1、第四章第四章 体内药物分析方体内药物分析方法的建立与验证法的建立与验证第一节第一节 分析方法的设计依据分析方法的设计依据一一.待测药物的理化性质及体内存在状况待测药物的理化性质及体内存在状况 1.1.待测药物的理化性质待测药物的理化性质 1 1）待测药物的）待测药物的pKapKa值及其亲脂性、水和有机溶的分配系数值及其亲脂性、水和有机溶的分配系数 等决定萃取方法等决定萃取方法 2 2）药物挥发性判定是否）药物挥发性判定是否GCGC检测检测 3 3）药物的紫外、荧光、电化学特性决定检测方法）药物的紫外、荧光、电化学特性决定检测方法 4 4）药物酸碱、光、热的稳定性）药物酸碱、光、热的稳定性 2.
2、2.待测药物的体内状况待测药物的体内状况 1 1）蛋白结合强时，不宜用溶剂萃取）蛋白结合强时，不宜用溶剂萃取 2 2）原形药物与代谢物共存时，分离度是否良好原形药物与代谢物共存时，分离度是否良好 3 3）药物浓度过低采用高灵敏度方法药物浓度过低采用高灵敏度方法 2.2.分析测定的目的与要求分析测定的目的与要求 1 1）药代动力学研究）药代动力学研究 A:A:测定血中的药物和代谢物测定血中的药物和代谢物 B:B:要求较宽的线性范围（要求较宽的线性范围（Cmax/CminCmax/Cmin 1/10-1/201/10-1/20）C:C:较高的灵敏度（较高的灵敏度（1010-9-9g/mlg/ml）
3、、准确度）、准确度 D:D:分离度大于分离度大于1.5 1.5 E:E:常用的仪器常用的仪器HPLCHPLC、GCGC、LC-MSLC-MS 2 2）血药浓度监测）血药浓度监测 A:A:要求线性在有效浓度范围内要求线性在有效浓度范围内 B:B:分析方简便、易行、适用于长期和批量样品测定分析方简便、易行、适用于长期和批量样品测定 C:C:常用的仪器常用的仪器TDX TDX 3.3.生物样品的类型与样品制备方法生物样品的类型与样品制备方法 A:A:生物样品的类型与样品制备与分析方法与有密切关系生物样品的类型与样品制备与分析方法与有密切关系 B:B:血浆血清，用蛋白沉淀血浆血清，用蛋白沉淀-溶剂萃取
4、技术，溶剂萃取技术，HPLCHPLC测定测定 C:C:用用RIARIA时样品的预处理可粗放时样品的预处理可粗放 4.4.试验室条件试验室条件 A:A:试验室设备试验室设备 B:B:试验人员试验人员 C:C:验室验室SOPSOP D:D:分析软件分析软件 第二节第二节 分析方法建立的步骤分析方法建立的步骤 一一.分析方法的选择分析方法的选择 A:A:样品中的药物浓度是分析方法的首要因素样品中的药物浓度是分析方法的首要因素 B:B:样品中的药物浓度样品中的药物浓度1010-6-6-10-10-9-9g/mlg/ml C:HPLC C:HPLC法检测限：法检测限：紫外（紫外（UVUV）1ng1ng；
5、荧光；荧光0.1ng0.1ng；电化学（；电化学（EDDEDD）0.01ng0.01ng 二二.分析方法的建立分析方法的建立 1.1.检测条件的筛选检测条件的筛选 A:A:取标准物质取标准物质 待测物质；内标物质待测物质；内标物质 B:B:根据已知的分析方法进行测定根据已知的分析方法进行测定 C:C:根据测定结果确定最佳条件：根据测定结果确定最佳条件：溶液溶液pHpH值；温度及时间；试剂值；温度及时间；试剂用量；色谱条件用量；色谱条件 2.2.分析条件的选择分析条件的选择 1 1）空白溶剂试验）空白溶剂试验 A:A:取待测药物非生物基质溶液，按拟定的方法预处理，分析方取待测药物非生物基质溶液，
6、按拟定的方法预处理，分析方 法的特异性法的特异性 B:B:空白响应值应尽可能小或可忽略空白响应值应尽可能小或可忽略 2 2）空白生物基质试验）空白生物基质试验 A:A:取空白生物基质（血、组织匀浆），取空白生物基质（血、组织匀浆），照空白溶剂试验下操作照空白溶剂试验下操作 B:B:考察杂质对测定的影响考察杂质对测定的影响 C:C:杂质不干扰测定杂质不干扰测定 3 3）模拟生物样品试验）模拟生物样品试验 A:A:取空白生物基质加入待测物制成模拟生物样品取空白生物基质加入待测物制成模拟生物样品 B:B:照空白生物基质试验下操作照空白生物基质试验下操作 C:C:考察方法的专一性；线性范围；最小检测限
