1、第五讲第五讲 酶分子修饰酶分子修饰讲课：阳讲课：阳 飞飞系部：生化系系部：生化系作业作业第五讲第五讲 酶分子修饰酶分子修饰教学目标：教学目标：了解有关酶分子修饰的重要应用以及酶分子的物理修饰作用了解有关酶分子修饰的重要应用以及酶分子的物理修饰作用理解蛋白酶化学修饰的方法和意义理解蛋白酶化学修饰的方法和意义掌握酶分子化学修饰的形式、目的、原理与特点掌握酶分子化学修饰的形式、目的、原理与特点 教学重点：教学重点：酶分子化学修饰的方法和意义、酶分子化学修饰的形式酶分子化学修饰的方法和意义、酶分子化学修饰的形式教学难点：教学难点：化学修饰的原理与特点化学修饰的原理与特点第五讲第五讲 酶分子修饰酶分子修
2、饰5.15.1、酶分子修饰的定义及其意义、酶分子修饰的定义及其意义5.25.2、酶分子修饰方法、酶分子修饰方法 5.35.3、酶修饰后的性质变化、酶修饰后的性质变化 5.45.4、酶的分子定向进化、酶的分子定向进化分析酶在工业生产中应用受到极大限制的原因？分析酶在工业生产中应用受到极大限制的原因？热稳定性差热稳定性差活力低活力低耐受耐受pHpH范围窄范围窄分子量过大分子量过大成本高成本高来源有限来源有限有异体反应有异体反应酶的应用受到了很大限制促使科研工作者必须不断地开展新的研酶的应用受到了很大限制促使科研工作者必须不断地开展新的研究，用化学或分子生物学方法究，用化学或分子生物学方法对酶分子进
3、行改造对酶分子进行改造，以，以满足各种满足各种反应条件对酶的需求反应条件对酶的需求，克服天然酶的缺陷克服天然酶的缺陷。随着各个学科及相关技术的发展，特别对酶结构与随着各个学科及相关技术的发展，特别对酶结构与功能的深入功能的深入了解了解、基因工程及固定化技术的普及，、基因工程及固定化技术的普及，酶的分子改造工程进入酶的分子改造工程进入实用实用阶段。阶段。总体来说酶的分子工程分两部分：总体来说酶的分子工程分两部分：分子生物学水平分子生物学水平：即用基因工程方法对即用基因工程方法对DNADNA进行分进行分子改造，以获得化学结构更合理的酶蛋白；子改造，以获得化学结构更合理的酶蛋白；对天然酶分子进行改造
4、对天然酶分子进行改造：包括酶一级结构中氨基包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等。5.15.1、酶分子修饰的定义及其意义、酶分子修饰的定义及其意义1、定义：、定义：通过通过各种方法各种方法使使酶分子的结构酶分子的结构发生发生某些改变某些改变，从而从而改变酶的某些特性和功能改变酶的某些特性和功能的技术过程。的技术过程。即在体外将酶分子通过即在体外将酶分子通过人工的方法人工的方法与一些化学基团（物质），与一些化学基团（物质），特别是特别是具有生物相容性的物质具有生物相容性的物质，进行，进行共价连接共价连接，从而改变酶的结构，从而改变酶的结构和性质。
5、和性质。讨论讨论:自然界中存在酶分子改造修饰吗？自然界中存在酶分子改造修饰吗？酶原激活酶原激活可逆共价调节可逆共价调节l胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原 l磷酸化酶磷酸化酶a与磷酸化酶与磷酸化酶b互变互变 2 2、酶分子修饰的意义、酶分子修饰的意义增强酶的增强酶的稳定性（稳定性（stability）提高酶的提高酶的活力（活力（activity）降低或消除酶的降低或消除酶的抗原性（抗原性（immunological property）研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子
6、空间构象（各种物理因素对酶分子空间构象（structure）的影响的影响3 3、酶分子修饰的基本要求和条件、酶分子修饰的基本要求和条件（1 1）对酶性质的了解：）对酶性质的了解：酶的稳定性：热稳定性、酸碱稳定性、抑制剂等酶的稳定性：热稳定性、酸碱稳定性、抑制剂等酶活性中心的状况：活性中心基团、辅因子以及分子大小、性状、亚基数酶活性中心的状况：活性中心基团、辅因子以及分子大小、性状、亚基数（2 2）对修饰剂的要求：）对修饰剂的要求：良好的生物相容性和水溶性良好的生物相容性和水溶性修饰剂的相对分子质量（较大）、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性修饰剂的相对分子质量（较大）、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附
7、性修饰剂上反应基团的数目及位置修饰剂上反应基团的数目及位置修饰剂上反应基团的活化方法与条件修饰剂上反应基团的活化方法与条件（3 3）对酶反应条件的选择：）对酶反应条件的选择：反应体系中酶与修饰剂的分子比例反应体系中酶与修饰剂的分子比例反应体系中的溶剂性质、盐浓度和反应体系中的溶剂性质、盐浓度和pHpH条件条件反应温度及时间反应温度及时间5.25.2、酶分子的修饰方法、酶分子的修饰方法 物理修饰：物理修饰：不改变酶的组成单位及其基团的修饰，即酶分子中的不改变酶的组成单位及其基团的修饰，即酶分子中的共价共价键不发生改变键不发生改变，只是在，只是在物理因素（高温、高压、高盐、物理因素（高温、高压、高
