1、2023-2-7第二节第二节 色谱过色谱过 程的基本原理程的基本原理 一一.色谱过程：色谱过程：组分分子在流动相和固组分分子在流动相和固定相间多次分配的过程定相间多次分配的过程.由于各组分的结构和性质不由于各组分的结构和性质不同同,与固定相作用的类型和与固定相作用的类型和强度不同强度不同,在固定相上滞留在固定相上滞留的时间不同的时间不同,随流动相移动随流动相移动的速度有差异的速度有差异差速迁移差速迁移,从而达到分离的目的。从而达到分离的目的。图图162 返回2023-2-72023-2-7 在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平
2、衡，组分在两相中的分配行为常采用平衡叫分配平衡，组分在两相中的分配行为常采用分配分配系数系数K K和和容量因子容量因子k k来表示来表示。（一）（一）分配系数和容量因子分配系数和容量因子三三 分配系数与色谱分离分配系数与色谱分离1 1、分配系数、分配系数 K(K(浓度分配系数浓度分配系数)组分在固定相中的浓度组分在固定相中的浓度 K=K=C Cs s/C/Cmm 组分在流动相中的浓度组分在流动相中的浓度K K随随T T变化，与固定相、流动相的体积无关。变化，与固定相、流动相的体积无关。2023-2-72 2 容量因子：容量因子：3 分配系数与容量因子的关系分配系数与容量因子的关系k=Cs Vs
3、/Cm Vm=K Vs/Vm2023-2-7（二（二 ）K K和和k与与t tR R的关系的关系 u：流动相的速度流动相的速度;v v：组分移动速度组分移动速度 R=R=v v/u u (保留比保留比)v v L/tR u=L/t0 R=t0/tR t0tm tR=tm+ts R=tm/(tm+ts)=Nm/(Nm+Ns)=CmVm/(CmVm+CsVs)=1/(1+k)tR=t0/R=t0(1+k)=t0(1+K Vs/Vm)色谱过程方程色谱过程方程 K K大的组分保留时间长。大的组分保留时间长。k=t=tR R/t/t0 0-1=(-1=(t tR R-t-t0 0)/t)/t0 0=t
4、tR R/t/t0 0 k大，保留时间长。大，保留时间长。2023-2-7(三）色谱分离的前提三）色谱分离的前提 t tR R=t=t0 0(1+K V(1+K Vs s/V Vmm)两组分两组分A A和和B B经色谱柱分离经色谱柱分离 t tR R t tRARA t tRBRBt t0 0(K(KA A-K-KB B)V)Vs s/V Vmm =t=t0 0(k kA A-k kB B)分离前提：分离前提：k kA Ak kB B2023-2-7主要内容第一节第一节 色谱法分类色谱法分类 第二节第二节 色谱过程的基本原理色谱过程的基本原理 第三节第三节 色谱法的基本类型及分离机制色谱法的基
5、本类型及分离机制 第四节第四节 色谱法基本理论色谱法基本理论 2023-2-71 1分配色谱法分配色谱法2 2吸附色谱吸附色谱3 3离子交换离子交换4 4空间排阻空间排阻5 5 其它其它 第三节第三节 色谱法的基本类型及分离机制色谱法的基本类型及分离机制2023-2-71 1 原理：原理：利用被分离组分在固定相或者流动相中的利用被分离组分在固定相或者流动相中的溶解度差别实现分离。溶解度差别实现分离。(GL,LL)(GL,LL)K KC Cs s/C/Cmm(m(ms s/V/Vs s)(V(Vmm/m/mmm)2 2 固定相：固定相：惰性载体上的薄层液体惰性载体上的薄层液体固定液；化学键合相固
6、定液；化学键合相 流动相：流动相：气体气体(GL)(GL)：HH2 2、N N2 2 液体液体(LL)(LL)：甲醇、乙腈、己烷等：甲醇、乙腈、己烷等 正相色谱正相色谱：固定相极性大于流动相极性：固定相极性大于流动相极性 反相色谱反相色谱：固定相极性小于流动相极性：固定相极性小于流动相极性3 3 流出顺序流出顺序：气相色谱与组分沸点、组分和固定相的极性有关气相色谱与组分沸点、组分和固定相的极性有关 液相分配色谱正相色谱：弱极性组分先流出液相分配色谱正相色谱：弱极性组分先流出 反相色谱：强极性组分先流出反相色谱：强极性组分先流出2023-2-7 1 1 机制：机制：利用被分离组分对固定相表面吸附
