1、第二章第二章 菌种选育菌种选育主讲：李昌灵主讲：李昌灵放线菌（链霉素四放线菌（链霉素四环素；红霉素等）环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌一些产芽孢的细菌植物或动物来源植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：第一节第一节 菌种的来源菌种的来源二、氨基酸生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵代谢控制发酵：用用人工诱变的方法人工诱变的方法，有意识地改，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种
2、发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。发酵中得到成功应用。50,6050,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。物才具有大量表达的潜力。礼来礼来(Eli lilly(Eli
3、lilly),),花了花了1010年年的时间从的时间从4040万株万株微生微生物中，发现了物中，发现了三种三种有潜力的新抗生素有潜力的新抗生素。例：例：已工业化产品生产菌的介绍第二节第二节 自然界中有目的微生物分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程土样的采取土样的采取 预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题：自然界中有目的微生物
4、分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则二、采样时要注意的问题l 气候、水分、空气气候、水分、空气l 来源要广来源要广l 结合产品的特点结合产品的特点l 标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等富集的三种方案：富集的三种方案：l 定向培养定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。l 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，类学中考虑，l
5、不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法时只能通过随机分离的办法定向培养的富集方法定向培养的富集方法1 1、底物、底物2 2、pHpH条件条件3 3、培养时间、培养时间4 4、培养温度、培养温度等一切能提高目的微生物相对生等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。在种群中占优势。四、菌落的选出四、菌落的选出q 从产物角度出发从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单
6、、快速的鉴定方法，如抗生素（利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35P35）q 从形态的角度从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。液性的菌落外观上就可以初步识别。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0
7、.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型例：例：醛肟水解酶的筛选醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002),65-72培养基中含培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，不断分析样品，2-3个月后个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落降低后，稀释分离条菌落抗抗生生素素产产
