1、国家十一五规划教材国家十一五规划教材生物工艺学生物工艺学（邱树毅主编）配套课件（邱树毅主编）配套课件共79页 第2页目录 目录目录 第一章绪论第一章绪论 第二章工业微生物菌种选育、制备与保藏第二章工业微生物菌种选育、制备与保藏 第三章工业培养基及其设计第三章工业培养基及其设计 第四章生物工艺过程中的无菌技术第四章生物工艺过程中的无菌技术 第五章生物反应动力学第五章生物反应动力学 第六章第六章 发酵过程原理发酵过程原理 第七章第七章 生物反应器及生物工艺过程的放大生物反应器及生物工艺过程的放大 第八章第八章 生物反应过程参数检测与控制生物反应过程参数检测与控制 第九章第九章 生物产品分离及纯化技
2、术生物产品分离及纯化技术 第十章第十章 生物产品工艺学及应用生物产品工艺学及应用 共79页 第3页目录 第六章第六章 发酵过程原理发酵过程原理6.1 6.1 发酵方式发酵方式 6.1.1 6.1.1 分批发酵分批发酵 6.1.2 6.1.2 连续发酵连续发酵 6.1.3 6.1.3 分批补料发酵分批补料发酵 6.1.4 6.1.4 细胞的高密度发酵细胞的高密度发酵6.2 6.2 发酵过程的影响因素发酵过程的影响因素 6.2.1 6.2.1 种子质量种子质量 6.2.2 6.2.2 培养基培养基 6.2.3 6.2.3 灭菌情况灭菌情况 6.2.4 6.2.4 温度温度 6.2.5 pH6.2.
3、5 pH 6.2.6 6.2.6 氧的供给氧的供给 6.2.7 6.2.7 二氧化碳和呼吸商二氧化碳和呼吸商 6.2.8 6.2.8 基质浓度、补料对发酵的影响基质浓度、补料对发酵的影响 6.2.9 6.2.9 泡沫的形成及其对发酵的影响泡沫的形成及其对发酵的影响6.3 6.3 杂菌及噬菌体感染杂菌及噬菌体感染 6.3.1 6.3.1 杂菌感染对发酵的影响及其防治杂菌感染对发酵的影响及其防治 6.3.2 6.3.2 噬菌体感染对发酵的影响及其防治噬菌体感染对发酵的影响及其防治6.4 6.4 发酵终点的判断发酵终点的判断共79页 第4页目录6.1 6.1 发酵方式发酵方式根据微生物对氧的需求不同
4、：好氧发酵、厌氧发酵、兼性好氧发酵好氧发酵、厌氧发酵、兼性好氧发酵 根据所使用的培养基的形态不同：固态发酵、液态发酵、半固态发酵固态发酵、液态发酵、半固态发酵 按培养基的装载方式不同：浅层发酵、深层发酵浅层发酵、深层发酵 在深层液态发酵过程中，根据操作方式的不同：分批发酵、连续发酵、分批补料发酵分批发酵、连续发酵、分批补料发酵 共79页 第5页目录6.1.1 6.1.1 分批发酵分批发酵 1.定义：分批发酵又称间歇发酵(培养)，是指将一定量的培养基一次性地加入发酵罐中，接种后发酵一段时间，一次性地排出发酵成熟液的培养方式 2.2.特点：特点：(1)在发酵过程中，菌体各个生长阶段的生理、代谢特征
5、明显；(2)每一次发酵需进行反复的清洗、灭菌等操作，增大了发酵的非生产时间，降低设备利用率及发酵效率；(3)每次均存在一个微生物的生长适应、增殖过程，增大了对底物的消耗，使底物利用率低；(4)培养基中的底物浓度较高，具有较高的渗透压，不利于微生物的生长等。3.分类：根据菌体浓度随发酵时间的变化情况，分批发酵中微生物的生长过程可分为延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期四个阶段。根据代谢途径的种类可将代谢产物分为初级代谢产物和次级代谢产物。共79页 第6页目录4.初级代谢产物：初级代谢产物常是微生物分解基质途径中的直接产物，与微生物的生长、繁殖关系密切，其对生命存在的意义重大，如氨基酸、核酸、维生素
6、等小分子物质。分批发酵过程中的菌体、基质和初级代谢产物三者浓度变化的过程特征是：菌体进入发酵罐后就开始生长、繁殖，直到达到一定的菌浓度。其生长过程显示延滞期、对数期、静止期和衰亡期等特征；基质浓度随发酵时间的延长而降低，被用于菌体的生长繁殖及初级代谢产物的形成；产物的形成中没有明显的形成期，产物的形成与菌体的生长呈平行关系，产物生产速率与菌体的生长速率成正比关系。5.次级代谢产物：次级代谢产物以大多数的抗生素、生物碱和微生物毒素等物质为代表。菌体的生长及基质的消耗情况与初级代谢过程相同，但菌体的生长繁殖阶段与产物的形成阶段是分开的，即形成菌种的生长期和产物的生产期。在此种代谢中产物的形成只与菌