7、；精密度；灵敏考察方法的专一性；线性范围；最小检测限；精密度；灵敏度；萃取回收率度；萃取回收率 4 4）实际生物样品测定）实际生物样品测定 A:A:预试预试 确定实际生物样品与模拟生物样品一致性确定实际生物样品与模拟生物样品一致性 B:B:正式试验正式试验 按所建立的分析方法分析按所建立的分析方法分析 C:C:比较实际生物样品与模拟生物样品相应特点比较实际生物样品与模拟生物样品相应特点 D:D:计算体内药物浓度计算体内药物浓度 第三节第三节 分析方法的验证内容和要求分析方法的验证内容和要求 一一.分析方法的选择分析方法的选择 A:A:用于实际样品分析之前，对所建立的方法的可靠性、可行用于实际样
8、品分析之前，对所建立的方法的可靠性、可行 性，应使用若干技术指标验证性，应使用若干技术指标验证 B:B:验证步骤验证步骤 分析方法验证；实际生物样品中药物测定分析方法验证；实际生物样品中药物测定 一）特异性：一）特异性：又称专属性、专一性，与选择性互用又称专属性、专一性，与选择性互用 A:A:是指当有杂质存在时，方法准确测定待测物的能力。通常表是指当有杂质存在时，方法准确测定待测物的能力。通常表 示所检测的信号应属于待测物所特有示所检测的信号应属于待测物所特有 B:B:用来验证该方法所测定的物质是目标物质，且不受非目标物用来验证该方法所测定的物质是目标物质，且不受非目标物 质的干扰质的干扰 1
9、.1.内源性物质的干扰内源性物质的干扰 A:A:比较待测物的对照品、空白生物基质、模拟生物样品的检测比较待测物的对照品、空白生物基质、模拟生物样品的检测 信号，确证内源性物质对分析物有无干扰信号，确证内源性物质对分析物有无干扰 B:B:比较的内容比较的内容 T Tr r；n n；T T；R R 2.2.代谢产物干扰代谢产物干扰 比较模拟生物样品和实际生物样品的检测信号（比较模拟生物样品和实际生物样品的检测信号（T Tr r；n n；T T；R R），确证代谢产物对分析物有无干扰），确证代谢产物对分析物有无干扰 3.3.配伍用药的干扰配伍用药的干扰 A:A:比较待测药物、同时服用的药物、空白生物
10、样本、待测药物比较待测药物、同时服用的药物、空白生物样本、待测药物模拟生物样品、待测药物模拟生物样品、待测药物+同时服用的药物模拟生物样品的检同时服用的药物模拟生物样品的检测信号测信号 B:B:比较的内容比较的内容 T Tr r；n n；T T；R R 4.4.与参比方法的相关性与参比方法的相关性 A:A:参比方法选择（参比方法选择（HPLCHPLC、GCGC）B:B:同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物样品同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物样品 C:C:参比方法测得值为横坐标（参比方法测得值为横坐标（x x），拟定的方法测得值为纵座），拟定的方法测得值为纵座 标标 （y y），求回
11、归方程），求回归方程y=a+bxy=a+bx，r r为一致成度；为一致成度；a a为拟定方法为拟定方法 受恒定干扰程度；受恒定干扰程度；b b为拟定方法受比例干扰程度。为拟定方法受比例干扰程度。D:r=1 a=0 b=1 D:r=1 a=0 b=1 两种方法一致两种方法一致 二）标准曲线与线性范围二）标准曲线与线性范围 A:A:又称校正曲线、工作曲线。是指生物样品中药物浓度与所测又称校正曲线、工作曲线。是指生物样品中药物浓度与所测 定的该药物的检测信号的相关性，通常用回归方程评价。定的该药物的检测信号的相关性，通常用回归方程评价。B:B:大多数方法的标准曲线为线性模式。回归方法为最小二乘法大多
12、数方法的标准曲线为线性模式。回归方法为最小二乘法 和加权最小二乘法和加权最小二乘法 C:C:生物样品中药物浓度为自变量（生物样品中药物浓度为自变量（x x），检测信号为因变量），检测信号为因变量（y y），回归方程为），回归方程为y=a+bxy=a+bx，r r为相关系数为相关系数 D:D:线性范围，线性范围，浓度不能外推浓度不能外推 E:E:标准曲线模拟生物样品的标准曲线模拟生物样品的生物基质生物基质应使用与待测的实际生物应使用与待测的实际生物 样品的样品的生物基质生物基质相同相同 1.1.标准曲线系列溶液的配制标准曲线系列溶液的配制 1 1）精称标准药物适量，）精称标准药物适量，配贮备液配
13、贮备液 2 2）精量）精量配贮备液适量配贮备液适量，配制系列标准溶液配制系列标准溶液 3 3）系列标准溶液浓度为模拟生物样品浓度的）系列标准溶液浓度为模拟生物样品浓度的5050倍倍 4 4）加量为生物样本体积的）加量为生物样本体积的2%2%5 5）难溶药物，适当降低系列标准溶液浓度，蒸干）难溶药物，适当降低系列标准溶液浓度，蒸干 6 6）线性模拟的标准曲线）线性模拟的标准曲线5-85-8点；线性模拟的标准曲线增加点；线性模拟的标准曲线增加 7 7）标准曲线系列浓度为等梯度，公比为）标准曲线系列浓度为等梯度，公比为2 2 2.2.内标物溶液的配制内标物溶液的配制 1 1）精称内标物适量，）精称内
14、标物适量，配内标物贮备液配内标物贮备液 2 2）精量）精量配贮备液适量配贮备液适量，配制内标物标准溶液配制内标物标准溶液 3 3）内标物标准溶液浓度为）内标物标准溶液浓度为“标准曲线系列浓度标准曲线系列浓度”的中间浓度的中间浓度 3.3.标准系列模拟生物样品的配制标准系列模拟生物样品的配制 1 1）取空白血数份，加入）取空白血数份，加入“标准曲线系列浓度标准曲线系列浓度”适量适量（在加入（在加入内标液适量）内标液适量），混匀，混匀 2 2）标准系列模拟生物样品高低浓度比）标准系列模拟生物样品高低浓度比1/10-1/20 1/10-1/20 3 3）同时配制空白样）同时配制空白样C=0C=0 4
15、 4）防止生物基质中加入过多溶剂，干扰测定，可将标准液和）防止生物基质中加入过多溶剂，干扰测定，可将标准液和 内标液先加到试管中，内标液先加到试管中，蒸干后加生物基质蒸干后加生物基质 4.4.标准曲线的绘制标准曲线的绘制 1 1）以待测物的响应值（）以待测物的响应值（A A；h h）或与内标物的响应值的比）或与内标物的响应值的比（A A1 1/A/A2 2；h h1 1/h/h2 2）为（）为（y y）对浓度（）对浓度（x x），回归得），回归得y=a+bxy=a+bx及及r r。绘。绘 制标准曲线。制标准曲线。2 2）回归分析时在至少）回归分析时在至少7 7个浓度构成的标准曲线中，至多个浓度
16、构成的标准曲线中，至多2 2个浓个浓度点数据因确切原因度点数据因确切原因“离群离群”，可剔出，余至少可剔出，余至少5 5点数据线性点数据线性良好。良好。5.5.限度要求限度要求 1 1）标准曲线）标准曲线5-85-8浓度，最高和最低浓度比浓度，最高和最低浓度比1/10-1/201/10-1/20 2 2）回归方程）回归方程a a应近于零，斜率应近于零，斜率b b接近接近1 1或大于或大于1 1，系数，系数R R接近接近1 1，HPLC R0.99HPLC R0.99；生物学法；生物学法R0.98R0.98。3 3）需分区制备标准曲线（最高和最低浓度比）需分区制备标准曲线（最高和最低浓度比100
17、100）三）准确度三）准确度 指用该法测得的生物样；指用该法测得的生物样；样样品中待测药物的浓度与其真实浓品中待测药物的浓度与其真实浓 度的接近程度。度的接近程度。1.1.测定法测定法 取空白生物基质数份，照取空白生物基质数份，照“标准曲线下标准曲线下”配制，至少选标准配制，至少选标准 曲线的高、中、低曲线的高、中、低3 3个浓度样品。每个浓度个浓度样品。每个浓度5 5个平行样，每个个平行样，每个 样测定一次。与随行的标准曲线同测定样测定一次。与随行的标准曲线同测定 2.2.结果计算与限度分析结果计算与限度分析 1 1）用随行的标准曲线计算测得浓度（内、外标），测得值）用随行的标准曲线计算测得
18、浓度（内、外标），测得值M M的的平均值平均值M M平平与配制理论值（与配制理论值（A A）比，计算回收率（）比，计算回收率（RRRR）或相对误）或相对误差（差（RERE）2 2）RR=MRR=M平平/A/A100100；RE=RE=（M M平平-A-A）/A/A100100 3 3）RRRR在在85-115%85-115%内，低浓度内，低浓度80-120%80-120%；RERE15%15%，低浓度，低浓度20%20%四）精密度四）精密度 指用指用1 1次测定结果与多次测定结果的平均值的偏离程度。表示次测定结果与多次测定结果的平均值的偏离程度。表示分析方法的可重复性。分析方法的可重复性。1.
