调整pH值。等电点法常与盐值。等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。以提高其沉淀能力。（三）有机溶剂沉淀法（三）有机溶剂沉淀法v利用蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解利用蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，
33、称有机溶剂沉淀法。度差异而分离的方法，称有机溶剂沉淀法。有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，导致蛋白质相互聚集沉坏蛋白质的水化膜，导致蛋白质相互聚集沉淀析出。淀析出。v有机溶剂沉淀法的优缺点有机溶剂沉淀法的优缺点v该法优点在于：该法优点在于：分辨能力比盐析法高，即分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；剂浓度下沉淀；
34、沉淀不用脱盐，过滤较为沉淀不用脱盐，过滤较为容易；容易；在生化制备中应用比盐析法广泛。在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作要求在低温下进行。总体来变性失活，操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。法普遍。v有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀法的影响因素v有机溶剂的选择首要条件是能和水混溶，使有机溶剂的选择首要条件是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和有
35、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲甲基基-2,4戊二醇等。使用的有机溶剂多为乙醇戊二醇等。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。蛋白质和酶的沉淀大多采用乙醇和丙酮。蛋白质和酶的沉淀大多采用乙醇,由由于甲醇、丙酮均有一定毒性于甲醇、丙酮均有一定毒性,故使用时必须谨故使用时必须谨慎慎v温度温度 低温可保持生物大分子活性，同时降低低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶解度，提高提取效率；其溶解度，提高提取效率；v样品浓度和样品浓度和pH 与盐析法中的作用基本相同；与盐析法中的作用基本相同；二、树脂法和吸附法二、树脂法和吸附法v树脂法和吸附法在生化物质的提取、浓缩、树脂法和吸附法在生化物质的提取、浓缩、纯
36、化、分离、脱盐、转化、中和及脱色等操纯化、分离、脱盐、转化、中和及脱色等操作单元上有着广泛的应用作单元上有着广泛的应用v（一）树脂法（一）树脂法v原理：利用树脂与产物结合，让产物保留在原理：利用树脂与产物结合，让产物保留在树脂上与杂质分开，再从树脂上洗脱产物树脂上与杂质分开，再从树脂上洗脱产物离子交换树脂法离子交换树脂法v离子交换作用：是指一离子交换作用：是指一个溶液中的某一种离子个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下把固体上的离子替
37、换下来。这里溶液称流动相，来。这里溶液称流动相，而固体称固定相。而固体称固定相。v蛋白质、氨基酸、核酸、蛋白质、氨基酸、核酸、酶、抗生素酶、抗生素。v该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，优点，离子交换树脂的基本概念离子交换树脂的基本概念v离子交换剂通常是一种不溶性高分子离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，它的分子中含有可解离的基化合物，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。的其它阳离子或阴
38、离子起交换作用。v阳离子型阳离子型 v阴离子型阴离子型v2、树脂的选择及其操作方法、树脂的选择及其操作方法v要恰当地选择离子交换剂，必须对被分离物的性质和所处溶液组分及酸碱度等因素进行全面分析。v取决于被分离的物质在其稳定的取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。选择阴离子交换剂。v一般分离蛋白质等大分子物质一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。基本操作 缓冲液的选择 层析柱的选择 洗脱流速加样 洗脱洗脱液的监测收集及组分鉴定 离子交换剂的清洗、再生和
39、保存 离子交换剂的处理 离子交换剂的选择v （二）吸附法（二）吸附法v在发酵工业的下游加工过程中，吸附法应用在发酵工业的下游加工过程中，吸附法应用于发酵产品的除杂、脱色、有毒物质和抗生于发酵产品的除杂、脱色、有毒物质和抗生素的提纯精制。素的提纯精制。吸附法的原理吸附法的原理v吸附法是利用吸附剂与杂质、色素物质、有吸附法是利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质、产品之间分子引力的差异，从而起毒物质、产品之间分子引力的差异，从而起到分离的作用。到分离的作用。吸附的目的吸附的目的v将产品吸附浓缩于吸附剂上；将产品吸附浓缩于吸附剂上；v将杂质、色素等需要从发酵液中去除的物质将杂质、色素等需要从发酵液中去
40、除的物质吸附于吸附剂上。吸附于吸附剂上。吸附法的优缺点吸附法的优缺点v优点：优点：可不用或少用有机溶剂；操作简便、安全、设备简单；生产过程中pH变化小，适用于稳定性较差的生化物质。v缺点：缺点：吸附法选择性差、收率不高。无机吸附剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大。炭粉等吸附剂影响环境卫生。v凝胶类吸附剂、大网格聚合物吸附剂凝胶类吸附剂、大网格聚合物吸附剂吸附的类型吸附的类型v物理吸附：吸附剂和吸附物通过分子力物理吸附：吸附剂和吸附物通过分子力(范德华力范德华力)产生的吸附。产生的吸附。v化学吸附：化学吸附：化学吸附是由于吸附剂在吸附物之间的化学吸附是由于吸附剂在吸附物之间的电子转移，发生化