8、生生菌菌的的筛筛选选过过程程（一）样品的采集（一）样品的采集 土壤的营养：土壤的营养：有机氮多有机氮多-放线菌、细菌放线菌、细菌 有机氮少、酸性有机氮少、酸性-真菌真菌 土壤深度：土壤深度：放线菌和细菌放线菌和细菌-0-1m-0-1m（80%80%在在0-10cm 0-10cm）真菌真菌-0-0.3m-0-0.3m 未开垦过的土壤最佳未开垦过的土壤最佳 南方地区土壤中的放线菌种类比北方多南方地区土壤中的放线菌种类比北方多 采样季节一春秋天为宜采样季节一春秋天为宜三、微生物的分离三、微生物的分离、放线菌、放线菌2.1 概念概念在形态上具有分枝状菌丝、菌落形态与霉菌相似，以孢子进行繁殖。在形态上具
9、有分枝状菌丝、菌落形态与霉菌相似，以孢子进行繁殖。“介于细菌与丝状真菌之间介于细菌与丝状真菌之间又接近细菌的一类丝状原核又接近细菌的一类丝状原核生物生物”近代生物学技术近代生物学技术放线菌实际上是属于细菌放线菌实际上是属于细菌范畴内的原核微生物，只范畴内的原核微生物，只不过其细胞形态为分枝状不过其细胞形态为分枝状菌丝。菌丝。放线菌是具有菌丝、以孢子进行繁殖、革兰氏染色阳性的一类原核微生物，属于真细菌范畴。2.2 2.2 形态与结构形态与结构t单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成；单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成；t菌丝直径与杆菌类似，约菌丝直径与杆菌类似，约1 1m mm m；t细胞壁组成与细菌类
10、似，革兰氏染色阳性（少数阴性）；细胞壁组成与细菌类似，革兰氏染色阳性（少数阴性）；t细胞的结构与细菌基本相同，细胞的结构与细菌基本相同，按形态和功能可分为营养、气生和孢子丝三种。按形态和功能可分为营养、气生和孢子丝三种。（1）营养菌丝匍匐生长于培养基内，吸收营匍匐生长于培养基内，吸收营养，也称基内菌丝。一般无隔养，也称基内菌丝。一般无隔膜，直径膜，直径0.2-0.80.2-0.8 m m，长度差别，长度差别很大，有的可产生色素。很大，有的可产生色素。（2 2）气生菌丝）气生菌丝营养菌丝发育到一定阶段，伸向空间形成气生菌丝，叠生于营养营养菌丝发育到一定阶段，伸向空间形成气生菌丝，叠生于营养菌丝上
11、，可覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下观察，颜色较深菌丝上，可覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下观察，颜色较深，直径较粗（，直径较粗（1-1.41-1.4m m），有的产色素。），有的产色素。（3 3）孢子丝）孢子丝气生菌丝发育到一定阶段，其上可分化出形成孢子的菌丝，即孢气生菌丝发育到一定阶段，其上可分化出形成孢子的菌丝，即孢子丝，又称产孢丝或繁殖菌丝。其形状和排列方式因种而异，常子丝，又称产孢丝或繁殖菌丝。其形状和排列方式因种而异，常被作为对放线菌进行分类的依据。被作为对放线菌进行分类的依据。（二）放线菌的分离（二）放线菌的分离1 1 样品分离前的处理样品分离前的处理除去或减少不需要微生物，增加
12、所需要放线菌的数量。除去或减少不需要微生物，增加所需要放线菌的数量。（1 1）化学方法）化学方法 SDS-SDS-酵母浸膏处理样品，可以使细菌数量明显减少，酵母浸膏处理样品，可以使细菌数量明显减少，HVHV平板上平板上55%95%55%95%都是放线菌。都是放线菌。风干的土壤与风干的土壤与CaCOCaCO3 3混合后培养，放线菌的数量可以增混合后培养，放线菌的数量可以增加加100100倍。风干的土壤减少了细菌的数量；倍。风干的土壤减少了细菌的数量；CaCOCaCO3 3有利有利于放线菌的生长，抑制了大多数真菌的生长。于放线菌的生长，抑制了大多数真菌的生长。0.01M NaOH0.01M NaO
13、H处理土壤，分离小单孢菌，处理土壤，分离小单孢菌，1M NaOH1M NaOH处理处理土壤可以分离到诺卡氏菌和小单孢菌。土壤可以分离到诺卡氏菌和小单孢菌。其他试剂：其他试剂：1.4%1.4%酚、乙酸乙酯可以使细菌和真菌数量酚、乙酸乙酯可以使细菌和真菌数量明显减少，有利于分离放线菌。明显减少，有利于分离放线菌。（2 2）物理方法）物理方法 温度：温度：根据各种微生物耐热程度的不同，用根据各种微生物耐热程度的不同，用高温处理样品，可以分离到不同种类的放线高温处理样品，可以分离到不同种类的放线菌。菌。离心：离心：根据微生物大小对样品进行离心分离。根据微生物大小对样品进行离心分离。如如1600g160