8、盐、极端极端pHpH值）作用下，副键发生某些变化和重排值）作用下，副键发生某些变化和重排。化学修饰：化学修饰：广义广义:指凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的指凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的转变。转变。狭义狭义:指在指在较温和的条件下较温和的条件下以以可控可控的方式使一种蛋白质的方式使一种蛋白质与某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残与某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生基或其功能基团发生共价共价的化学变化。的化学变化。一、影响酶分子化学修饰的主要因素一、影响酶分子化学修饰的主要因素1 1、酶蛋白功能基团的反应性、酶蛋白功能基团的反应性蛋白质功能基
9、团所处的环境蛋白质功能基团所处的环境会强烈地影响它的物理和化学会强烈地影响它的物理和化学性质性质蛋白质分子的表面特点蛋白质分子的表面特点也影响化学试剂的接近也影响化学试剂的接近 因此，有必要考察因此，有必要考察局部衡区局部衡区对功能基和修饰剂的影响。对功能基和修饰剂的影响。由于功能基的反应性是通过它的由于功能基的反应性是通过它的亲核性亲核性来测量的，应来测量的，应当当强调强调pKapKa和影响和影响pKapKa的因素的因素。2 2、修饰剂的反应性、修饰剂的反应性 1 1、影响酶蛋白功能基团的反应性因素、影响酶蛋白功能基团的反应性因素微区的极性微区的极性基团间的氢键基团间的氢键静电效应静电效应位
10、阻效应位阻效应其它其它电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度微区的极性微区的极性微区的极性微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。极是决定基团解离状态的关键因素之一。极性对整个反应速度影响与性对整个反应速度影响与反应的类型反应的类型有密切关系。有密切关系。从整体看来，局部极性的改变对从整体看来，局部极性的改变对色氨酸、甲硫氨酸色氨酸、甲硫氨酸和和胱氨酸胱氨酸反应性的影响较小反应性的影响较小对对氨基氨基和和组氨酸组氨酸反应性的影响较大反应性的影响较大对对酪氨酸、半胱氨酸酪氨酸、半胱氨酸和和羧基羧基的反应性影响最大的反应性影响最大基团间的氢键作用基
11、团间的氢键作用在蛋白质的酚基在蛋白质的酚基-羧基相互作用中，羧基的羧基相互作用中，羧基的pKapKa应比正常值应比正常值低，而酚基的低，而酚基的pKapKa高于正常值。高于正常值。OHOOCOOHOHC1/2-1/2-+H+静电效应静电效应用高分辨率的核磁共振用高分辨率的核磁共振组氨酸残基组氨酸残基的电离行为进的电离行为进行研究表明，不同蛋白质中的行研究表明，不同蛋白质中的组氨酸残基组氨酸残基的的pKapKa是不同的；是不同的；原因可能在于原因可能在于带电基团相互静电作用的影响带电基团相互静电作用的影响。位阻效应位阻效应烷基烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能基在空间上紧靠功能基，会使
12、修饰剂不能与功能基接触，出现接触，出现位阻效应位阻效应。对对枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶BPNBPN的的X X射线衍射研究指出：射线衍射研究指出：1010个酪个酪氨酸残基均在蛋白质分子表面氨酸残基均在蛋白质分子表面，而且苯酚的羟基几，而且苯酚的羟基几乎在所有情况下都乎在所有情况下都没有形成氢键没有形成氢键。对它进行。对它进行彻底硝彻底硝化和碘化化和碘化后，后，1010个酪氨酸中只有个酪氨酸中只有8 8个被修饰个被修饰。若没。若没有有X X射线衍射研究结果，很可能解释为至少有射线衍射研究结果，很可能解释为至少有2 2个酪个酪氨酸残基氨酸残基被包埋在分子内部被包埋在分子内部，但实际情况并不是这，但
13、实际情况并不是这样的，这种情况很可能是空间障碍引起的。样的，这种情况很可能是空间障碍引起的。旋转自由度旋转自由度加快修饰反应速度的一个重要原因是限制了构象的加快修饰反应速度的一个重要原因是限制了构象的总数总数(即即限制了旋转自由度限制了旋转自由度)，这种限制可能是由，这种限制可能是由于上述提及的几类于上述提及的几类相互作用相互作用引起的。引起的。酚酸的酯化速度酚酸的酯化速度：在苯环上引入几个甲基，特别是在同一碳原子上引入2个甲基，则限制了基团的自由旋转，因而使酚酸的酯化速度常数提高了108倍以上。2 2、影响修饰剂反应性的因素、影响修饰剂反应性的因素选择吸附选择吸附静电相互作用静电相互作用位阻