7、体的多少量有关，与菌种的生长速率无关。次级代谢的代谢变化，一般可分为菌体生长、产物合成和菌体自溶三个阶段。共79页 第7页目录(3)菌体自溶阶段：这个阶段一般称为菌体自溶期或发酵后期。在此阶段中菌体衰老，细胞开始自溶，氨氮含量增加，pH上升，产物合成能力衰退，生产速率大幅度下降。发酵到此阶段必须结束，否则不仅会因菌体自溶而使发酵液在过滤和提取等后续工艺中操作困难，而且产物可能会受菌体自身分泌的酶破坏。(2)产物合成阶段：此阶段主要是次级代谢产物的合成。在这个阶段中，产物的产量逐渐增多，直至达到高峰，生产速率也达到最大，直至产物合成能力衰退。生产菌的呼吸强度一般无显著变化，菌体物质的合成仍未停止
8、，使菌体的重量有所增加，但基本不繁殖。这个阶段的代谢变化是以碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主。(1)(1)菌体生长阶段菌体生长阶段：生产菌接种后，在合适的培养条件下，经过适应期，就开始生长和繁殖，直至菌体生长达到恒定。其代谢变化的主要特征是：碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被消耗，pH也发生一定改变。新菌体不断被合成，其摄氧率也不断增大，溶氧浓度不断下降。当营养物质消耗到一定程度，溶氧浓度降到一定水平时，即其中某一成分可能成为菌体生长的限制性因素，使菌体生长速率减慢，生长达到恒定。同时，在大量合成菌体期间，积累了相当量的某些代谢中间体，原有酶的活力下降(或消失)，出现了与次级代谢有关的
9、酶或其酶被解除了控制等原因，导致菌体的生理状况发生改变，发酵过程开始从菌体生长阶段转入产物合成阶段。共79页 第8页目录6.1.2 6.1.2 连续发酵 1.定义：连续发酵是在分批发酵的基础上，以一定的速率连续地流加新鲜培养基并流出等量的发酵液，以维持培养系统内量的恒定，使细胞处于近似恒定状态下生长的发酵培养方式，也称连续培养连续培养。2.2.特点：特点：(1)可以维持稳定的操作条件，从而使产率和产品质量也相应保持稳定；(2)机械化和自动化程度高，可控性好，可较大程度地降低劳动强度；(3)避免菌种的适应期并减少设备清洗、灭菌等非生产占用时间，有效提高设备利用率，节省劳动力和工时，节省能源；(4
10、)由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得以延长；(5)容易对工艺过程进行优化，有效地提高发酵产率；(6)对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高，从而增加投资成本；(7)发酵周期长，容易造成杂菌污染；(8)微生物容易发生变异，特别是代谢控制发酵所采用的菌种，大部分是经过诱变的突变菌株，其遗传性质非常不稳定。3.应用：(1)在菌体生产方面的应用：(2)在代谢产物生产方面的应用：(3)用于微生物生理特性及动力学方面的研究：(4)在菌种遗传稳定性方面的研究：(5)在菌种的筛选和富集方面的研究：(6)在发酵培养基配方改进方面的研究：共79页 第9页目录6.1.36.1.3分批补料发酵分批补料发酵 1.
11、1.定义定义：分批补料发酵是在分批发酵过程中，间歇地或连续地向培养基中补加新鲜培养基的发酵或培养方式，可在获得较高的产品得率的同时有效利用培养基组分，是介于分批发酵及连续发酵之间的一种过渡性操作，又称为半连续发酵或半连续培养。2.2.优点：优点：(1)可以避免在分批发酵过程中因一次性投料过多造成细胞大量生长而产生不利影响。(2)可以解除产物反馈抑制和分解代谢物抑制作用；(3)可作为控制细胞量的手段，以提高发芽孢子的比例；(4)可为自动控制和最优控制提供实验基础。与连续发酵相比，分批补料发酵的菌种老化、变异、污染的几率相对较低；最终产物浓度也较高；使用范围也比连续发酵更为广泛。共79页 第10页
12、目录3.3.缺点：缺点：(1)增加的反馈控制的附属设备使投资较高；(2)在没有反馈控制的系统中料液的添加程序是预先固定的。当菌体的生长与时间变化关系与预想的不一致或出现异常时，则不能进行有效的控制调节。而且，对发酵过程中的补料种类及补料时间的控制，需先进行相应的发酵动力学研究，在研究的基础上结合经验，来确定最佳补料控制，这样才可能进行较有效的控制；(3)对操作者的技能要求较高。(4)也存在一定量的清洗、灭菌等非生产时间，影响整个发酵过程的效率。4.4.应用：应用：(1)用于菌体高密度培养的研究；(2)分批补料发酵方式也适合于与菌体生长偶联的胞内产物的生产过程；共79页 第11页目录从理论上来讲
13、，当细胞处于适当的生产条件下，能保持较佳的生产能力，即当反应器中营养物充足、无细胞生长抑制物质积累，细胞生长在空间上不受限制时，细胞将持续生长，提高在反应器中的浓度，实现高密度培养。在一定范围内，细胞代谢产物的产量随着反应器内的细胞浓度的增加而增加。采用细胞高密度发酵，可以增加细胞代谢产物的产量，也缩小了反应器的容积和降低目的产物的分离提纯费用。但需注意的是产物相对于底物的转化率并不随细胞浓度的增大而增大，这样就会造成生产成本的增加。6.1.4 6.1.4 细胞的高密度发酵 共79页 第12页目录6.1.4.16.1.4.1无生长抑制物积累时的细胞高密度发酵无生长抑制物积累时的细胞高密度发酵
14、建立细胞高密度发酵的实验方案可从以下三个方面来考虑：(1)使用最低合成培养基，有助于避免引入未知的、不确定的对细胞生长不利因素存在，便于进行较准确的培养基设计和计算菌体的生长得率；(2)优化细胞的生长速率，使碳源能被充分利用获得较高的产率；(3)采用分批补料发酵方式，以碳源或氮源为限制性基质进行流加，有效控制细胞的生长速率，对氧的需求、菌种稳定性等问题。共79页 第13页目录当有对细胞生长有抑制作用的代谢产物生成、积累时，如果不采取措施及时将这些物质除去，就不可能使菌体保持持续生长以达到高浓度。目前所研究用于除去抑制性产物的方法是在常规的反应器上偶联渗析、萃取、过滤、渗透汽化等操作系统，在发酵
15、的过程中实现边发酵边除去抑制性产物的操作。这样的反应器类型有常用的搅拌罐和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应器，如透析膜发酵系统透析膜发酵系统、萃取发酵系统萃取发酵系统、外置过外置过滤器的发酵系统滤器的发酵系统等。6.1.4.2 6.1.4.2 有生长抑制物生成时的细胞高密度发酵 共79页 第14页目录(1)(1)透析膜发酵系统：透析膜发酵系统：透析膜发酵系统结构如图所示。其中关键装置是半透性膜，它不能让细胞自由通过，而允许发酵液及培养液中的成分可自由透过。通过半透膜使发酵液中的生长抑制性物质透过膜排出发酵罐，从而减小或排除抑制作用，同时使培养基贮罐中的营养物透过膜进入细胞的培养罐，以补充其
16、消耗。共79页 第15页目录(2)(2)萃取发酵系统萃取发酵系统：萃取发酵系统就是向发酵罐内或将发酵液引出发酵罐在单独的萃取系统中加入难溶于水的有机溶剂，选择性地萃取菌体的生长抑制物，从而减轻有毒产物对菌体发酵速率的抑制作用，从而提高菌体浓度，提高产物产率。在萃取操作中需选择分配系数大、对微生物毒性小的廉价溶剂，并能较好地回收萃取剂。有人用这种方法对丙酮-丁醇发酵进行了研究。共79页 第16页目录(3)(3)外置过滤器的发酵系统：外置过滤器的发酵系统：此系统是利用一种只能使发酵液通过而不能使微生物通过的微滤膜，将发酵液中的抑制性物质及其产物通过过滤膜降低其浓度，实现边过滤边发酵的操作，系统结构
17、如图所示。在过滤的同时还必须添加新鲜物料，满足菌体不断增殖发酵的营养需求。所用的微滤膜可用能够灭菌的精密陶瓷或合成高分子材料，发酵液高速流过膜表面，滤液沿着与过滤膜垂直的方向通过膜进行错流过滤。有人将这种发酵方式用于乳酸菌培养的研究中。共79页 第17页目录6.2 6.2 发酵过程的影响因素发酵过程的影响因素 1 1 种子质量种子质量2 2 培养基培养基 3 3 灭菌情况灭菌情况 4 4 温度温度 5 pH 5 pH 6 6 氧的供给氧的供给7 7 二氧化碳和呼吸商二氧化碳和呼吸商 8 8 基质浓度、补料对发酵的影响基质浓度、补料对发酵的影响 9 9 泡沫的形成及其对发酵的影响泡沫的形成及其对
18、发酵的影响 共79页 第18页目录6.2.1 6.2.1 种子质量种子质量 菌种是发酵过程的关键，是发酵过程的核心和主体。它直接影响生产效率、产品成本和产品质量。首先，要采用自然育种、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种、基因定向育种等一系列选育方法来改良原始菌株，得到生产菌株，满足发酵生产高产、稳定、安全的需求。一般情况下，接种时的菌龄以对数生长期后期，即培养液中菌浓接近高峰时的种子较为适宜。太年轻的种子接种后往往会出现前期生长缓慢，使整个发酵周期延长，产物开始形成时间推迟等现象。过老的种子虽然能获得较多的菌量，但接种后会出现生产能力的下降，菌体过早出现衰退等现象。种子的接种量的大小是由发酵罐中
19、菌种的生长繁殖速度决定的。通常，采用较大的接种量可缩短菌种生长达到高峰的时间，使产物的合成提前。这是因为种子数量多，种子液中所含的大量胞外水解酶类，有利于加快菌体对基质的利用，使生产菌在整个发酵罐中较短时间内占具数量优势，从而减少杂菌污染机会。但是，如接种量过大，也可能使菌种生长过快，增大发酵液的粘度，导致溶氧及营养不足，影响产物的合成。在普通情况下种子的接种量为510为宜；抗生素发酵的接种量有时可增加到2025，甚至更大。返回返回共79页 第19页目录1.培养基的作用培养基的作用2.培养基中的碳源培养基中的碳源6.2.2 6.2.2 培养基培养基 培养基是维持细胞发酵重要的物质基础。培养基为
