1、柯萨奇病毒的柯萨奇病毒的RT-PCRRT-PCR实验室诊断实验室诊断柯萨奇病毒柯萨奇病毒?属于小病毒科肠道病毒属，最易在灵长类动物细胞中生长。属于小病毒科肠道病毒属，最易在灵长类动物细胞中生长。病毒分为、两组。柯萨奇病毒组有个血清型，柯萨奇病毒病毒分为、两组。柯萨奇病毒组有个血清型，柯萨奇病毒组有个血清型。组有个血清型。?单股正链单股正链RNA，全长大约，全长大约7.4Kb，病毒直病毒直径为径为252530nm30nm，球形，无包膜，病毒衣壳，球形，无包膜，病毒衣壳由由VP1-VP4VP1-VP4 等构成，呈等构成，呈2020面体立体对称。面体立体对称。柯萨奇病毒柯萨奇病毒(Coxsackie
2、 virus，CV)的诊断方法：的诊断方法：?病毒分离、动物接种病毒分离、动物接种操作烦琐,成功率低,影响诊断的敏感性；?ELISA 法法检测患者血清中相应的特异性 IgM、IgG抗体,但不能获得有关病毒更多的信息；?RT-PCR 法法既可以通过检测病人样本中的病毒 RNA 来明确诊断,也可以通过进一步的测序来分析病毒流行株特定序列,为基因分型提供依据。两端为保守的非编码两端为保守的非编码区，中间为编码区。区，中间为编码区。5端共价结合一小分端共价结合一小分子蛋白质子蛋白质Vpg（约（约7kDa），与病毒），与病毒RNA合成和基因组装配有合成和基因组装配有关；关；3端带有端带有polyA尾。编
3、码区编码的病尾。编码区编码的病毒结构蛋白毒结构蛋白VP1VP4，VP1、VP2和和VP3均暴露在病毒衣均暴露在病毒衣壳的表面，有中和抗壳的表面，有中和抗原位点；原位点；VP4位于衣位于衣壳内部，一旦病毒壳内部，一旦病毒VP1与受体结合后，与受体结合后，VP4即被释出，衣壳即被释出，衣壳松动，病毒基因组脱松动，病毒基因组脱壳穿入。壳穿入。?逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转
4、录酶）来完成。一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。Types of RT-PCR Reactions?Standard RT-PCR usually with one-step(recommended)Sensitive and specific?Nested PCRMore sensitive than standardContamination is a major problemOnly for very experienced labs?Real Time RT-PCRSensitive and specificReagent and equipm
5、ent costs are a factorHigh throughputRT-PCR 实验程序：标本的采集、标本RNA 的提取、引物、RT-PCR 反应体系、温度循环参数、琼脂糖电泳、凝胶成像、结果判定及序列测定?一步法：反转录 PCR在一个管子里完成，得到的全部cDNA产物都一起经 PCR扩增，灵敏度更高。两步法：反转录和 PCR分开，灵活而且严谨，但灵敏度不如前者高。?RNA操作注意事项操作注意事项?全程戴手套?灭菌、清洁的塑料管或无 RNA酶的玻璃制品?高压带滤芯枪尖?RNA提取试剂要保证无RNA酶?所有试剂开盖时要标明日期?在RNA提取、RT-PCR和测序过程中使用无 RNA 酶水?