14、因素位阻因素催化因素催化因素选择吸附选择吸附化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点选择性地吸选择性地吸附附在低极性区或高极性区，有时可以根据对速度在低极性区或高极性区，有时可以根据对速度的饱和效应，检测出的饱和效应，检测出蛋白质蛋白质-修饰剂复合物修饰剂复合物的形成。的形成。正像正像酶酶-底物复合物底物复合物那样，蛋白质修饰剂复合物形成那样，蛋白质修饰剂复合物形成后，修饰过程的速度就加强了，这种速度的加强，后，修饰过程的速度就加强了，这种速度的加强，部分是由于选择性吸附的结果。部分是由于选择性吸附的结果。静电相互作用静电相互作用带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质
15、表面带相反带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位，电荷的部位，静电相互作用静电相互作用可使修饰剂向多功能部可使修饰剂向多功能部位中的一个残基定位或向双功能基的一侧定位。修位中的一个残基定位或向双功能基的一侧定位。修饰剂的静电取向也是影响其反应性的一个因素。饰剂的静电取向也是影响其反应性的一个因素。碘乙酸碘乙酸和和碘乙酰胺碘乙酰胺烷基化速度和烷基化部位差异烷基化速度和烷基化部位差异此外，此外，静电排斥力静电排斥力能抑制修饰作用。能抑制修饰作用。位阻因素位阻因素蛋白质表面的位阻因素或者底物、辅因子、抑制剂所蛋白质表面的位阻因素或者底物、辅因子、抑制剂所产生的产生的位阻因素位阻因素
16、都可能阻止修饰剂与功能基的正常都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。但修饰的结果却能提供有关蛋白质表面的有反应。但修饰的结果却能提供有关蛋白质表面的有用信息。用信息。用用a溴代丁酸溴代丁酸可烷基化可烷基化核糖核酸酶核糖核酸酶第第l2号组氨酸，而号组氨酸，而且反应进行很快；且反应进行很快；若用若用a溴代戊酸溴代戊酸作修饰剂，则很难进行反应；作修饰剂，则很难进行反应；若用若用a溴代己酸溴代己酸作修饰剂，则不能发生烷化反应。作修饰剂，则不能发生烷化反应。催化因素催化因素修饰部位的其他功能基，如果是产生一般的修饰部位的其他功能基，如果是产生一般的酸碱催化酸碱催化作用作用，则也能影响修饰反应。不同的修饰剂
17、，其反，则也能影响修饰反应。不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有明显差异。应速度和反应部位有明显差异。对硝基苯乙酸盐对硝基苯乙酸盐和和苯乙酸盐苯乙酸盐对对胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶的的活性丝活性丝氨酸氨酸的的乙酰化乙酰化属于同一机理，但苯乙酸盐的反应性属于同一机理，但苯乙酸盐的反应性差，这在较大程度上与酶的酸碱催化有关。差，这在较大程度上与酶的酸碱催化有关。氟磷酸盐氟磷酸盐与与氯磷酸盐氯磷酸盐相比，对相比，对丝氨酸酶丝氨酸酶有非常高的反有非常高的反应性，这可能与一般酸碱催化除去氟原子有关。应性，这可能与一般酸碱催化除去氟原子有关。3 3、修饰反应专一性的控制、修饰反应专一性的控制(1)(1)试剂
18、的选择试剂的选择 (2)(2)反应条件的选择反应条件的选择(3)(3)反应的专一性反应的专一性(1)(1)试剂的选择试剂的选择 一般来说，选择蛋白质修饰剂要考虑以下问题：一般来说，选择蛋白质修饰剂要考虑以下问题：修饰反应要完成到什么程度修饰反应要完成到什么程度对个别氨基酸是否专一对个别氨基酸是否专一在反应条件下，修饰反应有没有限度在反应条件下，修饰反应有没有限度修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变是否需要分离修饰后的衍生物是否需要分离修饰后的衍生物反应是否可逆反应是否可逆是否适合于建立快速、方便的分析方法是否适合于建立快速、方便的分析方法蛋白质的蛋白质的空间结构
19、空间结构和试剂的和试剂的空间结构空间结构之间的之间的相互影相互影响响也能加强修饰反应速度和反应的专一性。也能加强修饰反应速度和反应的专一性。对对核糖核酸酶核糖核酸酶A A第第119119号号组氨酸和组氨酸和第第l2l2号号组氨酸的修组氨酸的修饰，使用不同的试剂，这两个残基的反应速度就饰，使用不同的试剂，这两个残基的反应速度就不同。不同。烷基化反应在烷基化反应在第第l2l2号号组氨酸；羧甲基化反组氨酸；羧甲基化反应应选择性修饰第选择性修饰第119119号组氨酸号组氨酸。一般来说，一般来说，试剂的体积小一些为宜试剂的体积小一些为宜，这样既能保证，这样既能保证修饰反应顺利进行，又可减少因空间障碍而破