20、细胞提供代谢过程所必需的能源，并提供满足细胞生长及生产需要各种元素。所以，只有选用良好的培养基成分和配比，才能充分发挥生产菌种生物合成产物的能力，保证发酵单位、提取收率和产品质量。碳源常用于构建细胞和形成产物，工业培养基中碳源的种类可以分为迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源。如葡萄糖能迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解产物，因此，有利于菌体生长。但同时也会造成葡萄糖效应。缓慢利用的碳源，能被菌体缓慢利用，有效地控制了菌体利用碳源的速率，有利于延长代谢产物的合成时间，尤其是有利于延长次级代谢物抗生素的分泌期，所以成为许多微生物药物的发酵的最适碳源。例如，乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油及半乳糖
21、分别是青霉素、头孢菌素C、链霉素、核黄素及生物碱发酵的最适碳源。共79页 第20页目录3.培养基中的氮源培养基中的氮源 4.4.培养基中的矿物质培养基中的矿物质 大多数微生物发酵需添加磷酸盐、镁、锰、铁、钾盐和氯化物等矿物质。通常在自来水或天然培养基中已含有足够量的所需微量元素，所以在初级代谢产物的发酵培养基中不需另外添加。但对于次级代谢产物的发酵，因为大多数金属离子，尤其是无机磷酸盐，能促进菌体生长，但对其生物合成却有一定的抑制作用。所以，在次级代谢产物合成的培养基多为半合成培养基，需对各无机盐离子的浓度进行严格控制，并根据各批原料的盐离子成分及含量变化情况来适当地调整培养基中盐离子的浓度及
22、种类，以防止抑制作用。工业培养基中的氮源有无机氮源和有机氮源两大类，对菌体代谢都能产生明显的影响。氮源的种类和浓度不同，均能影响产物合成的方向和产量。与碳源相似，根据菌体利用速度，氮源也可分为快速利用的氮源，快速利用的氮源容易被菌体利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，特别是次级代谢产物的合成产生调节作用，影响其产量；而缓慢利用的氮源对延长次级代谢产物的分泌期、提高产物的产量有好处。但单独使用时，容易因养分不足而使菌体生长受阻，过早衰老而自溶，从而缩短产物的分泌期。所以，工业上常用的发酵培养基一般选用快速和慢速利用的氮源搭配使用。返回返回共79页 第21页目录6.2.3 6.2.3 灭菌
23、情况灭菌情况 在发酵过程中，只允许生产菌存在和生长繁殖，不允许其他的杂菌存在，因此，在发酵之前，必须对发酵过程中所有与生产菌接触的培养基、空气、辅料、设备、管道等进行彻底的灭菌。在灭菌过程中，培养基的灭菌方法、灭菌温度和时间除了对培养基的营养成分有影响外，还会对培养基的性质有一定改变。如会改变发酵液的起泡性能，灭菌强度越大，其发酵液中的泡沫就越多。灭菌是发酵工艺中的一个重要环节，而发酵的最终目的，是为了获得产物高产。所以，对不同性质的原材料，不同的介质内容，应当选择不同的消毒灭菌条件及灭菌方法，千万不可生搬硬套只采用一种灭菌方法和模式。在保证灭菌效果的前提下，尽可能地减少培养基营养成分及对被灭
24、菌材料的破坏。返回返回共79页 第22页目录6.2.4 6.2.4 温度温度 返回返回1 1 温度对发酵的影响温度对发酵的影响 2 2 影响发酵温度变化的因素影响发酵温度变化的因素 3 3 最适温度的选择最适温度的选择 4 4 温度的控制温度的控制共79页 第23页目录6.2.4.1 6.2.4.1 温度对发酵的影响温度对发酵的影响 发酵过程常涉及的菌株有霉菌、放线菌和一般细菌，它们绝大多数是中温菌，最适生长温度一般在2040。温度对酶的活性的发挥，生化反应速率的快慢，微生物的代谢调控机制的发挥，菌体代谢产物的合成方向等均会有不同程度的影响。所以，温度会影响细胞生长、产物形成，另外还会影响发酵
25、液的物理性质。温度对化学反应速率的影响可用温度系数Q10来表示，即温度每增加10，化学反应速率增加的倍数，Q10一般为23。温度影响着各代谢途径的酶的活性作用，进而影响生物的代谢调控机制及产物的合成方向和产量。在酶的作用温度范围内，存在一个最适温度。但通常在菌体内与生长及生产相关的代谢反应过程不同，涉及到的酶系也不相同，所以，最适生长温度及最适生产温度也常不相同。在最适生长温度范围内，温度升高，细胞的生长、繁殖、代谢速度加快。当温度超过最适生长温度范围时，酶的催化活性将受很大影响，酶失活的速率加快，细胞死亡速率加快，不利于细胞的生长 返回返回共79页 第24页目录6.2.4.2 6.2.4.2
