1、第第第第第第五五五五五五章章章章章章高效色谱分高效色谱分高效色谱分高效色谱分高效色谱分高效色谱分析法析法析法析法析法析法一、一、高效液相色谱法高效液相色谱法 概述概述二、高效液相色谱的类型二、高效液相色谱的类型及选择及选择三、高效液相色谱仪三、高效液相色谱仪四、四、液相色谱固定相液相色谱固定相五、液相色谱流动相五、液相色谱流动相六、液相色谱分析方法六、液相色谱分析方法一、一、一、一、一、一、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱p 液相色谱是如何完成混合物的分离？混合物中各组分在固定相和
2、流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离分析对象及范围流动相的选择操作条件GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小加温常压操作HPLC溶解后能制成溶液的样品，高沸点、高分子量、难气化、离子型的稳定或不稳定化合物，占有机物的80%流动相为液体或各种液体的混合。它除了起运载作用外，还可通过溶剂来控制和改进分离。室温、高压下进行二、二、二、二、二、二、高效液相色谱的类型及选择高效液相色谱的类型及选择高效液相色谱的类型及选择高效液相色谱的类型及选择高效液相色谱的类
3、型及选择高效液相色谱的类型及选择1.分配色谱（液分配色谱（液-液分配色谱）液分配色谱）p 液液分配色谱法 固定相 将特定的液态物质涂于担体表面 化学键合于担体表面而形成的有机键合层 如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基键合硅胶 固定相类型 极性固定相：正相色谱（适合于分析极性化合物）以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等键合在硅胶表面制成的 非极性固定相：反相色谱（适合于分析非极性化合物）反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。正相色谱法 反相色谱法 1.极性固定相 聚乙
4、二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物.酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出 1.非极性固定相 C18（简称ODS）、C8 2.极性流动相 水或缓冲液 3.极性调节剂 甲醇、乙腈、四氢呋喃4.分离非极性和极性较弱化合物 占整个HPLC应用的80%左右 5.组分流出顺序 极性大先洗出 液液分配色谱液液分配色谱液液分配色谱2.吸附色谱（液吸附色谱（液-固吸附色谱）固吸附色谱）p 液固吸附色谱法固定相：吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5-10m流动相：有机溶剂适用于分离分子量200-1
5、000的组分，大多数用于非离子型化合物的分离，常用于分离同分异构体。p各组分的出峰顺序 极性较小组分，吸附力较弱，容易解吸，先流出。极性较大组分滞留作用大，后流出。饱和烃 烯 芳烃 醚 醛酮 酸吸附脱附再吸附再脱附 分离过程是一个吸附脱附的平衡过程。p 液固吸附色谱法分离机理p 离子交换色谱法固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基 阳离子交换树脂在表面未端芳环上接上季胺基 阴离子交换树脂流动相：电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液2.2.2.离子交换色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法 p 离子交换色谱法 分离原理 树脂上可电离离子与流动相
6、中具有相同电荷的离子及被测组分的 离子进行可逆交换而分离。应用 离子交换色谱法主要用于分析阴，阳离子，凡是在溶剂中能够电离 的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。分析物质 有机酸、氨基酸、多肽及核酸。离子交换色谱法分离机理离子交换色谱法分离机理离子交换色谱法分离机理4.4.凝胶色谱凝胶色谱（空间排阻色谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。p 正确地选择色谱类型尽可能多的了解样品性质 化学结构 极性和稳定程度 水中和有机溶剂中溶解度 相对分子质量的大小 熟悉各种色谱类型主要特点应
7、用范围色谱类型选择色谱类型选择色谱类型选择色谱类型选择色谱类型选择色谱类型选择问题讨论问题讨论问题讨论p按固定相与流动相相对极性的不同，液液分配色谱可分为哪两类方法？现在有A、B两物质，极性AB，问在两种液液分配色谱上的出峰顺序如何？p宜用何种HPLC方法分离下列物质？(1)乙醇和丁醇；(2)Ba2+和Sr2+；(3)高摩尔质量的葡糖苷三、高效液相色谱仪三、高效液相色谱仪三、高效液相色谱仪三、高效液相色谱仪三、高效液相色谱仪三、高效液相色谱仪1.1.流程流程液相色谱法分析流程液相色谱法分析流程液相色谱法分析流程2.2.2.主要部件主要部件主要部件主要部件主要部件主要部件(1)高压输液泵高压输液