20、坏修饰反应顺利进行，又可减少因空间障碍而破坏蛋白质分子严密结构的危险。蛋白质分子严密结构的危险。(2)(2)反应条件的选择反应条件的选择 蛋白质与修饰剂作用所要求的反应条件，除允许能顺利进蛋白质与修饰剂作用所要求的反应条件，除允许能顺利进行外，还必须满足以下要求：行外，还必须满足以下要求：一是不造成蛋白质的不可逆变性（一是不造成蛋白质的不可逆变性（做对照实验做对照实验）；）；二是有利于专一性修饰蛋白质（二是有利于专一性修饰蛋白质（反应的温度、反应的温度、pHpH、反应介质、反应介质、缓冲液缓冲液）。）。氯离子氯离子能够抑制能够抑制碳酸酐酶的酯酶碳酸酐酶的酯酶活力，所以修饰反应缓冲液活力，所以修
21、饰反应缓冲液中不能含有氯离子；中不能含有氯离子；磷酸盐磷酸盐是某些酶的竞争抑制剂，该离子的结合可能会封闭修是某些酶的竞争抑制剂，该离子的结合可能会封闭修饰部位；饰部位；钙离子钙离子对对-淀粉酶的激活作用。淀粉酶的激活作用。(3)(3)反应的专一性反应的专一性利用蛋白质分子中某些基团的特殊性：利用蛋白质分子中某些基团的特殊性：二异丙基氟磷酸酯二异丙基氟磷酸酯(DEP)能与能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用作用迅速导致酶失活，但迅速导致酶失活，但DEP在同样条件下却不能与在同样条件下却不能与胰凝乳蛋胰凝乳蛋白酶原白酶原及一些简单的模拟化合物作用；及一些简单的模拟化合物作用；选
22、择不同的反应选择不同的反应pH值：值：蛋白质分子中各功能基的解离常数蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)是不同的。如用溴是不同的。如用溴(碘碘)代乙酸代乙酸(或其酰胺或其酰胺)对蛋白质进行修饰时：对蛋白质进行修饰时：当反应当反应pH值为值为6时，只专一与时，只专一与组氨酸的咪唑基组氨酸的咪唑基作用；作用；当反应当反应pH值为值为3时，则专一与时，则专一与甲硫氨酸侧链甲硫氨酸侧链作用。作用。反应的专一性反应的专一性利用某些产物的不稳定性：利用某些产物的不稳定性：在高在高pHpH值下，用值下，用二硫化碳、二硫化碳、O O一甲基异脲和亚氨酸一甲基异脲和亚氨酸等可将等可将氨基氨基转变成脲和胍的衍生
23、物转变成脲和胍的衍生物。虽然。虽然巯基巯基也能与上述试剂作用，也能与上述试剂作用，但因但因pHpH值高，与巯基形成的产物可被迅速分解。值高，与巯基形成的产物可被迅速分解。亲和标记：亲和标记：实现专一性修饰的重要途径，亲和标记试剂除了实现专一性修饰的重要途径，亲和标记试剂除了能与蛋白质能与蛋白质作用作用外，还要求外，还要求试剂的结构和与蛋白质作用的底物或抑制试剂的结构和与蛋白质作用的底物或抑制剂相似剂相似。在作用前试剂是先以在作用前试剂是先以非共价键非共价键形式结合到蛋白质的活性部位形式结合到蛋白质的活性部位上，然后再发生上，然后再发生化学作用化学作用，将试剂置于活性部位基团上。，将试剂置于活性
24、部位基团上。对甲基苯磺酰氟对甲基苯磺酰氟能作用于能作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸。反应的专一性反应的专一性差别标记：差别标记：在在底物或抑制剂底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们存在下进行化学修饰时，由于它们保护着蛋白质的保护着蛋白质的活性部位基团活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用，然后将过量的底，使这些基团不能与试剂作用，然后将过量的底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质再与含同位素标再与含同位素标记的同样试剂作用记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制剂保护的基团，结果只有原来被底物或抑制剂保护的基团是带放射性
25、同位素标记的。用这一方法可直接得到蛋白质发挥是带放射性同位素标记的。用这一方法可直接得到蛋白质发挥功能作用的功能作用的必需基团必需基团；利用蛋白质状态的差异：利用蛋白质状态的差异：有时在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。有时在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。核糖核酸酶核糖核酸酶在在晶体状态下晶体状态下进行进行羧甲基化羧甲基化时，反应主要集中在第时，反应主要集中在第119号组氨酸上，对第号组氨酸上，对第12号组氨酸修饰很少，两者之比为号组氨酸修饰很少，两者之比为60：1；但；但在水溶液在水溶液中进行同样的修饰，两者之比为中进行同样的修饰，两者之比为15：1。4 4、修饰程度和修