26、 影响发酵温度变化的因素影响发酵温度变化的因素 Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射 所谓发酵热发酵热即发酵过程中释放出来的净热量，它由产热因素和散热因素两方面共同决定的。1.生物热(Q生物)2.搅拌热（Q搅拌）3.蒸发热（Q蒸发）4.辐射热（Q辐射）生产菌在生长繁殖过程中产生的热能，叫做生物热生物热。这种热的来源主要是培养基中的碳水化合物、脂肪和蛋白质等物质被微生物分解成二氧化碳、水或其他物质时释放出来的。其中部分能量被生产菌利用来合成高能化合物ATP，满足菌体代谢和产物合成的能量需求，其余部分则以热的形式散发到周围环境中去，形成了生物热，引起环境温度的变化。生物热的大小，随菌种所处
27、的培养基成分及培养阶段的不同而变化。生物热的大小，随菌种所处的培养基成分及培养阶段的不同而变化。一般地说，对某菌株而言，在相同条件下，培养基成分越丰富，营养被利用的速度越快，产生的生物热就越大。在不同的菌种培养阶段，菌体的呼吸作用、发酵作用的强度不同，所产生的热量也就不同。在发酵初期在发酵初期，菌体处在滞后期和孢子发芽时，菌数少，呼吸作用缓慢，产生的生物热是有限的。当进入对数生长期对数生长期后，菌体的生长、繁殖速率增大，呼吸作用激烈，就释放出大量的热能，使温度升高快，并与细胞的合成量成正比。对数期后，菌体已基本上停止繁殖，逐渐衰老，主要靠菌体内的物质进行发酵，产生的热量不高，温度变化不大，且逐
28、渐减弱。共79页 第25页目录在机械搅拌罐中，搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间 的 摩 擦 所 产 生 的 热 量，即 为 搅 拌 热搅 拌 热。搅 拌 热 可 根 据Q=(P/V)3600近似计算，其中的P/V是通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率(kW/m3)，3600为热功当量(kJ/(kwh)。空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后，排出时引起水分蒸发所需的热能，即为蒸发热蒸发热。水分的蒸发热及废气因温度差异所带走的部分显热(Q显)一起都散失到外界环境。由于进入的空气温度和湿度是随外界的气候和控制条件而变化，所以Q蒸发和Q显是不确定的。由于发酵罐内外温度不同，发酵液中有部分热通过罐体
29、向外辐射，这种热能称为辐射热辐射热(Q辐射辐射)。辐射热的大小取决于罐内外的温度差，差值越大，Q辐射也越大。Q辐射受环境变化的影响，冬季影响较大，夏季影响较小，一般不会超过发酵热的5%。返回返回共79页 第26页目录6.2.4.3 6.2.4.3 最适温度的选择 最适发酵温度要既能满足菌体的生长、又能满足代谢产物合成的需要。但通常菌种不同，培养阶段不同，培养目的不同，则最适温度也不相同。最适生长温度与最适生产温度往往是不一致的。最适发酵温度的选择还要参考其他发酵条件，如培养基成分、培养条件等。当发酵处于较差的通气条件时，则可选择较低的发酵温度，以提高氧的溶解度，降低菌体生长速率、减少对氧的消耗
30、量，从而弥补了因通气不足而造成代谢异常。在使用浓度较稀或较易利用的培养基时，也可采用较低的培养温度可避免菌体快速利用营养物质，导致的营养过早耗竭，菌体过早自溶，使产物合成提前终止的发酵异常。初级代谢产物乳酸的发酵，其生产菌乳酸链球菌的最适生长温度为34，产酸量最多的温度为30，发酵速度最高的温度为40。在谷氨酸发酵中，生产菌的最适生长温度为3034，生产谷氨酸的最适温度为3637。次级代谢产物发酵青霉素的生产菌产黄青霉的最适生长温度通常为30，而青霉素合成的最适温度为24.7。返回返回共79页 第27页目录6.2.4.4 6.2.4.4 温度的控制 工业上使用大体积发酵罐时，因发酵过程中释放大
31、量的发酵热，一般不需要加热，需要冷却的情况较多。对于小型种子罐或发酵前期，散热量有时会大于菌种所产生的发酵热，特别是在气候寒冷的地区或冬季则需用热水保温。发酵罐的温度控制，目前主要有罐内、罐外两种换热方式，罐内主要是采用蛇管采用蛇管或列管式换热列管式换热方式，常用于体积大于10m3以上的发酵罐。罐外换热主要有夹套式换热方式，常用于体积小于10m3的发酵罐，也有将发酵液引出罐外，在罐外用螺旋板式换热器等换热效率较高的换热器对发酵液进行集中换热，然后通过泵或压差将发酵液打回发酵罐的循环换热方式。发酵温度的恒定常用自动化控制或手动调整的阀门来控制冷却水的流量大小，以平衡时刻变化的发酵温度，维持恒温发
