1、几种水产动物血涂片的几种水产动物血涂片的制作及形态比较观察制作及形态比较观察 一、实验目的一、实验目的 了解血涂片的制作方法，了解血涂片的制作方法，同时认识鲫鱼和美国牛蛙的血细胞。同时认识鲫鱼和美国牛蛙的血细胞。二、实验内容二、实验内容鲫鱼和美国牛蛙血涂片的制作鲫鱼和美国牛蛙血涂片的制作三、实验材料三、实验材料1.鲫鱼，美国牛蛙2.Giemsa染料粉剂、瑞氏染料粉剂、甘油、甲醇3.磷酸二氢钾（无水）、磷酸氢二钠（无水）4.载玻片、盖玻片、注射器、玻璃棒、pH试纸、烧杯、容量瓶Giemsa氏染料原液配制氏染料原液配制Giemsa染料粉剂 0.75g甘油 50ml甲醇 50ml 将粉剂放于甘油内搅
2、匀，放入60度温箱24h，经常摇匀。取出待冷再加甲醇混匀，配成原液，密封棕色瓶保存。使用时，以原液5ml加M/15磷酸盐缓冲液（pH6.4-6.8）50ml稀释成工作液。磷酸缓冲液的配置磷酸缓冲液的配置 分别称取磷酸二氢钾（无水）6.64g，磷酸氢二钠（无水）2.56g，加少量水溶解，加水至1000ml。用精密pH试纸确定其pH。载玻片的准备载玻片的准备 新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为 lmol/L 的HCl浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反复冲洗，最后用0.95mol/L乙醇浸泡1h，干燥备用。使用载玻片时，不要用手
3、触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。四、实验步骤四、实验步骤1.血涂片的制作2.染色3.观察血涂片制作方法血涂片制作方法 l取血液标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持 3045 度夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜 l涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。血滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜越薄。l一张良好的血涂片，要求厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，血膜边缘整齐并留有的空隙。血涂片的染色血涂片的染色 血涂片染色包括两个过程：固定和染色。固定是将细胞
4、蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。常用的染色方法有瑞士染色法(Wright)、姬姆萨染色法(Giemsa)等。瑞氏染液瑞氏染液0.1g瑞氏染料粉剂放入洁净干燥的研钵中，滴加60ml甲醇至全溶，密封于棕色小口瓶内，放置半个月-1个月。步步 骤骤l血涂片经甲醇固定2minl滴加工作液染色15-30min，室温。l蒸馏水漂洗l缓冲液分色，至血膜显示淡红色。l标本干燥后，封片活不封片l观察结果结果 红细胞被染成橘红色，白细胞核紫色，嗜酸性颗粒鲜红色，嗜碱性颗粒蓝紫色，中性颗粒紫或紫红色，淋巴及单核细胞胞浆蓝灰色。l压片法l分别取鲫鱼和美国牛蛙的肝脏、肾脏、脾脏组织，然后
5、压片在载玻片上，晾干，然后染色。染色注意事项染色注意事项1载玻片必须非常洁净，中性，无油脂。不清洁或非中性的载玻片会造成细胞特别是红细胞形态发生改变，导致假性的异常形态红细胞出现。非中性的载玻片还会影响染色环境的pH值，带油脂的载玻片会使细胞分布不均匀。l2.染色过深、过浅的处理。染色过深、过浅与血涂片染色过深、过浅的处理。染色过深、过浅与血涂片中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、pH值密切相关。对于重要的标本可采用先试染的方法，值密切相关。对于重要的标本可采用先试染的方法，根据试染效果调节第二次染色方式。纠正染色过深可根据试染效果调节第二次染色
6、方式。纠正染色过深可缩短染色时间或稀释染液。纠正染色过浅可延长染色缩短染色时间或稀释染液。纠正染色过浅可延长染色时间。如果标本片有限出现了染色过深、过浅的情况，时间。如果标本片有限出现了染色过深、过浅的情况，可用如下办法挽救：染色过深可加少量缓冲液覆盖血可用如下办法挽救：染色过深可加少量缓冲液覆盖血膜部分褪色，在显微镜下观察褪色情况及时终止。染膜部分褪色，在显微镜下观察褪色情况及时终止。染色过浅可重加染色液和缓冲液复染，也要在显微镜下色过浅可重加染色液和缓冲液复染，也要在显微镜下观察及时终止。观察及时终止。(红色箭头示白细胞，兰色箭头示红细胞)中性粒C 结结 果果l红细胞橘红色，白细胞核紫色，
7、嗜酸性粒细胞鲜红色，嗜碱性粒细胞蓝紫色，中性颗粒紫或紫红色，淋巴细胞及单核细胞细胞质蓝灰色，血小板紫色。细胞形态和显微测量 细胞的显微测量需要以目镜测微尺来进行，但其分度值随着放大倍数的变化而变化，长度也不一样，因此需要事先进行标定。而镜台测微尺的长度是已知的，目镜测微尺的标定是通过镜台测微尺来进行的。细胞的显微测量细胞的显微测量0.01mm01234012345678目镜测微尺(长度随放大倍数发生改变)镜台测微尺(每一大刻度值为0.1mm，小刻度值为0.01mm)放镜台测微尺于载物台调节使镜台测微尺与目镜测微尺平行取下镜台测微尺*装入目镜测微尺记录二者在重合线之间的刻度计算标定值如在低倍镜下重合线之间目镜测微尺的长度为50格 镜台测微尺的长度为68格则：50:68=1:x x=1.36格，即目镜测微尺的1小格相当于镜台测微尺的1.36格，而镜台测微尺每1小格的长度为10um，则目镜测微尺每1小格的长度为13.6um。标定时必须严格按照操作规程，以免损坏测微尺；重合线的判断应在二者刻度线完全重合；比例式的计算；标定值只能在同一放大倍数下进行测量。目镜测微尺短轴长轴转动目镜镜筒细胞膜细胞质细胞核蛙红细胞示意图蛙红细胞示意图五、实验作业五、实验作业l一张好的血涂片的要求是什么?l绘制鲫鱼和牛蛙的血细胞。
