1、等电聚焦电泳一、一、IEFE IEFE 定义定义 IEFE一种利用具有一种利用具有pH梯度的梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。质的电泳技术。各种蛋白质各自都有一个等电点各种蛋白质各自都有一个等电点,在在一特殊的一特殊的pHpH环境中环境中,蛋白质分子呈电中性蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。在电场中不会迁移。等电聚焦就是在电泳介质中放入等电聚焦就是在电泳介质中放入载载体两性电解质体两性电解质，当通以直流电时，两性，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的加的pHpH梯度，在此体系中，不同的蛋白梯度
2、，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。焦电泳。二、二、IEFEIEFE的的特点特点（一）优点（一）优点n1.分辨率高（精密度可达分辨率高（精密度可达0.01pH单位），单位），灵敏度高（最低检出量达灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。）。n2.电泳区带相当狭窄。电泳区带相当狭窄。n3.重复性好。重复性好。（二）缺点（二）缺点n1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质
3、可能发生沉淀。白质可能发生沉淀。n2.样品中的成分必须停留在其样品中的成分必须停留在其pI，不适用不适用 在在pI不溶或发生变性的蛋白质。不溶或发生变性的蛋白质。分辨率较不连续分辨率较不连续PAGEPAGE更高，特更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。同的生物大分子。三、三、IEFE的基本原理的基本原理蛋白质分子在不同蛋白质分子在不同pH下的解离状态下的解离状态 NH3+NH3+NH2P P P COOH COO-COO-pHpI pHpI pH pI 在电泳介质中放入载体两性电在电泳介质中放入载体两性电解质，当通入直流电时，两性电解解质，当通入直
4、流电时，两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加质形成一个由正极到负极逐渐增加的的pHpH梯度，正极附近是低梯度，正极附近是低pHpH区，负区，负极附近是高极附近是高pHpH区。区。蛋白质分子的电聚焦过程蛋白质分子的电聚焦过程 +pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn-a b c n蛋白质分子在负极端n蛋白质分子在正极端n蛋白质样品中各组分聚焦成区带 +pI1当环境pI95%6.四、等点聚焦电泳的应用3.pH梯度的形成梯度的形成 载体两性电解质是一系列不同载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物分子的两性电解质的混合物,在通电在通电后，它们各自迁移到适当位置形成后，它们各自迁移到适
5、当位置形成一个连续的一个连续的pHpH梯度。梯度。pH梯度形成的过程梯度形成的过程没通电时的变化没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电，只是所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷为零。荷为零。引入电场时的变化引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。时才停止。其次一些低其次一些低pIpI的
6、载体两性电解质分子（荷的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。电荷被减少到零才停止。电泳结束后的变化电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加所有的载体两性电解质分子以增加pIpI级数级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个位置而给出一个pIpI梯度。梯度。3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。样品中的成分必须停留在其pI，不适用分析分离制备蛋白质、多肽等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：
7、抗对流3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。分辨率较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。a b c液体介质：蔗糖、Ficoll在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中，得以分离。四、等点聚焦电泳的应用同样载体两性电解质中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点处，由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个pH梯度。载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解
8、质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。三、IEFE的基本原理用多种两性电解质混合物建立稳定良好的pH梯度98HbA3 pH时，它带负电荷，朝正时，它带负电荷，朝正极移动。极移动。(图图b)pH+-bpH=pHA-当环境当环境pIpH时，它带正电荷，朝时，它带正电荷，朝负极移动，直至移动到它的等点电处，负极移动，直至移动到它的等点电处，在那里聚集。由于两性电解质在那里聚集。由于两性电解
9、质A在它的在它的pI处具有一定的缓冲能力，因此在它附近处具有一定的缓冲能力，因此在它附近形成一个形成一个pH稳定区域。（图稳定区域。（图c）pH+-cpH=pHA+同样载体两性电解质中各种两性电同样载体两性电解质中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点处，解质也会各自迁移到它们的等电点处，由于它们的数量足够多，各自的等电点由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个相差很小，从而形成一个pH梯度。（图梯度。（图d）pH+-d 假设在一个系统中含有极多的假设在一个系统中含有极多的有适当的等电点和它的等电点处有有适当的等电点和它的等电点处有一定的缓冲能力的两性电解质，因一定的缓冲能力
10、的两性电解质，因此形成的此形成的pHpH梯度将是连续平滑的梯度将是连续平滑的。pH pH梯度的选择梯度的选择 在测定未知蛋白时，可先采用在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10pH3-10的载体，经初步测定后改用的载体，经初步测定后改用较窄的以提高分辨率。较窄的以提高分辨率。（二）支持介质的选择（二）支持介质的选择n作用：防止扩散作用：防止扩散 抗对流抗对流n1.液体介质：蔗糖、液体介质：蔗糖、Ficolln2.凝胶介质：琼脂糖，葡聚糖、凝胶介质：琼脂糖，葡聚糖、PAG（三）聚焦后的检测方法（三）聚焦后的检测方法 1.各种染色法各种染色法n考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色n银染色银染色n同工酶染色同