32、酵。对于气温较高的季节，冷却水达不到预期冷却效果时，就可采用冷冻盐水进行循环降温，以迅速达到最适发酵温度。返回返回共79页 第28页目录6.2.5 pH6.2.5 pH 返回返回1 pHpH对发酵的影响对发酵的影响 2 发酵过程中发酵过程中pHpH的变化情况的变化情况 3 3 影响发酵液影响发酵液pHpH值变化的因素值变化的因素 4 4 发酵发酵pHpH的确定的确定 5 5 发酵发酵pHpH的控制的控制共79页 第29页目录6.2.5.1 6.2.5.1 pH对发酵的影响 发酵培养基的pH值，对微生物体内各酶系活性的发挥有着非常明显的影响。pH对酶活性的影响，一方面一方面是由于酶本身是蛋白质，
33、过酸或过碱易使酶变性失活；另一方面另一方面是影响了酶分子的活性中心上有关基团或底物的解离，影响酶与底物的结合，从而影响酶的活力。多数微生物生长都有最适pH范围及能忍受的pH上下限。大多数微生物能在3个p单位范围内生长，一般说来，大多数细菌生长的最适pH为6.37.5，霉菌和酵母菌生长最适pH为36；放线菌生长最适pH为78。通常，微生物能忍受的pH上限都在8.5左右，超过此上限，微生物将无法忍受而自溶，下限以酵母的2.5为最低。但菌体内的pH值一般认为是中性附近。酿酒酵母在pH为酸性时，酵母生长良好，而在pH偏碱性时，大量产生甘油。对于次级代谢产物链霉素生产菌灰色链霉菌的生长pH应控制在6.5
34、7.1，生产pH应控制在6.97.5。土霉素的生产菌龟裂链丝菌的生长pH应控制在6.06.6，生产pH应控制在5.66.4。若pH不当，会影响或改变菌体的生长和产物合成的代谢过程。在黑曲霉的柠檬酸发酵过程中，pH为23时，菌体合成柠檬酸；当pH为67，菌种则合成草酸。发酵过程pH的变化会引起菌体内ATP生产率的减少，因此引起细胞产量的减少，倍增时间增加。pH不同对细胞壁的机械强度也有明显的影响，细胞壁的膨胀或收缩改变了细胞内部的渗透压，使细胞形态发生变化。pH还对发酵液或代谢产物产生物理化学的影响，其中要特别注意的是对产物稳定性的影响。返回返回共79页 第30页目录6.2.5.2 6.2.5.
35、2 发酵过程中pH的变化情况 在发酵过程中，pH的变化决定于所用菌种、培养基成分和培养条件。一般在正常情况下，菌体在不同的生长阶段，pH显现一定的变化规律。(1)生长阶段：生长阶段：根据菌体利用基质及涉及的代谢途径的不同，pH呈现上升或下降的趋势。如利福霉素B发酵起始pH为中性，但生长初期由于菌体产生的蛋白酶水解培养基中蛋白胨而生成铵离子，使pH上升至碱性。接着，随着菌体量的增多、铵离子的利用及葡萄糖利用过程中产生的有机酸的积累使pH下降到酸性范围，而有利于菌的生长。(2)生产阶段：生产阶段：在此阶段pH趋于稳定，维持在最适产物合成的范围。(3)自溶阶段：自溶阶段：随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的
36、活跃，发酵液中氨基氮增加，致使pH又上升，此时菌丝趋于自溶而代谢活动终止。返回返回共79页 第31页目录6.2.5.3 6.2.5.3 影响发酵液pH值变化的因素 (1)使使pH下降的因素下降的因素 培养基中碳源过多或降糖速度过快，特别是导致EMP途径进行速度过快，打破了EMP和TCA之间的平衡，丙酮酸大量积累，使丙酮酸的代谢转向生成乳酸，pH下降。在发酵过程中，中间补料时添加碳源或消泡剂过量。其中消泡剂除了消泡的作用外，还可被微生物当作碳源利用掉，使pH下降。在对数生长期，或者产物合成期，由于菌体需氧量增大，供氧不匹配，导致发酵液的溶解氧急剧下降，使得有氧呼吸等途径受阻，乳酸等酸性物质积累，
37、使pH下降。培养基中的生理酸性物质被利用，引起pH下降。常见的生理酸性物质有(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、NH4H2PO4等，当其中的NH4+被利用后，余下的SO42-或PO43-被利用或者电离后，引起发酵液的pH下降。酸性代谢产物，如柠檬酸、某些酸性氨基酸能溶解在发酵液中，造成HCO3的CO2等的积累，也导致发酵液pH下降。某些杂菌的感染，如醋酸杆菌、乳酸杆菌、野生酵母等，也会引起pH的下降。共79页 第32页目录 (2)使使pH上升的因素上升的因素 培养基在设计、配制过程中，氮源偏高，造成pH值上升。当菌体生长到一定的阶段后，由于自身分泌的胞外蛋白酶，水解培养基中的蛋白质，产生
38、并积累大量的氨基酸，从而使菌体内的氨基酸合成受阻，则NH4+浓度增加，导致发酵液的pH值上升。培养基中生理碱性物质被利用，引起pH的上升。常见的生理碱性物质有NaNO3、尿素等，当其中的NO3-被利用后，使发酵液pH值上升。在分批补料发酵过程中，中间补料时氨水或尿素等的碱性物质加入过多而使pH上升。发酵后期或发酵异常，菌体大量死亡、自溶造成菌体内容物的溶出，导致发酵液的pH上升。对于引起发酵液pH变化的生理酸性或生理碱性物质也是相对而言的，有些物质是生理酸性物质，但也可能在另一条件下表现为生理碱性物质，主要是由菌的生理特性所决定。如菌体氨基酸作为主要或唯一碳源进行好氧性发酵时，引起NH4+的产