8、泵主要部件之一，压力：150350105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)采用采用“HPLC”级溶剂级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小溶剂粘度要小 与检测器相匹配与检测器相匹配溶溶 剂剂 等等 级级 水的等级水的等级 纯化水纯化水 蒸馏水蒸馏水 去离子水去离子水波长波长(nm)纯化水纯化水去离子水去离子水因为不纯物的存在，去离子水的吸光率较高因
9、为不纯物的存在，去离子水的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物纯化水中去除了无机和有机的污染物甲醇甲醇 乙睛乙睛 正己烷正己烷分析纯级分析纯级分析纯级(实线）和实线）和实线）和 HPLCHPLCHPLC级溶剂（虚线）的吸光度比较级溶剂（虚线）的吸光度比较级溶剂（虚线）的吸光度比较溶溶 剂剂 等等 级级缓冲液的使用缓冲液的使用 使用前必须过滤使用前必须过滤 使用后一定要对柱子进行清洗使用后一定要对柱子进行清洗，以免造成腐蚀、磨损及，以免造成腐蚀、磨损及 阻塞阻塞:首先用纯水冲洗首先用纯水冲洗30-60min（0.1-0.5ml/min），再），再 用甲醇冲洗用甲醇冲洗30min(0.1-0
10、.5ml/min)易受到细菌和霉菌的影响易受到细菌和霉菌的影响 溶溶 剂剂 等等 级级注意冲洗次序，不能直接用注意冲洗次序，不能直接用有机溶剂冲洗有机溶剂冲洗 过滤：过滤：0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小物理颗粒，避免堵塞色谱柱，尤目的：除去溶剂中的微小物理颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是在使用无机盐配制的缓冲液的时候必须过滤其是在使用无机盐配制的缓冲液的时候必须过滤 脱气：除去在流动相中溶解或彼此混合而产生的气泡脱气：除去在流动相中溶解或彼此混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积）泵中气泡使液流波动，改变
11、保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动）检测器中的气泡产生基线波动 无在线脱气应注意：无在线脱气应注意：1）每天脱气）每天脱气 2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长溶溶 剂剂 前前 处处 理理p配制流动相把二次蒸馏水和色谱纯级甲醇以一定比例混合取混合均匀的溶液，经0.45m的有机膜过滤，再脱气15分钟即可选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的
12、几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器
13、时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。六、液相色谱分析方法六、液相色谱分析方法六、液相色谱分析方法六、液相色谱分析方法六、液相色谱分析方法六、液相色谱分析方法色谱分析的目的对未知组分进行定性分析对已知组分进行定量分析根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰在检测器上的响应强度，对该谱峰初步定性和定量分析。鉴别每个色谱峰通过比较保留值通过比较保留值(通常是保留时间通常是保留时间)的方法，找的方法，找到各色谱峰所对应的组份到各色谱峰所对应的组份大多数情况下用比较保留时间来定性大多数情况下用比较保留时间来定性即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间相同，可能是同样的组份保
14、留时间不同，肯定不是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份1 已知物保留值直接对照法定性未知峰保留值(tR)与某标准物完全相同，可初步确定为同一物质改变色谱柱或流动相组成，二者保留值仍完全相同，则可认定为同一物质优点：简单缺点：适用范围窄；必须有标准物质用“标样”的保留值定出被测组份的位置0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00AUMinutesUracilEthylparabenPropylparaben2 利用文献保留值数据进行比对定性