14、0g离心离心20min20min，上清液中主要是放线菌，上清液中主要是放线菌孢子，沉淀中含有细菌和真菌孢子。孢子，沉淀中含有细菌和真菌孢子。膜过滤：膜过滤：用孔径为用孔径为0.45m0.45m的滤膜可以浓缩的滤膜可以浓缩水中的微生物，过滤后把滤膜贴在平板培养水中的微生物，过滤后把滤膜贴在平板培养基上培养。这种方法用来分离水中的小单孢基上培养。这种方法用来分离水中的小单孢菌和高温放线菌。菌和高温放线菌。2 2 分离方法分离方法（1）培养基 分离放线菌多采用合成培养基（精分离放线菌多采用合成培养基（精氨酸培养基、高氏一号培养基、察氏培氨酸培养基、高氏一号培养基、察氏培养基）和有机培养基（如养基）和
15、有机培养基（如WaksmanWaksman培养基培养基和和BennettBennett培养基培养基）（2）抗生素的加入 培养基中加入抗真菌抗生素和抗细培养基中加入抗真菌抗生素和抗细菌抗生素，可以抑制真菌和细菌的生长，菌抗生素，可以抑制真菌和细菌的生长，对放线菌进行浓缩。对放线菌进行浓缩。（3 3）分离放线菌的方法）分离放线菌的方法 稀释法：稀释法：无菌水稀释样品，然后涂布平板。无菌水稀释样品，然后涂布平板。喷土法：喷土法：用喷土机或其他方法把风干碾细的土用喷土机或其他方法把风干碾细的土样直接喷在分离平板上。样直接喷在分离平板上。滤膜法：滤膜法：将将0.22-0.45 m0.22-0.45 m的
16、滤膜放在分离培的滤膜放在分离培养基的平板上，接种培养，放线菌菌丝可以穿养基的平板上，接种培养，放线菌菌丝可以穿过滤膜长到培养基中，而细菌在滤膜表面生长，过滤膜长到培养基中，而细菌在滤膜表面生长，去掉滤膜，培养基中的放线菌菌丝继续培养长去掉滤膜，培养基中的放线菌菌丝继续培养长出菌落。出菌落。（4 4）培养温度：）培养温度：一般一般25-3025-30度，或者度，或者32-3732-37度，度，培养培养7-147-14天；高温放线菌需要天；高温放线菌需要45-5045-50度培养度培养1-21-2天，海水中分离放线菌用天，海水中分离放线菌用2020度培养度培养6 6周左右。周左右。产纤维素酶放线菌
17、的分离与筛选产纤维素酶放线菌的分离与筛选 纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，主要由外切是一种复合酶，主要由外切-葡聚糖酶、内葡聚糖酶、内切切-葡聚糖酶（又称葡聚糖酶（又称CMCase）和）和-葡萄糖苷酶等组葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。成，还有很高活力的木聚糖酶活力。采集土样采集土样 朽木、烂稻草、烂稻草表层朽木、烂稻草、烂稻草表层土、锯木、锯木表层土、落叶表土、锯木、锯木表层土、落叶表层土。层土。选择性培养基（改良查氏培养选择性培养基（改良查氏培养基）：基）：CMC-Na 15 g、NaNO3 2 g、NaCl 2 g、MgSO4 0.5 g、FeSO4 0.1 g、刚果红、刚果
18、红 0.2 g、琼、琼脂脂20 g、蒸馏水、蒸馏水 1000 mL、pH自然；自然；（三）其他微生物的分离（三）其他微生物的分离1 真菌的分离 用PDA培养基、Martin培养基、察氏培养基等，pH5.5-6.5，24-28度培养5-14天，在培养基中加入抗细菌类抗生素抑制细菌的生长。2 细菌的分离 采用牛肉膏蛋白胨培养基等，pH7.2-7.6，温度28-37度培养1-7天，培养基中加入一定量的抗真菌抗生素抑制真菌的生长。3 海洋微生物的分离 根据微生物在海洋中的生存环境设计分离方法、分离培养基和培养条件。一般海深100米内分离出链霉菌，1000米左右分离的大多数是小单孢菌，3000-5000
19、米范围内没有分离出放线菌。4 极端微生物的分离 根据极端微生物的生长繁殖条件，如高温、低温、高盐、高碱、高压，来设计分离和培养条件。产青蒿素内生菌的分离与筛选目前使用青篙素进行治疗每个疗程的费用是目前使用青篙素进行治疗每个疗程的费用是8美元到美元到10美元，对这些地区的贫困患者来说过美元，对这些地区的贫困患者来说过于昂贵，主要瓶颈在于青篙的收获量不足。于昂贵，主要瓶颈在于青篙的收获量不足。采集青蒿植株，分别取根、茎和叶的小块，约采集青蒿植株，分别取根、茎和叶的小块，约0.15cm0.15cm大小，大小，75%酒精漂洗酒精漂洗(2030s)无菌水冲洗无菌水冲洗0.2%升汞漂洗升汞漂洗(1020s