11、工酶染色n专一蛋白染色专一蛋白染色n荧光标记以及免疫方法荧光标记以及免疫方法2.扫描与定量扫描与定量 激光光源强度大、单色性好，所以激光光源强度大、单色性好，所以对对IEFE谱带的扫描最合适。谱带的扫描最合适。注意：操作程序和条件必须严格相同注意：操作程序和条件必须严格相同3.其它检测方法n电泳转移电泳转移n双相电泳双相电泳n滴定曲线分析滴定曲线分析蛋白质样品及分离容量蛋白质样品及分离容量 1 1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 纯，分析上可用来测定混合物中某一成纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。分的相对比例。2 2、大量提纯蛋白质，则应
12、预先初步提纯。、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应 预先除去。预先除去。3 3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大，、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大，易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。碱，占据了分离的有效部位。等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：1 1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；高分离容量；2 2
13、、容量与区带高度的平方成正比，降低电、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率压可使区带变宽，提高容量，但分辨率 降低，聚焦时间长，用窄的降低，聚焦时间长，用窄的pHpH梯度范围梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。可以使区带变宽，提高分辨率。3 3、分离的容量与柱的横载面成正比，用、分离的容量与柱的横载面成正比，用440440 毫克柱时，可加粗蛋白质毫克柱时，可加粗蛋白质5 5克，每一区带克，每一区带 可达一克。可达一克。四、等点聚焦电泳的应用等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：本质：一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接
14、的pI值。3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。在pI处具有足够的电导，导电性均匀；液体介质：蔗糖、Ficoll双相电泳中，IEFE作为第一相其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。pH范围：pH310当环境pI95%6.87 95%6.87HbA2 HbA2 2 22 2 2-3%7.38 2-3%7.38HbF HbF 2 22 2 2%6.98 2%6.98HbA3 6
15、.87HbA3 6.87HbA HbA 正常成人血中主要的正常成人血中主要的HbHb成分。成分。HbAHbA2 2 正常成人正常成人HbHb中的一个次要成分，当中的一个次要成分，当 胎儿出生时，其浓度不到胎儿出生时，其浓度不到1%1%，以后，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2%2.2%至至2.6%2.6%左右，最高范围一般左右，最高范围一般 不超过不超过3.5%3.5%。HbF HbF 1866 1866年发现，是胎儿和初生儿的年发现，是胎儿和初生儿的HbHb的的主要成分，足月的初生婴儿血中大约有主要成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%70-80%
16、为为HbFHbF，其余为其余为HbAHbA。婴儿出生后婴儿出生后不久，不久，HbFHbF的浓度迅速减少，同时的浓度迅速减少，同时HbAHbA相相应增多，绝大多数正常人于出生后应增多，绝大多数正常人于出生后6 6个月个月至至2 2年后，年后，HbFHbF便降至成人的正常浓度，便降至成人的正常浓度，以后以后HbFHbF一直存在。一直存在。器材器材n电泳仪电泳仪n凝胶玻管凝胶玻管n三角烧杯三角烧杯n10cm长针头长针头试剂试剂 n分离胶缓冲液分离胶缓冲液nAcr-BisnTEMED、APnAmpholinen电极缓冲液（电极缓冲液（0.2%H2SO4、2%NaOH）在测定未知蛋白时，可先采用pH3-
17、10的载体，经初步测定后改用较窄的以提高分辨率。载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。P P P98HbA3 6.蛋白质样品中各组分聚焦成区带在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中，得以分离。在pI处具有足够的电导，导电性均匀；样品中的成分必须停留在其pI，不适用+pI1所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷为零。样品中的成分必须停留在其pI，不适用2%H
18、2SO4、2%NaOH）载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。正极端反应：6H2OO2+4H3O+4e-蛋白质样品及分离容量 1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：三、IEFE的基本原理分辨率较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。双相电泳中，IEFE作为第一相丙烯酸+多乙烯多胺 Ampholine（LKB）N
19、H3+NH3+NH2丙烯酸+多乙烯多胺 Ampholine（LKB）有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度在pI不溶或发生变性的蛋白质。载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。液体介质：蔗糖、Ficoll注意：操作程序和条件必须严格相同样品中的成分必须停留在其pI，不适用载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。测定pI可鉴定蛋白质、多肽pI2a b c蛋白质
20、样品及分离容量 1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。HbA2 正常成人Hb中的一个次要成分，当 胎儿出生时，其浓度不到1%，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自 2.1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的主要成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%为HbF，其余为HbA。当它达到净电荷是零的位置时才停止。用多种两性电解质混合物建立稳定良好的pH梯度蛋白质样品及分离容量 1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。操作操作1.凝胶的制备凝胶的制备 2.电泳电泳 3.剥胶剥胶 4.观察结果观察结果