15、文献报道的保留值数据只能作为定性参考，液相色谱柱填柱技术复杂，重现性差；条件不允许，难以得到相同色谱条件（仪器色谱柱、试剂等）可根据文献数据和对照品选用已知标准物，再用已知标准物进行定性3 利用已知物增加峰高法定性将已知标准物质加到待测样品，若某一峰增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使该峰增高，则可基本认定该峰与已知标准物为同一物质。如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同的保留值，则保留值定性准确度存在疑问红外光谱、紫外光谱、核磁共振波谱和质谱对有机化合物有很强的定性能力，可用于定性HPLC-紫外光谱已作为液相色谱的常规检测器使用；HPLC-MS
16、和HPLC-NMR也十分成熟。在定性的基础上定量在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物需有纯物质作为标准物 液相色谱定量是相对定量的方法液相色谱定量是相对定量的方法:即由已知量的纯标样推算混合物中被测物的量即由已知量的纯标样推算混合物中被测物的量 液相色谱法定量的依据是液相色谱法定量的依据是:被测组分的量与响应值被测组分的量与响应值(峰高或峰面积峰高或峰面积)成正比成正比由已知量的标样可求得定量校正因子由已知量的标样可求得定量校正因子定量校正因子定量校正因子:是定量计算公式中的比例常数是定量计算公式中的比例常数,其其物理意义是单位响应值物理意义是单位响应值(峰面积峰面积)所代表的被测所代表的
17、被测组分的量组分的量测定未知组分的响应值测定未知组分的响应值,通过定量校正因子即可通过定量校正因子即可求得其含量求得其含量常用定量分析方法归一化法标准曲线法内标法按测量参数分为按测量参数分为峰面积法和峰高法项目内容定量方法归一化法要求1、样品中各组分均出峰，完全分离，且均有响应；2、进样量无须准确。计算公式方法特点优点：简便、精确，进样量的多少与测定结果无关，操作条件（如流速，柱温）的变化对定量结果的影响较小。但由于液相色谱所用检测器为选择性检测器，对很多组分没有响应，因此液相色谱法较少使用归一化法。%100iiiAAw1.1.1.归一化法归一化法归一化法归一化法归一化法归一化法p用高效液相色
18、谱法测定吲哚二羧酸中主成分的含量，已知在分析条件下所有组分都出峰，且分离完全，根据测定数据计算吲哚羧酸中主成分（出峰时间在5.7min左右）的含量。序号12345保留时间/min3.543.964.825.727.15峰面积/mVmin762011694460553251064372%47.994372532510646051169476205325106AAwi4解：2.2.2.外标法外标法外标法外标法外标法外标法p工作曲线法p外标一点法配制一系列已知浓度的标样 实际色谱图05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样品浓度响应值峰面积()0.0 00.
19、0 50.1 00.1 50.2 00.2 50.3 00.0 00.5 01.0 01.5 02.0 02.5 03.0 03.5 04.0 04.5 05.0 05.5 06.0 06.5 07.0 0M in u te s0.0 00.0 50.1 00.1 50.2 00.2 50.3 00.0 00.5 01.0 01.5 02.0 02.5 03.0 03.5 04.0 04.5 05.0 05.5 06.0 06.5 07.0 0M in u te s0.0 00.0 50.1 00.1 50.2 00.2 50.3 00.0 00.5 01.0 01.5 02.0 02.5 0
20、3.0 03.5 04.0 04.5 05.0 05.5 06.0 06.5 07.0 0M in u te s标准曲线 计算公式 特点 无需各组份都被检出、洗脱 需要标样 标样及样品测定的条件要一致 进样体积要准确iXiiiXARFCXRXCRFii样品响应值未知组分的浓度标样响应值标样浓度校正因子)()()()(内标法定量内标法定量内标法定量 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样 实际色谱图0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.503.003.504.004.505.005.506.00voltsMinutesM ethylParabenEthylParabenPropylParabenButylParaben05010015020025001020304050样品浓度标样峰面积内标样峰面积标准曲线 计算公式：特点：无需各组份都被检出、洗脱 需要标样，需要内标样 结果与进样体积无关.)()()()().(siiXiiiXAARFCXCXRSIRRFii内标峰面积样品峰面积未知组分的浓度标样浓度标样响应值内标样响应值校正因子 对内标物的要求 化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)在样品中不存在 不与样品中组份发生任何化学反应 保留值与待测组分接近 浓度（响应值）与待测组分相当 其色谱峰与其他色谱峰分离好