20、)无菌水冲洗数次或直接取内层无污样，分置于无菌水冲洗数次或直接取内层无污样，分置于PDA、牛肉膏蛋白胨和高氏一号脂培养基平板，牛肉膏蛋白胨和高氏一号脂培养基平板，2530下避光培养。下避光培养。培养培养520d，分别待平板上长出菌落，用划线、稀释以及直接用，分别待平板上长出菌落，用划线、稀释以及直接用无菌小剪刀取尖端菌丝等分离方法，经过分离、筛选、纯化的无菌小剪刀取尖端菌丝等分离方法，经过分离、筛选、纯化的反复过程，直至得到纯化的具有产抗疟疾药物青蒿素或其结构反复过程，直至得到纯化的具有产抗疟疾药物青蒿素或其结构类似物的内生菌菌株。类似物的内生菌菌株。四、抗生素的初筛发酵和抗菌活性的测定四、抗
21、生素的初筛发酵和抗菌活性的测定（一）抗生素的初筛发酵（一）抗生素的初筛发酵1 1培养基培养基2 2 培养条件培养条件固体平板发酵：固体平板发酵：便于大量筛选抗生素产生菌便于大量筛选抗生素产生菌液体振荡培养：液体振荡培养：溶氧较好，有利于放线菌的生溶氧较好，有利于放线菌的生长和抗生素合成。长和抗生素合成。（二）抗菌活性的测定（二）抗菌活性的测定 初筛发酵液样品有全发酵液、上清液和菌丝提取初筛发酵液样品有全发酵液、上清液和菌丝提取液液3 3种用于测定抗菌活性。种用于测定抗菌活性。抗菌活性的测定方法有以下三种：抗菌活性的测定方法有以下三种：杯碟法或者纸片法：杯碟法或者纸片法：将发酵液样品加到鉴定平板
22、上将发酵液样品加到鉴定平板上的小杯中，或将纸片浸入发酵液样品中，取出后放的小杯中，或将纸片浸入发酵液样品中，取出后放在鉴定平板上，在鉴定平板上，3737度培养度培养1 1天，测量抑菌圈直径的天，测量抑菌圈直径的大小。大小。琼脂块法：琼脂块法：将固体发酵平板上用打孔器打成的圆块将固体发酵平板上用打孔器打成的圆块转移到长好的试验菌的平板上，在转移到长好的试验菌的平板上，在3737度培养度培养1 1天，天，测量抑菌圈直径的大小。测量抑菌圈直径的大小。平板划线法：平板划线法：先将放线菌在先将放线菌在平板上划线培养，培养平板上划线培养，培养5 5天后天后再把试验菌在放线菌的两侧垂再把试验菌在放线菌的两侧
23、垂直划线，直划线，3737度培养度培养1 1天，观察天，观察放线菌两侧试验菌被抑制的长放线菌两侧试验菌被抑制的长度。度。五、抗生素的早期鉴别五、抗生素的早期鉴别 1 1 纸层析和纸电泳：纸层析和纸电泳：根据抗生素样品在纸上的迁移率，鉴别根据抗生素样品在纸上的迁移率，鉴别已知抗生素和发现新的抗生素。已知抗生素和发现新的抗生素。2 2 颜色反应：颜色反应：有的抗生素层析之后与显色剂反应，表现出特有的抗生素层析之后与显色剂反应，表现出特有的颜色反应。有的颜色反应。3 3 紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：4 4 抗菌谱抗菌谱抗 生 素 茚 三 酮 坂 口 反 应 紫 霉 素 卡 那 霉 素、新 霉 素、巴
24、 龙 霉 素 链 霉 素 类 六、抗细菌药物的筛选模型和方法六、抗细菌药物的筛选模型和方法（一）以试验菌为对象的筛选方法（常规方法）（一）以试验菌为对象的筛选方法（常规方法）利用很多种微生物作为鉴定菌的琼脂扩散法是一种利用很多种微生物作为鉴定菌的琼脂扩散法是一种经典的筛选方法。目前主要筛选耐药细菌和厌氧菌。经典的筛选方法。目前主要筛选耐药细菌和厌氧菌。1 1 抗生素耐药突变株的使用抗生素耐药突变株的使用2 2 超敏菌株的使用：超敏菌株的使用：用传统的琼脂扩散法直接检测发酵液用传统的琼脂扩散法直接检测发酵液中所存在的少量抗生素，获得新的抗生素的可能性较大中所存在的少量抗生素，获得新的抗生素的可能
25、性较大3 3 利用厌氧菌作为试验株利用厌氧菌作为试验株 双层琼脂平板法，拟杆菌属、双层琼脂平板法，拟杆菌属、梭杆菌属等厌氧菌，治疗厌氧致病菌。梭杆菌属等厌氧菌，治疗厌氧致病菌。（二）以作用机理为依据的筛选方法（定靶筛选）（二）以作用机理为依据的筛选方法（定靶筛选）1 1 细菌细胞壁合成抑制剂的筛选细菌细胞壁合成抑制剂的筛选 作用于细胞壁的抗生素对人体细胞没有毒害作用，作用于细胞壁的抗生素对人体细胞没有毒害作用，有较好的选择性毒性。有较好的选择性毒性。（1 1）观察细胞形态变异）观察细胞形态变异 细菌尤其是细菌尤其是G+G+发生各种形态变化，例如细菌变长、发生各种形态变化，例如细菌变长、部分突起