41、学反应而产生的，属于库仑力电子转移，发生化学反应而产生的，属于库仑力 范范围。围。v交换吸附：交换吸附：吸附剂表面如为极性分子或离子所组成吸附剂表面如为极性分子或离子所组成则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层。则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层。这种吸附又称为极性吸附。这种吸附又称为极性吸附。吸附剂的基本要求吸附剂的基本要求v吸附剂要求颗粒密度小，表面积大，但孔隙吸附剂要求颗粒密度小，表面积大，但孔隙也不能太多，否则被吸附物质不易被洗脱。也不能太多，否则被吸附物质不易被洗脱。v吸附剂的颗粒大小要均匀。吸附剂的颗粒大小要均匀。v吸附剂的吸附能力要大，但不能影响洗脱。吸附剂的吸附
42、能力要大，但不能影响洗脱。吸附剂的种类吸附剂的种类v有机吸附剂（活性炭）有机吸附剂（活性炭）v无机吸附剂（硅胶、氧化铝）无机吸附剂（硅胶、氧化铝）v活性炭活性炭 是使用较多的一种非极性吸附剂。层析用的是使用较多的一种非极性吸附剂。层析用的活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。速太慢。v活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有
43、机溶剂则较强。例如以醇较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。增而洗脱力增加。v活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。v目前，多用于在纯化过程中进行脱色和脱臭等操作目前，多用于在纯化过程中进行脱色和脱臭等操作中的简单吸附过程中
44、的简单吸附过程 2.硅胶 是最常用的吸附剂，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性，经加热可被除去的水称自由水，若自由水含量达17%以上，则吸附力极低，此时，硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在105-110加热30min，吸附能力显著增强，这一过程称为活化。如果将硅胶加热到500，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。3.氧化铝 分酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(pH4-5)适
45、合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化合物。氧化铝用前也需脱水活化，通常于400高温下加热6h，使氧化铝的含水量在0%-3%之间，可得到级或级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化铝的内部结构。4.大孔吸附树脂和聚酰胺近年用于中药活性成分的分离。三、萃取三、萃取v溶剂萃取法是溶剂萃取法是20世纪世纪40年代兴起的一项化工年代兴起的一项化工分离技术，它是用一种溶剂将产物自另一种分离技术，它是用一种溶剂将产物自另一种溶剂溶剂(如水如水)中提取出来，达到浓缩和提纯的中提取出来，达到浓缩和提纯
46、的目的。目的。v溶剂萃取法比化学沉淀法分离程度高，比离溶剂萃取法比化学沉淀法分离程度高，比离子交换法选择性好，传质快，比蒸馏法能耗子交换法选择性好，传质快，比蒸馏法能耗低且生产能力大，周期短，便于连续操作、低且生产能力大，周期短，便于连续操作、容易实现自动化等。容易实现自动化等。（一）萃取的基本概念（一）萃取的基本概念v1、萃取：利用物质在两种成相的溶剂中溶解、萃取：利用物质在两种成相的溶剂中溶解度的不同，使所需的目的物质从一种溶剂中度的不同，使所需的目的物质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中，从而达到分离纯化的转移到另一种溶剂中，从而达到分离纯化的目的。目的。v溶剂萃取法是以分配定律为基础的。溶
47、剂萃取法是以分配定律为基础的。v在萃取中，被提取的溶液称为料液，其中欲在萃取中，被提取的溶液称为料液，其中欲提取的物质称为溶质。提取的物质称为溶质。v2、反萃取、反萃取 v蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层活性剂层,同邻近的蛋白质分子发生静电吸同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形引而变形,接着两界面形成含有蛋白质的反接着两界面形成含有蛋白质的反胶团胶团,然后扩散到有机相中然后扩散到有机相中,从而实现了蛋从而实现了蛋白质的萃取。改变水相条件白质的萃取。改变水相条件(如如pH值、离
48、子值、离子种类或离子强度种类或离子强度),又可使蛋白质从有机相又可使蛋白质从有机相中返回到水相中中返回到水相中,实现反萃取过程。实现反萃取过程。v3、物理萃取和化学萃取、物理萃取和化学萃取（二）乳化和破乳化（二）乳化和破乳化v乳化：乳化：液体分散在另一不相溶的液体中的分散液体分散在另一不相溶的液体中的分散体系体系v乳浊液的形式：乳浊液的形式：水包油、油包水水包油、油包水v常用的去乳化的方法：常用的去乳化的方法：过滤和离心、加热、稀过滤和离心、加热、稀释法、加电解质、吸附法、顶替法、转型法释法、加电解质、吸附法、顶替法、转型法（三）常用去乳剂（三）常用去乳剂v阳离子表面活性剂（溴代十五烷基吡啶）
49、阳离子表面活性剂（溴代十五烷基吡啶）阴离子表面活性剂（十二烷基硫酸钠）阴离子表面活性剂（十二烷基硫酸钠）v（四）萃取方式（四）萃取方式混合器溶剂发酵液分离器提取液残余液v多次提炼法多次提炼法混合器溶剂发酵液分离器提取液混合器溶剂分离器提取液混合器分离器提取液残余液溶剂残余液残余液v多级对流萃取多级对流萃取第一混合器分离器第二混合器分离器第三混合器分离器最后提取液提取液残余液残余液最后残余液提取液溶剂发酵液一级二级三级A 90%A 70%A 50%四、蒸馏分离提取法四、蒸馏分离提取法v蒸馏是分离液体混合物的一种有效方法蒸馏是分离液体混合物的一种有效方法v常用的蒸馏方法：简单蒸馏、精馏和特殊精常用
50、的蒸馏方法：简单蒸馏、精馏和特殊精馏馏v操作方式：间歇式、连续式操作方式：间歇式、连续式v压力：常压蒸馏、加压蒸馏、真空蒸馏压力：常压蒸馏、加压蒸馏、真空蒸馏酒精蒸馏酒精蒸馏v选择蒸馏流程依据：选择蒸馏流程依据：v1）生产原料和成熟醪特性、）生产原料和成熟醪特性、v2）产品质量的实际要求）产品质量的实际要求v3）节约蒸汽）节约蒸汽v4）节约用水）节约用水五、凝胶层析五、凝胶层析常出现多种名称：如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。凝胶层析的定义：凝胶层析的定义：凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。凝胶层析的应用范围