26、饰部位的测定、修饰程度和修饰部位的测定(1)(1)分析方法：分析方法：光谱法：光谱法：要求修饰后的衍生物具有独特的光谱或它的光谱与要求修饰后的衍生物具有独特的光谱或它的光谱与修饰剂的不同；修饰剂的不同；间接法：间接法：同位素标记、有色修饰剂的光谱强度、顺磁共振谱、同位素标记、有色修饰剂的光谱强度、顺磁共振谱、荧光标记。荧光标记。(2)(2)化学修饰数据的分析：化学修饰数据的分析：时间进程分析获得时间进程曲线，可以了解修饰残基的性质时间进程分析获得时间进程曲线，可以了解修饰残基的性质和数目以及修饰残基与蛋白质生物活性之间的关系等；和数目以及修饰残基与蛋白质生物活性之间的关系等；确定必需基团的性质
27、和数目：邹氏作图法（确定必需基团的性质和数目：邹氏作图法（19621962年邹承鲁）年邹承鲁）二、酶分子的化学修饰二、酶分子的化学修饰1 1、金属离子置换修饰、金属离子置换修饰2 2、大分子结合修饰、大分子结合修饰(共价共价/非共价非共价)3 3、侧链基团修饰、侧链基团修饰4 4、肽链有限水解修饰、肽链有限水解修饰5 5、氨基酸置换修饰、氨基酸置换修饰1 1、金属离子置换修饰、金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。酶的特性和功能发生改变的修饰方法。-淀粉酶中的钙离子（淀粉酶中的钙离子（Ca2+）谷氨
28、酸脱氢酶中的锌离子谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)过氧化氢酶分子中的亚铁离子过氧化氢酶分子中的亚铁离子(Fe2+)酰基氨基酸酶分子中的锌离子（酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)酶的金属离子置换修饰酶的金属离子置换修饰若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的若用
29、另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。金属离子置换修饰的过程金属离子置换修饰的过程：酶的分离纯化：酶的分离纯化：首先将欲进行修饰酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液；首先将欲进行修饰酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液；除去原有金属离子：除去原有金属离子：加入一定量的金属螯合剂（如乙二胺四乙酸（加入一定量的金属螯合剂（如乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）等）使酶分子中的金）等）使酶分子中的金属离子与螯合剂
30、形成螯合物，通过透析、超滤、分子筛层析等方法将金属螯合属离子与螯合剂形成螯合物，通过透析、超滤、分子筛层析等方法将金属螯合物从酶液中除去，酶往往成为无活性状态；物从酶液中除去，酶往往成为无活性状态；加入置换离子：加入置换离子：在去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属在去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。注：注：金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶；金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有
31、金属离子的酶；用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。2 2、大分子结合修饰、大分子结合修饰一、非共价修饰一、非共价修饰二、共价修饰二、共价修饰一、非共价修饰一、非共价修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，既能通过加物，既能通过氢键氢键固定在酶分子表面，也能通过固定在酶分子表面，也能通过氢键氢键有效地有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。与外部水相连，从而保护酶的活力。一类添加物一类添加物通过调节酶的微环境来保护酶的活力，通过调节酶的微环境来保