26、、形成原生质球等，表明待测样品中含有部分突起、形成原生质球等，表明待测样品中含有抑制细胞壁合成的物质。抑制细胞壁合成的物质。（2 2）支原体模型）支原体模型 支原体没有细胞壁，所以对抑制细胞壁合成的抗支原体没有细胞壁，所以对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。生素不敏感。（3 3）D-D-丙氨酸二肽丙氨酸二肽合成抑制剂的筛选合成抑制剂的筛选 当当D-D-丙氨酸二肽丙氨酸二肽的合成被待测样品抑的合成被待测样品抑制时，加入大量的制时，加入大量的D-D-丙氨酸或丙氨酸或D-D-丙氨酸丙氨酸-D-D-丙氨酸可以使二肽丙氨酸可以使二肽合成反应继续进行，合成反应继续进行，细菌继续生长繁殖，细菌继续生长繁殖，待测
27、样品的抗菌活性待测样品的抗菌活性被抵消，从而筛选出被抵消，从而筛选出了了环丝氨酸。环丝氨酸。青霉素作用点青霉素作用点溶菌酶作用点溶菌酶作用点N-N-乙酰葡糖乙酰葡糖胺胺N-N-乙酰胞壁乙酰胞壁酸酸（4 4）羧肽酶抑制剂的筛选）羧肽酶抑制剂的筛选 -内酰胺类抗生素作用于细菌黏肽合内酰胺类抗生素作用于细菌黏肽合成的最后步骤成的最后步骤-交联反应。短肽交联是交联反应。短肽交联是由转肽酶催化的，同时伴随有末端由转肽酶催化的，同时伴随有末端D-D-丙氨丙氨酸的释放。另外酸的释放。另外D-D-丙氨酸也可以在丙氨酸也可以在DD-DD-羧羧肽酶的作用下去除，该酶的活性可以通过肽酶的作用下去除，该酶的活性可以通
28、过二乙酰基二乙酰基-L-L-赖氨酸赖氨酸-D-D-丙氨酸丙氨酸-D-D-丙氨酸丙氨酸作为底物，检测释放的作为底物，检测释放的D-D-丙氨酸来定量分丙氨酸来定量分析。析。2 2 细菌蛋白质合成抑制剂的筛选细菌蛋白质合成抑制剂的筛选 在各种真细菌细胞的蛋白质合成中，延伸因在各种真细菌细胞的蛋白质合成中，延伸因子子TuTu是必不可少，但是它与哺乳动物细胞中功能是必不可少，但是它与哺乳动物细胞中功能相似的因子显著不同，因而与延伸因子相似的因子显著不同，因而与延伸因子TuTu结合的结合的抗生素可以抑制许多细菌的生长。抗生素可以抑制许多细菌的生长。4 4 细菌细菌DNADNA回旋酶抑制剂的筛选回旋酶抑制剂
29、的筛选 DNA回旋酶是细菌维持DNA超螺旋状态的一种特有的酶，可以将松弛DNA转变为负超螺旋DNA。回旋酶抑制剂的筛选方法：从E.coli中提取DNA回旋酶，将松弛DNA转变为负超螺旋DNA，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，测定待测样品对回旋酶的抑制作用。（三）以耐药机制为依据的筛选模型（三）以耐药机制为依据的筛选模型细菌的四种耐药机制细菌的四种耐药机制 细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶，水解惑修细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶，水解惑修饰进入细菌细胞内的抗生素，使之失去生物活性；饰进入细菌细胞内的抗生素，使之失去生物活性；抗生素的作用靶点由于发生突变或者被细菌的某抗生素的作用靶点由于发生突变或者被
30、细菌的某种酶修饰而使抗生素无法发挥作用，或者亲和力下种酶修饰而使抗生素无法发挥作用，或者亲和力下降；降；细菌细胞膜的透性或者其他性质发生改变；细菌细胞膜的透性或者其他性质发生改变；细菌有一种依赖能量的主动转运机制，能够把进细菌有一种依赖能量的主动转运机制，能够把进入细胞的抗生素排出体外。入细胞的抗生素排出体外。1-1-内酰胺酶抑制剂的筛选内酰胺酶抑制剂的筛选-内酰胺酶（青霉素酶和头孢菌素酶）水解内酰胺酶（青霉素酶和头孢菌素酶）水解-内酰胺抗生素，比如青霉素和头孢菌素，内酰胺抗生素，比如青霉素和头孢菌素，打开打开-内酰胺键，使抗生素丧失抗菌活性。内酰胺键，使抗生素丧失抗菌活性。（1 1）耐药菌株
31、平板法）耐药菌株平板法 用产生青霉素酶菌株的发酵液与待测样品（如放用产生青霉素酶菌株的发酵液与待测样品（如放线菌发酵液）混合，加入一定量的青霉素，不含线菌发酵液）混合，加入一定量的青霉素，不含待测样品的平板作为对照，用纸片法测定发应混待测样品的平板作为对照，用纸片法测定发应混合物中残留的青霉素来检测酶抑制剂的活性。合物中残留的青霉素来检测酶抑制剂的活性。（2 2）通过颜色反应来检测）通过颜色反应来检测-内酰胺酶抑制剂内酰胺酶抑制剂 利用产色的头孢菌素利用产色的头孢菌素nitrocefinnitrocefin的独特性质来寻的独特性质来寻找找-内酰胺酶抑制剂。内酰胺酶抑制剂。在在-内酰胺酶的作用下