7、中心吸附能利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别实现分离（力的差别实现分离（GS GS、LSLS）。分离过程就是组分分子分离过程就是组分分子与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的过程与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的过程竞争吸附竞争吸附。二二.吸附色谱吸附色谱 X XmmnYnYa a X Xa anYnYmm Xa Ymn Xa 吸附系数吸附系数 Ka Ka Xm Yan Xm tRt0（1KSa/Vm）2023-2-72 2 固定相和流动相：固定相和流动相：s s：吸附剂，多孔微粒。表面有吸附中心。吸附剂，多孔微粒。表面有吸附中心。egeg:硅胶表面的硅醇基为吸附中心。硅胶表面的
8、硅醇基为吸附中心。mm：极性大，洗脱能力强极性大，洗脱能力强 。0 0表示表示溶剂强度溶剂强度：溶剂分子在单位吸附剂：溶剂分子在单位吸附剂 表面上的吸附自由能。表面上的吸附自由能。0 0大，吸附能力强，洗脱能力强。大，吸附能力强，洗脱能力强。3 3 流出顺序流出顺序 组分分子的竞争力组分分子的竞争力 组分分子与吸附剂的作用力组分分子与吸附剂的作用力 组分在流动相中的溶解度组分在流动相中的溶解度 2023-2-7三离子交换三离子交换1 1 原理：原理：利用被分离组分离子交换能力的差利用被分离组分离子交换能力的差别实现分离别实现分离。阳离子交换色谱分离机制阳离子交换色谱分离机制（HH）。）。当流动
9、相携带组分的正离子如当流动相携带组分的正离子如 NaNa出出现时，与现时，与H H发生交换反应发生交换反应当当树脂上树脂上所有可交换的所有可交换的H H均被交换后，树脂均被交换后，树脂失失去恬性去恬性，此时，若用稀酸溶液对树脂此时，若用稀酸溶液对树脂进行处理，进行处理，NaNa就被高浓度的就被高浓度的H H 置置换（洗脱）下来换（洗脱）下来,树脂的交换能力又被树脂的交换能力又被恢复恢复这一过程称为树脂的这一过程称为树脂的再生再生。SO3HNaH树树脂脂骨骨架架树脂表面的负离子树脂表面的负离子（为不可交换离子）（为不可交换离子）交换交换洗脱洗脱再交换再交换再洗脱再洗脱正离子（为可正离子（为可交换
10、离子）交换离子）2023-2-7选择性系数选择性系数K KA/B A/B 是衡量离子对树脂亲和能力相对大小的度量是衡量离子对树脂亲和能力相对大小的度量，K KA/BA/B越大，说明越大，说明A A的交换能力大越易保留。常选择某种离的交换能力大越易保留。常选择某种离子（如子（如H H或或CICI-）作参考测定一系列离子的选择性参数。）作参考测定一系列离子的选择性参数。交换与再生过程可用下式表示交换与再生过程可用下式表示2023-2-72 2 2 流动相、固定相流动相、固定相流动相、固定相流动相、固定相流动相、固定相流动相、固定相 固定相固定相：离子交换剂（离子交换树脂）：离子交换剂（离子交换树脂
11、）化学键合离子交换剂化学键合离子交换剂流动相流动相：一定一定pHpH和离子强度的缓冲液。和离子强度的缓冲液。有机溶剂可提高选择性。有机溶剂可提高选择性。2023-2-73 3 3 影响保留行为的因素影响保留行为的因素影响保留行为的因素影响保留行为的因素影响保留行为的因素影响保留行为的因素 受被受被受被受被受被受被分离离子分离离子分离离子分离离子分离离子分离离子、离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂、流功动相的流功动相的流功动相的流功动相的流功动相的流功动相的性质性质性质性质性质性质等的影响，等的影响，等的影响，等的影响，等的影响，等的影响，组分性质：组分性质：溶质离子的
12、电荷、水合离子半径溶质离子的电荷、水合离子半径 价态高，选择系数大；价态高，选择系数大；同价态阳离子，水合离子半径大，同价态阳离子，水合离子半径大，选择系数小。选择系数小。2023-2-7 流动相的组成和流动相的组成和流动相的组成和流动相的组成和流动相的组成和流动相的组成和pHpHpH值：值：值：值：值：值：交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力强，保留值降低。力强，保留值降低。强离子交换树脂的交换能力在很宽的范围内不随强离子交换树脂的交换能力在很宽的范围内不随流动相的流动相的pHpH变化，调节变化，调节pHpH值的作用主要体现在值的作用主要体现