32、护酶的活力，如多元醇、多如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等；糖、多聚氨基酸、多胺等；一类添加物一类添加物通过分子之间相互作用排除表面区域内的水分子通过分子之间相互作用排除表面区域内的水分子，从，从而增加其稳定性，如而增加其稳定性，如蛋白质蛋白质。二、共价修饰二、共价修饰用可溶性大分子通过用可溶性大分子通过共价键共价键连接于酶分子的表面，形成一连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。层覆盖层。用用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，降低或消除酶的抗原性，提高了抗，降低或消除酶的抗原性，提高了抗蛋白酶能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。蛋白酶能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高
33、了酶药效。1 1分子分子核糖核酸酶核糖核酸酶与与6.56.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的原有酶活力的2.252.25倍；倍；1 1分子分子胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶与与1111分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的力的5.15.1倍。倍。聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇是线性分子具有良好的聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性生物相容性和水溶性，在体内在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，使其末端活化
34、后可以与酶产生交联，因而，被广泛用于酶的修饰。被广泛用于酶的修饰。酶酶 半衰期半衰期相对稳定性相对稳定性 天然天然SOD 6 min 1 右旋糖酐右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇聚乙二醇-SOD 35 h 350大分子共价修饰过程：大分子共价修饰过程：修饰剂的选择修饰剂的选择：根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子水溶性大分子。如聚乙二醇（。如聚乙二醇（PEGPEG）、）、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、环状糊精、肝素、
35、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。修饰剂的活化：修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起，在作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起，在使用之前一般需要经过使用之前一般需要经过活化活化，然后才可以与酶分子的某，然后才可以与酶分子的某侧链基团侧链基团进行反应。进行反应。修饰：修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、定的温度、pHpH值等条件下反应
36、一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以团以共价键结合共价键结合，对酶分子进行修饰。，对酶分子进行修饰。分离：分离：需要通过需要通过凝胶层析凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。有较好修饰效果的修饰酶。3 3、氨基酸残基侧链基团的化学修饰、氨基酸残基侧链基团的化学修饰采用一定的采用一定的化学方法化学方法使使酶蛋白的侧链基团发酶蛋白的侧链基团发生改变生改变，从而改变酶分子的特性和功能，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。
37、的修饰方法。酶蛋白的侧链基团酶蛋白的侧链基团指指组成蛋白质的氨基酸残组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团基上的功能团。主要包括。主要包括等。这些基团可以形等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。变酶的特性和功能。用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响酶的结构、特性和功能的影响。在研究。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。酶的活性中心