32、，内酰胺酶的作用下，-内酰胺环的酰胺键被打开，由黄色变成红色，内酰胺环的酰胺键被打开，由黄色变成红色，因而从颜色的变化可以判断样品中是否含有酶抑因而从颜色的变化可以判断样品中是否含有酶抑制剂。制剂。2 2 氨基环醇类抗生素钝化酶抑制剂的筛选氨基环醇类抗生素钝化酶抑制剂的筛选由三种不同类型的钝化酶：由三种不同类型的钝化酶：氨基环醇类抗生素磷酸化酶（氨基环醇类抗生素磷酸化酶（APHAPH）将抗生素进行磷酸化，使其失去活性将抗生素进行磷酸化，使其失去活性 氨基环醇类抗生素乙酰转移酶（氨基环醇类抗生素乙酰转移酶（AACAAC）将乙酰辅酶将乙酰辅酶A A的乙酰基转移到抗生素的氨基上，的乙酰基转移到抗生素
33、的氨基上，使其失去活性使其失去活性 氨基环醇类抗生素核苷转移酶（氨基环醇类抗生素核苷转移酶（AADAAD）将将ATPATP的核苷转移到抗生素的羟基上，使其失去的核苷转移到抗生素的羟基上，使其失去活性活性3 3 氯霉素乙酰转移酶抑制剂的筛选氯霉素乙酰转移酶抑制剂的筛选 细菌耐氯霉素是因为耐药菌产生氯霉素乙细菌耐氯霉素是因为耐药菌产生氯霉素乙酰转移酶，使得氯霉素分子上羟基乙酰化。酰转移酶，使得氯霉素分子上羟基乙酰化。方法：方法：样品样品+氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶混合反应混合反应 加入氯霉素加入氯霉素混合反应混合反应用枯草杆菌测定用枯草杆菌测定氯霉素的残留活性。以没有样品抑制剂作氯霉素的残留
34、活性。以没有样品抑制剂作为对照。为对照。一、用试验菌直接筛选一、用试验菌直接筛选酵母类：酵母类：白色假丝酵母、普通假丝酵母、啤白色假丝酵母、普通假丝酵母、啤酒酵母等酒酵母等丝状真菌类：丝状真菌类：产黄青霉、黑曲霉、烟曲霉、产黄青霉、黑曲霉、烟曲霉、米曲霉等米曲霉等七、抗真菌抗生素的筛选模型七、抗真菌抗生素的筛选模型二、作用于真菌细胞壁抗生素的筛选二、作用于真菌细胞壁抗生素的筛选真菌和动物细胞的区别：真菌和动物细胞的区别：细胞壁及其成分：几丁质、细胞壁及其成分：几丁质、-1-1，3-3-葡聚葡聚糖和甘露聚糖糖和甘露聚糖1 1 观察真菌细胞的形态变异：观察真菌细胞的形态变异：假原生质球假原生质球2
35、 2真菌细胞壁多糖合成酶抑制剂的筛选真菌细胞壁多糖合成酶抑制剂的筛选-1-1，3-3-葡聚糖合成酶抑制剂葡聚糖合成酶抑制剂方法：方法：-1-1，3-3-葡聚糖合成酶、待测样品、葡聚糖合成酶、待测样品、UDP-UDP-1414C-C-葡萄糖，缓冲液中反应后用纸葡萄糖，缓冲液中反应后用纸层析法和放射性同位素测定样品抑制剂的层析法和放射性同位素测定样品抑制剂的作用。作用。甘露聚糖合成酶抑制剂甘露聚糖合成酶抑制剂方法：方法：甘露聚糖合成酶、待测样品、甘露聚糖合成酶、待测样品、GDP-GDP-1414C-C-甘露糖，缓冲液中反应后用纸层析甘露糖，缓冲液中反应后用纸层析法和放射性同位素测定样品抑制剂的作用
36、。法和放射性同位素测定样品抑制剂的作用。几丁质合成酶抑制剂几丁质合成酶抑制剂方法：方法：几丁质合成酶、待测样品、几丁质合成酶、待测样品、UDP-UDP-1414C-N-C-N-乙酰葡萄糖胺，缓冲液中反应后乙酰葡萄糖胺，缓冲液中反应后用纸层析法和放射性同位素测定样品抑制用纸层析法和放射性同位素测定样品抑制剂的作用。剂的作用。一、微生物的特性q 有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长第三节第三节 菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造二：工业化菌种的要求l
37、 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物效地合成产物l 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强改造的可操作性要强l 遗传性能要相对稳定遗传性能要相对稳定l 不易感染它种微生物或噬菌体不易感染它种微生物或噬菌体l 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）好与致病菌无关）l 生产特性要符合工艺要求生产特性要符合工艺要求菌株改良的作用：菌株改良的作用：自然界筛选到的菌株，合成抗生素的能力很低，如果不进行菌种改良，则没有进行工