6、操作快捷，提取后的RNA应放在-70度?备有冰盒，全程中保持 RNA在低温状态下?避免反复冻融RNA，防止RNA降解。PCR反应系统的组成：反应系统的组成：耐热DNA聚合酶（Taq酶）：这是由耐热水生细菌体内提取的一种DNA聚合酶。模板DNA：即待分析的目的DNA，其长度不宜大于10kb。两种引物：为了保证 DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板DNA链的3-端。四种脱氧核糖核苷酸：用作底物的 dNTPS。缓冲溶液：保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值?PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性
7、-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循
8、环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR注意事项注意事项?PCR关键环节模板;引物;酶 dNTP;循环条件;寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模模板板1、杂质蛋白质；特别是染色体中的组蛋白；2、Taq酶抑制剂；3、在提取制备模板时丢失过多；4、模板核酸变性不彻底；5、模板降解。RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含 DNA、蛋白质等杂质。引引?物物?引物质量、浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两
9、条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位;引物的浓度不仅要看OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。2+2+MgMg酶酶?Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，浓度
10、过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR 扩增失败而不出扩增条带。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。物理原因物理原因?变性对PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率。出现片状拖带或涂抹带出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：1、减少酶量，或调换另一来源的酶；2、减少d
11、NTP 的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数；3、减少模板量。?如何避免污染如何避免污染?严格分区：标本处理区与PCR 扩增区、产物分析区，要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：体系配制 标本制备 PCR 扩增产物分析产物处理。试剂：引物和探针尽量分装，不要原瓶多次取用。加样：原则是模板最后加，其他试剂按照体积从大往小的加。操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。耗材：使用一次性吸头，严禁与PCR 产物分析室的吸头混用；PCR 产物：机器运行完后，取出PCR 产物时不能
12、随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。?TRIZOL法提取核酸RT-PCR 法检测柯萨奇病毒（两步法）?逆转录（RT）聚合酶链反应（PCR）PCR产物的检测和鉴定?引物：CVB3的3D基因引物?TRIZOL法提取核酸法提取核酸1）取250ul病毒悬液加到1.5ml离心管中，然后加入750ul TRIZOL溶液，混匀5秒后离心。2）加入200ul 氯仿溶液，充分混匀5秒钟3）室温放置10分钟后，10000RPM，室温离心20分钟4）将上清液转移到一支新的1.5ml离心管中5）再加入500ul异丙醇溶液，摇匀10秒钟6）室温静置至少15分钟7）14000RPM，4离心25分钟8）倒掉
13、上清液，加入950ul冰冷的70%乙醇9）14000RPM，4离心20分钟10）用吸尖小心吸出上清液倒掉11）室温干燥后加入15ul dH2O，-70保存?逆转录（逆转录（RT）配液：RNA 3l（1g）随机引物1l 加水至10l混匀，瞬时离心，705min立即冰水浴，瞬时离心，依次添加下列试剂M-MLV Buffer 5 4ldNTP 10mM 1lM-MLV 200U/l 1l 加水至20l，混匀，瞬时离心，42 15min；95 5min；4 维持。cDNA于-20 冰箱冻存。聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）配液：25ul体系2mix12.5 PrimerA(100ug/ml)1ul
14、 PrimerS(100ug/ml)1ul cDNA1ulddH2O9.5ul?反应程序：反应程序：959560727245min15sec 20sec 35cycles20sec10min保存?PCR产物的检测和鉴定产物的检测和鉴定1）取100ml电泳缓冲液（1TAE）加入到干净的三角瓶中，再加入1.7g琼脂糖粉末，轻轻摇动三角瓶，是琼脂糖微粒呈均匀混浊状态。2）微波炉加热使琼脂糖熔化。3）熔化的琼脂糖自然冷却到60左右，加入5ul溴化乙锭（EB），混匀后倒入已准备好的胶床中，凝胶厚度约为0.30.5cm。4）室温下静置，凝胶固化。拿出已经做好的胶，将带凝胶的胶床置于电泳槽中。5）向电泳糟中加入电泳缓冲液（1TAE），缓冲液的量以超过凝胶表面1-2mm为宜。6）核酸样品5ul中加入大约1ul的6loading buffer，用加样器轻轻混合均匀。7）用加样器吸取样品，轻轻加入到凝胶的样品孔中。8）根据指示剂（溴酚蓝）迁移的位置判断是否终止电泳，如可以终止，则切断电源取出凝胶。9）凝胶成像仪观察电泳条带，保存记录。1：逆转录30min所得模板；2：逆转录30min所得模板稀释 100倍；3：逆转录15min所得模板；4：逆转录15min所得模板稀释 100倍；5：Marker；6：阳性对照；7：阴性对照；8：空白对照。谢谢观看！2020
