1、第二章第二章 基因工程工具酶基因工程工具酶 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的物区别自己和非己的DNA进而降解非己进而降解非己DNA的防的防御工具。御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。基因工程的工具酶（instrumental enzyme of gene engineering）是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备
2、、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。限制修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA，维护自身遗传稳定的保护机制。限制性核酸内切酶（限制酶）：在细限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷分子中的特定核苷酸序
3、列，并对酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。分子进行切割的一种酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。基因工程所用的限制性内切酶可从生产厂家购买，如NEB,Fermentas,SibEnzyme。国内市场上常用的是TaKaRa。一、限制性内切酶的命名和种类一、限制性内切酶的命名和种类 命名：以微生物属名第一个字母和种名前命名：以微生物属名第一个字母和种名前两个字母命名，后面加菌株代号的一个字母。两个字母命名，后面加菌株代号的一个字母。如果从同一菌株分离到多种酶，则依次用罗如果从同一菌株分离到多种酶，则依次用罗马数字马数字I、II、III、IV来表示。来表示。前三个字母用斜体，其他字
4、母用正体。前三个字母用斜体，其他字母用正体。同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶酶Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d株株属名属名 种名种名 株名株名限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名H i n d H i n d 特性型型型限制和修饰活性单一功能单一功能双功能识别与切割位点分别，随机切割，相距较远同一位点相距5-10bp在基因工程中意义无用非常有用意义不大限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型主要特性I 型 III 型限制修饰多功能双功能蛋白结构异源三聚体异源二聚体辅助因子ATP Mg2+S
5、AMATP Mg2+SAM识别序列TGAN8TGCTAACN6GTGCGAGCCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处随机性切割距识别序列下游24-26bp处二、限制性内切酶作用机制二、限制性内切酶作用机制 限制性内切酶以双链DNA为底物，识别特定的核苷酸序列，切断特定位置的磷酸二酯链，产生具有3-OH和5-P的DNA片段。限制性内切酶作用过程三、限制性内切酶的识别序列三、限制性内切酶的识别序列 限制性内切酶在双链DNA上识别的特殊核苷酸序列称为识别序列。绝大多数的型限制性核酸内切酶都能够识别由48个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别
6、序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。理论上，某限制性内切酶的识别序列长度为n个核苷酸，则该酶切割DNA的频率为1/4n，也就是说DNA每隔4n个核苷酸便 会出现一次该酶的识别序列。识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。A B C C B AA B C C B AA B N B AA B N B AA B B AA B B A或或 回文结构（palindrome）：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。四、限制性内切酶切割四、限制
7、性内切酶切割DNA的位点的位点 限制性内切酶切断DNA链上磷酸二酯键的位置一般在识别序列内部，如GGATCC,ATCGAT;也有少数在识别序列的两端,如GATC,CATG。环状DNA分子上，若某种限制性内切酶有n个识别序列，则完全切割后可获得n个片段。线状DNA分子，若某种限制性内切酶有n个识别序列，则完全切割后可获得n+1个片段。几种几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd EcoR IPst I5 C T G C A G33 G A
8、 C G T C.5不同核酸内切酶的特异识别位点5 G A A T T C 33 C T T A A G 5A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A DNAABCDDNAHindHind切割位点切割位点核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用 限制性核酸内切酶的切割类型：（1）两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。平齐末端（如平齐末端（如Sma、Alu、Hae）5-GG CC-3 3-CC
9、GG-5 5-GG-CC-3 3-CC-GG-5 5粘性末端（粘性末端（如如EcoR）5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-G-AATTC-3 3-CTTAA-G-5 3粘性末端（粘性末端（如如Pst）同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶 同裂酶isoschizomers：来源不同的限制酶识别相同的来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。如：如：Hpa和和Msp均可切割均可切割CCGG。当胞嘧啶甲基化后，当胞嘧啶甲基化后，Msp不能再切割。不能再切割。同尾酶isocaudamers：来源不同，识别的核苷酸靶序列来源
10、不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。如性核酸内切酶。如BamH I、BclI、BglII和和Xho I 是一组是一组同尾酶。同尾酶。注意注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。段将不能被该两种酶的任一种所识别。例如例如Hpa和和Msp是是同裂酶同裂酶，识别顺序都是，识别顺序都是 5CCG G3 3G GCC5 如果
11、其中有如果其中有5-甲基胞嘧啶，甲基胞嘧啶，Hpa不能够切割，不能够切割，MspI能切割。能切割。经经同尾酶同尾酶消化的消化的DNA末端连接示意图末端连接示意图5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX
12、55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5BamH IBgl II五、限制性内切酶反应系统五、限制性内切酶反应系统（一）底物（一）底物DNA1.DNA纯度纯度 含有蛋白质、醇等杂质降低酶活性；2.DNA分子构型分子构型 切割线状DNA的效率高于切割超螺旋DNA。3.识别序列的旁邻序列识别序列的旁邻序列 限制性内切酶不会切割仅含有识别序列的寡核苷酸时，识别序列两端必须要有若干个核苷酸才能切割。4.位点偏爱（位点偏爱（site preference）某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。与识别序列两侧的核苷酸序列有关。5.DNA甲
13、基化甲基化 DNA过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：4g DNA/1U Hpa 50l 37 15h 1g DNA/1U Hpa 50l 37 1h(二二)限制性内切酶的用量限制性内切酶的用量 50L Buffer中，含1g底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1g DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT或巯基乙醇 100g BSA/ml（DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白)DNA浓度高，则酶的用量高；识别序列出现的频率高，酶的用量也要高。(
14、三三)限制性内切酶反应缓冲液限制性内切酶反应缓冲液 生产厂家提供限制性内切酶时，包装中会附赠该酶的最适10反应缓冲液。有些酶可在几种缓冲液中发挥最大活性，有些酶必须要在该酶特定的缓冲液中才能发挥最大活性。有些酶在某些缓冲液中会出现星号活性。生产厂家的目录中会提供不同缓冲液中酶活力的详细信息。(四四)限制性内切酶反应温度限制性内切酶反应温度 大多数酶的最佳反应温度为37C，也有的高于或低于此温度。酶酶 切切 反反 应应 的的 基基 本本 步步 骤骤电泳紫外分析37 1h加反应液CKMBuffer(10)2.0 LddH2O 约约16.5 LDNA 0.21.0 gEnzyme 12UVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT
