1、实验实验 双缩脲法测定蛋白质浓度双缩脲法测定蛋白质浓度实验目的实验目的1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习蛋白质含量测定的常见方法及原理3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法一、分光光度法测定的原理和方法一、分光光度法测定的原理和方法一、分光光度法的基本原理一、分光光度法的基本原理 根据物质对光的选择性吸收（吸收光谱），对物质进行定性定量分析。二、吸收光谱二、吸收光谱主要分为：红外吸收光谱：红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.5-1000m，主要用于有机化合物结构鉴定。紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200-400nm，可用于结构鉴定和定量分析。可见吸收光
2、谱：可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400-750nm，主要用于有色物质的分析。三、分光光度法的主要研究方式三、分光光度法的主要研究方式1.比较吸收光谱曲线比较吸收光谱曲线2.比较最大吸收波长比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。3.比较吸光度的比值比较吸光度的比值纯DNA8.1280260nmnmAA四、分光光度仪的工作原理四、分光光度仪的工作原理五、分光光度仪进行定量的原理五、分光光度仪进行定量的原理Beer-Lambert（比尔）定律：T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=CL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为
3、透射光强度；为摩尔消光系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度六、定量的常用方法六、定量的常用方法（1）标准曲线法）标准曲线法 标准曲线与样品的测定条件必须一致。（2）标准管法）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。（3）摩尔吸光系数法）摩尔吸光系数法C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。二、蛋白质含量测定的常见方法及原理二、蛋白质含量测定的常见方法及原理微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。消化后在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使
4、硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。紫外分光光度法测定蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗
5、样品、可回收利用、低浓度盐类不干扰测定。缺点在于对测定哪些与标准蛋白质酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差；而样品中如果含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大干扰。双缩脲法测定蛋白质双缩脲法测定蛋白质*蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此可以发生双缩脲反应：H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 在碱性溶液中，双缩脲能与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比。双缩脲法测定蛋白质范围1-10mg。双缩脲法测定蛋白质双缩脲法测定蛋白质*双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成
6、无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同；重复性好，干扰少，常见干扰大多可以避免；使用单一的稳定试剂，操作简便、快速，适于手工和自动化分析。缺点是灵敏度较低。但检出限为0.21.7mg蛋白质/ml，这相当于70g/L的血清324L，已能满足临床生化检验的需要。因此，是临床测定血清总蛋白质首选的最方便、实用的常规方法。Folin-酚试剂法酚试剂法(Lowry法法)测定蛋白质浓度测定蛋白质浓度 Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高
7、、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰（Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸）。Folin-酚试剂包括甲、乙试剂。其中乙试剂仅在酸性PH下稳定，但上述还原反应只在pH10的情况下发生，故乙试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应能发生。考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法
8、灵敏4倍）。强碱性缓冲剂和去污剂会有颜色干扰，可校正。但大量去污剂的影响不易消除。Coomassie Dye-Based 蛋白质定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein-DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+总蛋白定量分析总蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）二辛可宁酸、二羧基二喹啉）准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20g/ml快速：45分钟内完
9、成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝 基本原理：基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。三、双缩脲法测定蛋白质含量三、双缩脲法测定蛋白质含量一、操作步骤一、操作步骤1.取15支试管，按下表编号、加试剂管号0123456样品牛血清白蛋白(mg)00.61.22.43.64.86.02mg/mL牛血清白蛋白体积(mL)00.30.
10、61.21.82.43.0待测液体积(mL)3.0*蒸馏水(mL)3.02.72.41.81.20.600OD5402.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应30min。3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。二、结果处理二、结果处理1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。三、注意事项三、注意事项1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。3.比色杯的使用。四、分
11、光光度计的使用仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式 透射比（T）、吸光度（A）、已知样品浓度值（C）、已知标准样品斜率（F）“100%”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上按“方式键”（MODE）将测试方式设置为透射比（T）将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿和黑体分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖盖好样品室盖，将黑体推或拉入光路，按“0%”键调透射比零将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%”调100.0按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度（A）将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。校正校正测定测定