13、在对对弱电解质离解的控制弱电解质离解的控制，溶质的离解受到抑制则，溶质的离解受到抑制则保留时间变短。保留时间变短。弱离子交换树脂的交换能力在某一弱离子交换树脂的交换能力在某一pHpH有极大值有极大值2023-2-71 1 原理：原理：根据被分离组分分子的根据被分离组分分子的线团尺寸线团尺寸进行分离进行分离 凝胶色谱法凝胶色谱法:按流动相的不同分为两类按流动相的不同分为两类 以有机溶剂为流动相者称为以有机溶剂为流动相者称为凝胶渗透色谱法凝胶渗透色谱法;以水溶液为流动相者称为以水溶液为流动相者称为凝胶过滤色谱法凝胶过滤色谱法。四空间排阻四空间排阻：凝胶色谱法的分离机制与前三种色谱法完全凝胶色谱法的
14、分离机制与前三种色谱法完全 不同，它只取决于不同，它只取决于凝胶的凝胶的孔径大小孔径大小与被分离组与被分离组 分分线团尺寸线团尺寸之间的关系之间的关系，与流动相的性质无关，与流动相的性质无关 。2023-2-7 渗透系数渗透系数 K Kp p=X=Xs s/X/Xmm 0 0K K1 1渗透系数的大小只由溶质分子的线团尺寸和凝渗透系数的大小只由溶质分子的线团尺寸和凝胶空隙的大小所决定。胶空隙的大小所决定。在高分子溶液中，相同成分的分子的线团尺寸在高分子溶液中，相同成分的分子的线团尺寸与其分子量成正比。与其分子量成正比。K K与分子量相关，即组分与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。按分子量的
15、大小分离。2023-2-7 2 2 2 2 2 2 固定相：固定相：固定相：固定相：固定相：固定相：多孔凝胶多孔凝胶多孔凝胶多孔凝胶多孔凝胶多孔凝胶 流动相：流动相：流动相：流动相：流动相：流动相：溶解试样；润湿凝胶溶解试样；润湿凝胶溶解试样；润湿凝胶溶解试样；润湿凝胶溶解试样；润湿凝胶溶解试样；润湿凝胶 3 保留体积与渗透系数的关系保留体积与渗透系数的关系 VR=Vm（1+KpVs/Vm）Vm V0 VR=V0+KpVs 球形态蛋白分子球形态蛋白分子 logMrlogMr=A=ABVBVR R2023-2-7 几种基本类型色谱法及其他类型色谱法保留值与分几种基本类型色谱法及其他类型色谱法保留
16、值与分配系数的关系皆可用色谱过程方程式表示，配系数的关系皆可用色谱过程方程式表示，即；即；t tR R=t=t0 0(1+(1+k k)分配系数大的组分保留时间长（保留体积大）分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。，晚流出色谱柱。2023-2-7 在在各种色谱法中各种色谱法中k的含义不的含义不同在分配色谱、吸附色谱、离子交换同在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝腋色谱中，色谱和凝腋色谱中，K分别为狭义的分别为狭义的分配分配系数系数K、吸附系数吸附系数Ka、选择性系数选择性系数KA/B和和渗透系数渗透系数Kp。V分别为色谱柱（或分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面
17、积、薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离于交换剂总交换容量和凝胶孔内总容离于交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。积。2023-2-7主要内容第一节第一节 色谱法分类色谱法分类 第二节第二节 色谱过程的基本原理色谱过程的基本原理 第三节第三节 色谱法的基本类型及分离机制色谱法的基本类型及分离机制 第四节第四节 色谱法基本理论色谱法基本理论 2023-2-7第四节第四节第四节第四节第四节第四节 色谱法基本理论色谱法基本理论色谱法基本理论色谱法基本理论色谱法基本理论色谱法基本理论分离度分离度保留时间差保留时间差峰峰 宽宽分配系数分配系数热力学过程热力学过程相平衡相平衡塔板理论塔板理论动力学因素动力学
18、因素动力学过程动力学过程速率理论速率理论峰展宽峰展宽 色谱法色谱法基本理论基本理论2023-2-7一、塔板理论一、塔板理论一、塔板理论一、塔板理论一、塔板理论一、塔板理论 在在5050年代，色谱技术发展的初期，年代，色谱技术发展的初期，MartinMartin等人把色谱分离过程比作分馏过程，等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论并把分馏中的半经验理论塔板理论塔板理论用于用于色谱分析法。色谱分析法。2023-2-7 塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有柱内有n n个塔板，每个塔板高度称为理论个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高塔板高 度，度