38、业生产的价值。生产上正在用的菌株，为了不断提高提高产量、降低成本，也需要不断进行菌株改良。改变菌种的某些遗传特性，使之适合于工业生产，例如选育抗噬菌体的菌株、能利用廉价原料或需要氧气少的菌株、不分泌色素的菌株便于后提取中产品的质量。生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 不会有代谢产物的积累不会有代谢产物的积累 解除或突破微生物的代谢调节控制解除或突破微生物的代谢调节控制 目的产物积累目的产物积累微生物育种的目的微生物育种的目的方法：方法：突变、体内重组、体突变、体内重组、体外重组（基因工程）外重组（基因工程）工业微生物育种工业微生物育种 菌株选育
39、、分子改造菌株选育、分子改造目的目的l 提高生产能力提高生产能力l 提高产品质量提高产品质量l 开发新产品开发新产品l 解决生产实际问题解决生产实际问题l 防止菌种退化防止菌种退化发酵工业的发展的决定因素：发酵工业的发展的决定因素：工艺的改进工艺的改进设备的改进设备的改进优良菌种的获得（关键）优良菌种的获得（关键）基因突变：基因突变：自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组：基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化基因的直接进化：点突变、易错点突变、易错PCRPCR、同序法、同序法DNA ShufflingDNA Shuffling等等 菌株选育、分
40、子改造的方法：菌株选育、分子改造的方法：一、自然选育（一、自然选育（Nature breedingNature breeding）自然选育：自然选育：是指微生物细胞群体是指微生物细胞群体不通过人工处理不通过人工处理而利用菌种的而利用菌种的自发突变自发突变进行的育种方法。但是微进行的育种方法。但是微生物自发突变的几率生物自发突变的几率1010-8-8-10-10-9-9，正突变的几率更，正突变的几率更低，所以这种方法虽然可能筛选到一些生产能力低，所以这种方法虽然可能筛选到一些生产能力高的菌株，但效率低、进展慢，效果不明显。高的菌株，但效率低、进展慢，效果不明显。二、诱变育种二、诱变育种(Muta
41、tion breeding)(Mutation breeding)诱变育种：诱变育种：用不同的用不同的诱变剂诱变剂处理微生物群体，以处理微生物群体，以诱发各种诱发各种遗传物质的改变遗传物质的改变，然后采用简便、快速，然后采用简便、快速和高效的筛选方法从中选出所需要的突变株。和高效的筛选方法从中选出所需要的突变株。这种方法在工业微生物育种中用的最早、也这种方法在工业微生物育种中用的最早、也很有效，是目前育种的常用方法。很有效，是目前育种的常用方法。用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种筛选，称为诱变育种诱变剂：诱变剂：能够提高生
42、物体突变频率的物质称为诱变剂能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂诱变剂物理：物理：紫外，快中子、紫外，快中子、X X射线等射线等化学：化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍等硫酸二乙酯，亚硝基胍等（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂的选择诱变剂的选择出发菌株的选择出发菌株的选择（一）、诱变剂的作用原理（略）（一）、诱变剂的作用原理（略）亚硝酸：亚硝酸：0.07MNa0.07MNa2 2HPOHPO4 4亚硝基胍亚硝基胍：1MNaOH1MNaOH（三）诱变育种的一般步骤（三
43、）诱变育种的一般步骤(p38)（四）筛选的方法（四）筛选的方法q 随机筛选随机筛选q 形态形态q 理性化筛选理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。生的这些特性，称为遗传标记。结构类似物结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为谢中间物（终产物）的功能，但
44、细胞不能以其作为自身的营养物质。自身的营养物质。突变菌株的筛选突变菌株的筛选待菌落代谢产物待菌落代谢产物活性最高或者菌活性最高或者菌落长到合适大小落长到合适大小时，转移到指示时，转移到指示菌平板上，根据菌平板上，根据抑菌圈大小挑选抑菌圈大小挑选高产菌株进行摇高产菌株进行摇瓶发酵复筛。瓶发酵复筛。1 1、高产突变株的筛选、高产突变株的筛选 HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶结构类似物抗性结构类似物抗性：Lys的类似物的类似物AEC、Thr的类似物的类似物AHV营养
45、缺陷型营养缺陷型：如如Thr缺陷型缺陷型黄色短杆菌黄色短杆菌F9-50F9-50的诱变谱系的诱变谱系 Bervibacterium flavumBervibacterium flavum As 1.495 (As 1.495 (leuleu-)lys.HCllys.HCl 2.1 g/l 2.1 g/lF6-16 (F6-16 (leuleu -,Thr,Thr -)20.8 g/l20.8 g/lF9-50(F9-50(leuleu -,Thr,Thr -,AEC,AEC r r)33.5 g/l33.5 g/l一个基因内部遗传结构或一个基因内部遗传结构或DNADNA序列的任何改变序列的任何
46、改变基因突变：基因突变：基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。基因突变基因突变DNADNA损伤修复机制损伤修复机制突变突变自发突变自发突变诱变诱变环境因素的影响，环境因素的影响，DNADNA复制过程的偶然错误等复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为而导致，一般频率较低，通常为1010-8-8-10-10-9-9。某些物理、化学因素对生物体的某些物理、化学因素对生物体的DNADNA进行直接进行直接作用，突变以较高的
47、频率产生。作用，突变以较高的频率产生。前突可以通过前突可以通过DNADNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，这取决于修复作用和其它多种因素。来的结构，这取决于修复作用和其它多种因素。基因突变基因突变 诱发因素主要可以分为：诱发因素主要可以分为：细胞外因素、细胞内细胞外因素、细胞内因素和因素和DNADNA分子内部因素三个层次。分子内部因素三个层次。细胞外的诱发因素细胞外的诱发因素 自然环境或人工条件下的物理和化学因素自然环境或人工条件下的物理和化学因素 物理：物理：自然或人造的紫外线、自然或人造的紫外线、射线、射线、X X射线、快中子射线、快中
48、子、激光以及加热等都能成为基因突变的物理因素。、激光以及加热等都能成为基因突变的物理因素。化学：化学：自然人造的化学诱变因素有低剂量的金属离子、自然人造的化学诱变因素有低剂量的金属离子、高分子化合物、生物碱药物、染料及微生物产生的高分子化合物、生物碱药物、染料及微生物产生的H H2 2O O2 2、碱基类似物、烷化剂及亚硝酸盐等。碱基类似物、烷化剂及亚硝酸盐等。诱发因素诱发因素细胞内的诱发因素细胞内的诱发因素 生物体细胞的代谢活动会产生一些诱变物质，如过氧化生物体细胞的代谢活动会产生一些诱变物质，如过氧化氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等，它们是引起自发突变的内源氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等，它们是引起自发
49、突变的内源诱变剂。诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能就是这类原因。就是这类原因。DNADNA分子内部因素分子内部因素DNADNA分子中的碱基存在着互变异构效应分子中的碱基存在着互变异构效应 2.32.3常见的微生物突变类型常见的微生物突变类型2.3.1 2.3.1 营养缺陷型（营养缺陷型（auxotrophauxotroph）一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获
50、得这些营养或其前体物（营养或其前体物（precursorprecursor）才能生长。）才能生长。营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段育种的重要手段表型判断的标准：表型判断的标准：在基本培养基上能否生长在基本培养基上能否生长表型表型基因型基因型营养缺陷型（营养缺陷型（auxotrophauxotroph）影印平板（影印平板（Replica platingReplica plating）法是）法是LederbergLederberg夫妇在夫妇在19521952年建立年建立在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长在选择培养基（一