39、生和积累，当其量超过菌体需氮量时，就会引起pH值的上升。如果以氨基酸进行厌氧发酵，在进行脱氨作用时，即产生碱也产生酸，引起pH值变化。对于这些由于菌体代谢所引起的pH变化，如果不加以控制的话，必然要干扰微生物反应的正常进行。因此，需要对pH进行严格控制。返回返回共79页 第33页目录6.2.5.4 6.2.5.4 发酵pH的确定 发酵最适pH的确定是以有利于菌体生长和产物的合成为原则。发酵时，须将发酵培养基调节成一定的出发pH值，在发酵过程中，定时测定、加酸或加碱来调节pH值，以维持出发pH值。除此外，还需在培养基配方中考虑pH缓冲性物质，以减缓在发酵过程中发酵液pH值的变化。常用的缓冲性物质
40、有：CaCO3，柠檬酸盐、磷酸盐等。发酵最适pH值一般根据实验结果来确定。在发酵过程中定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH值为菌体生长的最适pH。以同样的方法，可测得产物合成的最适pH。通常在不同的发酵阶段最适pH范围差别较大时，可以采用分阶段地控制发酵pH值的方式，以满足不同发酵阶段的需要。共79页 第34页目录0 0.1 1 5 50 0.1 1 0 00 0.0 0 5 53 3.0 02 2.0 01 1.0 0P P H H平平均均得得率率系系数数平平均均比比生生产产能能力力/1 10 03 31 12 2 有图得知：在确定最适pH值时，除了考虑不同的菌种、培养基组成对
41、pH的影响外，还需考虑培养条件特别是温度对pH的影响，培养温度的升高或降低都会使发酵最适pH波动。返回返回共79页 第35页目录6.2.5.5 6.2.5.5 发酵pH的控制 pH值与比生长速率和产物比产生速率之间的几种关系 共79页 第36页目录A图：图：菌体比生长速率和产物比生产速率qP在一个相似的较宽的范围内，这种发酵比较容易控制。B图：图：菌体比生长速率的最适pH范围较宽的，而产物比生产速率qP的最适pH范围较窄，或的较窄，qP的范围较宽，此种发酵较难控制，应严格控制发酵过程的pH变化。C图：图：菌体比生长速率和产物比生产速率qP的最适pH范围较窄，对pH变化都很敏感，其最适pH相同，
42、此种发酵过程也应严格控制。D图：图：菌体比生长速率和产物比生产速率qP对pH都很敏感，并有各自的最适pH，此种情况更复杂，发酵过程控制难度最大。在分批或分批补料的发酵过程中，需考虑在培养基中采用合适的碳氮源配比及缓冲性物质在一定范围内控制发酵过程的pH值变化。当pH值变化较大时，可通过补加物料的方式来控制pH值变化。共79页 第37页目录青霉素发酵的pH值控制对青霉素产量的影响成功成功范例：范例：青霉素发酵的pH值控制，用恒定加糖速率的补料工艺与加酸或碱来控制pH值的方式相比，青霉素产量可提高25%。图中实线是用酸、碱来控制pH，虚线是以控制加糖速率来控制pH，两者的加糖量相同。这说明，以pH
43、为依据，采用控制补料速率的方式来控制pH，正好满足菌体合成代谢的要求，使产量提高。返回返回共79页 第38页目录6.2.6 6.2.6 氧的供给氧的供给返回返回1 溶氧对发酵的影响溶氧对发酵的影响 2 发发酵过程中溶氧的变化及其异常酵过程中溶氧的变化及其异常 3 3 影响溶氧的主要因素影响溶氧的主要因素 4 4 溶氧浓度的控制溶氧浓度的控制 共79页 第39页目录6.2.6.1 6.2.6.1 溶氧对发酵的影响溶氧对发酵的影响 1.微生物对氧的需求：微生物对氧的需求：氧是细胞的组成成分和各种产物的构成元素，又是生物能量代谢的必需元素，是生物体生存的重要元素。分子态的氧是好气性微生物在氧化代谢过
44、程中的电子最终受体，同时通过氧化磷酸化反应生成生物体生命活动过程中所需要的大量能量。此外，氧还作为反应物直接参与一些生物合成反应。微生物的耗氧量及其速率主要受菌体代谢活动变化的影响，对于微生物的耗氧速率可用两个物理量表示：一是微生物摄氧率()，即单位发酵时间内单位体积发酵液消耗的氧量，单位为mmo1(O2)/(m3h)；一是呼吸强度(QO2)，即单位时间内单位重量的干菌体消耗的氧量，单位为mmo1(O2)/(g(干菌体)h)。2.2.氧对辅酶氧对辅酶NAD(P)浓度的影响：浓度的影响：在微生物的代谢过程中，有许多催化脱氢氧化反应的酶的辅酶是NAD(P)，NAD(P)的浓度是保证酶活力的基础。N