19、，用用HH表示表示。认为在每个塔板的间隔内，试样组分在两认为在每个塔板的间隔内，试样组分在两相中达到配平衡经过多次的分配平衡后，相中达到配平衡经过多次的分配平衡后，分配系数小的组分先流出色谱往。分配系数小的组分先流出色谱往。同时还同时还引入引入塔板数塔板数作为衡量柱效的指标。作为衡量柱效的指标。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。因此几十年来一直沿用。2023-2-7 1 1 在在HH长度内
20、，组分在两相间瞬间平衡。长度内，组分在两相间瞬间平衡。2 2 流动相间歇进入。流动相间歇进入。3 3 试样、流动相从试样、流动相从0 0号板开始，忽略扩散。号板开始，忽略扩散。塔板理论假设塔板理论假设4 4 各塔板各塔板 K=K=常数常数 假设条件成立，假设条件成立，色谱柱长：色谱柱长：L L，虚拟的塔板间距离：虚拟的塔板间距离：HH，色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n n，则三者的关系为：则三者的关系为：H=L/nH=L/n，2023-2-7（一）质量分配和转移（一）质量分配和转移（一）质量分配和转移（一）质量分配和转移（一）质量分配和转移（一）质量分配和转移16-42023-2-7
21、（二）流出曲线方程（二）流出曲线方程（二）流出曲线方程（二）流出曲线方程（二）流出曲线方程（二）流出曲线方程 以组分以组分A A在柱出口处的质量分数对在柱出口处的质量分数对N N作图得流作图得流出曲线出曲线A=1.065h W1/2Cmax-h2023-2-7（三）理论塔板高度和理论塔板数（三）理论塔板高度和理论塔板数（三）理论塔板高度和理论塔板数（三）理论塔板高度和理论塔板数（三）理论塔板高度和理论塔板数（三）理论塔板高度和理论塔板数 理论塔板数与色谱参数之间的关系为理论塔板数与色谱参数之间的关系为n=(tR/)2 对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定 L L
22、，每一个每一个 塔板高度塔板高度H H越小，塔板数目越多，分离的效果越好，越小，塔板数目越多，分离的效果越好，柱效越高。塔板数用柱效越高。塔板数用n n 表示。表示。n=L/H 或或 H=L/n (H (H越小，越小，n n越多，分离效果越好，用越多，分离效果越好，用 H,n H,n 评价柱效评价柱效)由塔板理论导出由塔板理论导出n n与与WWb b ，W W 1/21/2 的关系的关系。*n=5.54(tR/W 1/2)2 =16(tR/Wb)2 2023-2-7有效塔板数和有效塔板高度有效塔板数和有效塔板高度 有效有效有效nLHWtYtnbRR222/1)(16)(54.5有时有时n n
23、大，分离效果也不好，因用大，分离效果也不好，因用t tR R 内含内含t tmm ，后来改用有效塔板数。后来改用有效塔板数。2023-2-7塔板理论的特点和不足：塔板理论的特点和不足：当色谱柱长度一定时，塔板数当色谱柱长度一定时，塔板数 n n 越大越大(塔板高度塔板高度 HH越越小小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。高，所得色谱峰越窄。实际过程中，组分在流动相和固定相间不可能真正达实际过程中，组分在流动相和固定相间不可能真正达到分配平衡。到分配平衡。柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分柱效不能表示被分离组分
24、的实际分离效果，当两组分的分配系数的分配系数 K K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离无法分离。塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。效的途径。2023-2-7 组分在色谱柱中存在纵向扩散。组分在色谱柱中存在纵向扩散。塔板理论没有考虑各种动力学因素对色谱塔板理论没有考虑各种动力学因素对色谱柱内传质过程对影响，因此无法解释柱柱内传质过程对影响，因此无法解释柱效与流动相流速对关系。效与流动相流速对关系。速率理论速率理论