38、中的必需基团时经常采用。氨基酸残基：氨基酸残基：活性中心活性中心7种氨基酸种氨基酸出现的频率最高出现的频率最高：Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr、Ser；根据氨基酸侧链根据氨基酸侧链R基的极性，基的极性，20种氨基酸可分成种氨基酸可分成4类：类：非极性非极性R基氨基酸（共基氨基酸（共8种）：种）：Ala、Leu、Val、Ile、Phe、Try、Met、Pro；中性的极性中性的极性R基氨基酸（共基氨基酸（共7种）：种）：Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gly、Gln；带正电荷的极性带正电荷的极性R基氨基酸（共基氨基酸（共3种）：种）：Lys、Arg、His；带负电荷的极性带
39、负电荷的极性R基氨基酸（共基氨基酸（共2种）：种）：Asp、Glu。催化活性催化活性/非催化活性基团的修饰非催化活性基团的修饰对非催化基团修饰可对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力底物的束缚能力。经常被修饰的残基有：。经常被修饰的残基有：亲核的亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His亲电的亲电的Tyr、Trp对催化活性基团可以通过对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分选择性修饰侧链成分来实现氨基来实现氨基酸的取代。酸的取代。讨论：酶的修饰反应的主要类型讨论：酶的修饰反应的主要类型?酰化反应酰化反应烷基化反应烷基化反应氧化
40、和还原反应氧化和还原反应芳香环取代反应芳香环取代反应(1)(1)酰化反应酰化反应化学修饰试剂有乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐化学修饰试剂有乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，在甲基异脲等，在室温室温(2025)、pH值为值为4.59.0的条件下可与酶的条件下可与酶分子的某些侧链基团发生酰基化反应。分子的某些侧链基团发生酰基化反应。作用于酶分子侧链基团有作用于酶分子侧链基团有氨基、羟基、巯基氨基、羟基、巯基以及以及酚酚基基等。等。(2)(2)烷基化反应烷基化反应饰试剂的特点常常是饰试剂的特点常常是带有活泼的卤素原子带有活泼的卤素原子，
41、由于卤素，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致酶分子的亲核基团致酶分子的亲核基团(例如例如-NH：、：、-SH等等)发生烷基发生烷基化。化。修饰试剂：修饰试剂：2，4-二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺、二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物和碘甲烷等。苯甲酰卤代物和碘甲烷等。作用于分子的侧链基团有作用于分子的侧链基团有氨基、巯基、羧基、硫醚基氨基、巯基、羧基、硫醚基和和咪唑基咪唑基等。等。(3)(3)氧化和还原反应氧化和还原反应氧化性试剂有氧化性试剂有H202、N-溴代琥珀酰亚胺等。易受氧化作用的溴代琥珀酰亚胺等。易受氧化作
42、用的侧链基团有侧链基团有巯基、硫醚基、吲哚基、咪唑基巯基、硫醚基、吲哚基、咪唑基以及以及酚基酚基等。等。有些试剂具有很强的氧化性，往往容易使肽链断裂，因此有些试剂具有很强的氧化性，往往容易使肽链断裂，因此在修饰反应中要控制好氧化条件。在修饰反应中要控制好氧化条件。光敏剂光敏剂存在下的光氧化存在下的光氧化是一种比较温和的氧化作用。值得提出的是是一种比较温和的氧化作用。值得提出的是连四硫酸钠连四硫酸钠或或连四硫酸钾连四硫酸钾(tetrathionate)是一种温和的氧化剂，因此在是一种温和的氧化剂，因此在化学修饰反应中常用来作为化学修饰反应中常用来作为巯基巯基可逆保护剂。可逆保护剂。还原修饰试剂有
43、还原修饰试剂有2一巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇一巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)等。等。(4)(4)芳香环取代反应芳香环取代反应酶分子氨基酸残基的酶分子氨基酸残基的酚羟基酚羟基在在3位和位和5位上很容易发位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应。生亲电取代的碘化和硝化反应。四硝基甲烷四硝基甲烷(tetranitro-methane，TNM)可以作用于可以作用于酪氨酸的酚羟基，形成酪氨酸的酚羟基，形成3-硝基酪氨酸的衍生物，硝基酪氨酸的衍生物，这种产物有特殊的光谱，可用于直接的定量测定。这种产物有特殊的光谱，可用于直接的定量测定。(4)(4)酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰
44、肽链有限水解修饰)利用利用酶分子主链的切断和连接酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶蛋白主链修饰主要是靠酶切酶切/酶原激活法酶原激活法。a a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 HCl胃胃蛋蛋白白酶酶原原pH1.52（从从N N端端失失去去4 44 4个个氨氨基基酸酸残残基基）自自身身激激活活胃胃蛋蛋白白酶酶b、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活）的激活 c c、胰凝乳蛋白酶原（、胰凝乳蛋白酶原（chymotr
45、ypsinogenchymotrypsinogen）的激活）的激活 氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法.例如，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶活性中心活性中心的的丝氨酸丝氨酸转换为转换为半胱氨酸半胱氨酸，修饰后该酶失去对蛋白质和多肽的，修饰后该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行
46、修饰，操作复杂，难以工业化生产。行修饰，操作复杂，难以工业化生产。现在常用的氨基酸置换修饰的方法是现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术定点突变技术。定点突变。定点突变（site directed mutagenesis）是）是20世纪世纪80年代发展起来的一种基年代发展起来的一种基因操作技术。是指在因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术，是蛋白质工程（改变从而获得突变基因的操作技术，是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点）和酶分子组成单位置换修饰中常
47、用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。行之有效的手段。(5)(5)氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰酶分子的定点突变酶分子的定点突变1 1、基因序列分析、基因序列分析2 2、蛋白质结构分析、蛋白质结构分析3 3、酶活性中心分析、酶活性中心分析4 4、引物设计进行基因定点突变、引物设计进行基因定点突变5 5、酶基因克隆表达、酶基因克隆表达6 6、变异特性分析、变异特性分析4.4 4.4 酶修饰后的性质变化酶修饰后的性质变化热稳定性热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。一般来说，热稳定性有较大的提高。
48、抗原性：抗原性：比较公认的是比较公认的是PEGPEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。提高其稳定性。半衰期：半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适最适pHpH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适
49、大部分酶经化学修饰后，酶的最适pHpH发生了变化，这种变化在应用研究发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适上有时具有重要意义。修饰酶最适pHpH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。义。KmKm的变化：的变化：大多数酶经修饰后，大多数酶经修饰后，VmVm没有明显变化，但有些酶经修饰后，没有明显变化，但有些酶经修饰后，KmKm值变大。值变大。4.5 4.5 酶的定向进化酶的定向进化酶分子的酶分子的合理设计合理设计(rational design)酶分子的酶分子的定向进化定向进化(directed evolution)n酶的合理设计酶
50、的合理设计理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。这是酶的体外定向进化的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选随机突变、重组和自然选择择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。，在体外