45、AD(P)作为H的受体，加氢还原为NAD(P)H，NAD(P)H只有在有氧的条件下才可以及时地通过呼吸链被氧化或在少数情况下通过还原反应脱氢，生成氧化性的NAD(P)，NAD(P)作为辅酶重新加入脱氢反应。但当发酵液中氧的浓度不够时，NAD(P)的浓度大量降低，则与NAD(P)相关的酶促反应停止，影响代谢的正常进行。3.氧对代谢途径的影响氧对代谢途径的影响:通常情况下通常情况下:溶氧浓度可能成为发酵的限制性因子，但对于不同的菌种，发酵产物的代谢途径不同对氧的需求也不相同。氧的存在是TCA循环能够进行的基础，缺氧必然使丙酮酸积累，导致乳酸形成，使发酵液的pH值下降，影响菌体的正常代谢。共79页
46、第40页目录 通常情况下，溶氧浓度可能成为发酵的限制性因子，但对于不同的菌种，发酵产物的代谢途径不同对氧的需求也不相同。氧的存在是TCA循环能够进行的基础，缺氧必然使丙酮酸积累，导致乳酸形成，使发酵液的pH值下降，影响菌体的正常代谢 共79页 第41页目录结论：结论：在初级代谢产物氨基酸的发酵过程中，根据对氧的需求大小不同就可将氨基酸生产分为三类：一类在供氧充足条件下，产量最大，若供氧不足，产物合成将受到强烈抑制。如：谷氨酸，精氨酸，脯氨酸等的生产；一类在供氧充足条件下，可得到最高产量，但供氧受限，产量受影响不明显。如：异亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸等的生产；一类在供氧受限，细胞呼吸受抑制时，才能获
47、得最大的产物量，而在供氧充足时，产物形成反而受抑制。如：亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸等的生产。所以不同的代谢产物其代谢途径对氧的需求是不同的，当培养液中溶解氧量不能满足菌体要求时，则会使代谢途径的方向受到影响，影响产物的正常合成。返回返回共79页 第42页目录6.2.6.2 6.2.6.2 发发酵过程中溶氧的变化及其异常酵过程中溶氧的变化及其异常 发酵过程中溶氧的变化规律谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线 红霉素发酵过程中溶氧和粘度的变化 在分批发酵过程中，正常的设备操作和发酵条件下，每种菌种发酵的溶氧浓度都有一定的变化规律。通常，在发酵前期(滞后期及对数生长期)，生产菌种开始大量繁殖，需氧量不断增
48、加。当需氧量超过供氧量时，溶氧浓度明显下降，出现一个低峰(谷氨酸发酵的溶氧低峰在发酵后620h，抗生素的都在发酵后1070h)，发酵液中的菌浓度也不断上升，生产菌种的摄氧率同时也出现一个高峰。过了生长阶段，菌种需氧量有所减少，溶氧浓度经过一段时间的平稳阶段(如谷氨酸发酵)或上升阶段(如抗生素发酵)后，就开始形成产物，溶氧浓度也不断上升。共79页 第43页目录补料与溶氧浓度的变化关系 发酵中后期，对于分批发酵来说，因为菌体已繁殖到一定浓度，进入静止期，呼吸强度变化也不大，如不补加基质，发酵液的摄氧率变化也不大，供氧能力仍保持不变，溶氧浓度变化也不大。但当外界进行补料(包括补加碳源、前体、消泡油)
49、时，则溶氧浓度就会发生改变。变化的大小和持续时间的长短，则随补料时的菌龄、补入物质的种类和剂量的不同而不同。如补加糖后，发酵液的摄氧率就会增加，引起溶氧浓度下降，经过一段时间后又逐步回升；继续补糖，溶氧浓度会继续下降，甚至降至临界氧浓度以下，成为生产的限制性因素，其补料与溶氧浓度的变化关系。在生产后期，由于菌体衰老，呼吸强度减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧浓度更会明显上升。共79页 第44页目录发酵过程中溶氧的异常变化 在发酵过程中，有时会出现溶氧浓度明显降低或明显升高的异常变化情在发酵过程中，有时会出现溶氧浓度明显降低或明显升高的异常变化情况。在溶氧浓度的异常变化中较常见的是溶
50、氧下降，可能由下列几种原因造况。在溶氧浓度的异常变化中较常见的是溶氧下降，可能由下列几种原因造成：成：污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在较短时间内下污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在较短时间内下降到零附近。但如果杂菌本身的耗氧能力不强，溶氧变化可能不明显。降到零附近。但如果杂菌本身的耗氧能力不强，溶氧变化可能不明显。菌体代谢发生异常现象，对氧的要求增加，使溶氧下降。菌体代谢发生异常现象，对氧的要求增加，使溶氧下降。发酵过程中，某些设备或工艺控制发生故障或变化，也可能引起溶氧发酵过程中，某些设备或工艺控制发生故障或变化，也可能引起溶氧下降。如搅拌功率消耗变小或搅拌速度