19、1.表示方法表示方法 方法精密度用方法精密度用SDSD或或RSDRSD表示表示，RSD=SD/XRSD=SD/X平均平均100100 1 1）批内）批内RSD RSD 又称日内又称日内RSDRSD 2 2）批内）批内RSD RSD 又称日间又称日间RSDRSD 2.2.测定方法测定方法 1 1）批内）批内RSDRSD A:A:同一分析批（日内）同一分析批（日内）B:B:随行标准曲线随行标准曲线 C:C:高、中、低高、中、低3 3种浓度，每种浓度种浓度，每种浓度5 5个平行样，每样测定一次。个平行样，每样测定一次。D:D:计算日内计算日内RSDRSD 2 2）批间）批间RSDRSD A:5 A:
20、5个工作日，每个工作日完成一个分析批测定个工作日，每个工作日完成一个分析批测定 B:B:每一个分析批随行每一个分析批随行1 1条标准曲线条标准曲线 C:C:每一个分析批测高、中、低每一个分析批测高、中、低3 3种浓度样品，每种浓度种浓度样品，每种浓度1 1个样，个样，每样测定每样测定1 1次。次。D:D:用随行的标准曲线计算日间用随行的标准曲线计算日间RSDRSD 3.3.限度要求限度要求 药代动力学、生物利用度：药代动力学、生物利用度：g/mlg/ml水平水平RSD10%RSD10%；ngng/ml/ml水平水平 RSD15%RSD15%，在最低检测浓度附近，在最低检测浓度附近RSD20%R
21、SD20%五）定量限五）定量限A:A:方法定量限方法定量限(LOQ)(LOQ)与检测限与检测限(LOD)(LOD)均表示分析方法检测低浓度均表示分析方法检测低浓度 样的能力，通常称为方法灵敏度样的能力，通常称为方法灵敏度 B:LODB:LOD指在噪音水平下识别生物样本中药物的最低浓度指在噪音水平下识别生物样本中药物的最低浓度 C:C:当信噪比（当信噪比（S/NS/N）33时，该信号有效。将时，该信号有效。将S/N=3S/N=3时样品的浓时样品的浓 度作为度作为LODLOD D:LOQ D:LOQ 指保证具有一定可靠性的前提下，该方法能准确测定生指保证具有一定可靠性的前提下，该方法能准确测定生物
22、样品中药物的最低浓度物样品中药物的最低浓度 E:LOQE:LOQ的检测响应值为的检测响应值为LODLOD的两倍以上，为的两倍以上，为S/N=10S/N=10时的样品浓度时的样品浓度 作为作为LOQLOQ的估计值。的估计值。F:F:体内分析中标准曲线的体内分析中标准曲线的LOQLOQ估计估计LOQLOQ 1.1.测定方法测定方法 取同一生物基质，制备至少取同一生物基质，制备至少5 5个独立的生物样本，其浓度应使个独立的生物样本，其浓度应使 S/N10S/N10，依法进行准确度、精密度验证，依法进行准确度、精密度验证 2.2.限度要求限度要求 A:A:生物样本测得的生物样本测得的LOQLOQ平均浓
23、度在其表示浓度的平均浓度在其表示浓度的20%20%B:B:生物样本测得的生物样本测得的LOQLOQ其其RSD20%RSD20%C:LOQ C:LOQ小于测定小于测定3-53-5半衰期后生物样品中的药物浓度或小于半衰期后生物样品中的药物浓度或小于 CmaxCmax的的1/101/10 六）稳定性六）稳定性 1.1.方法稳定性方法稳定性 A:A:考察待测物的标准物、其分析溶液在室温、光照等稳定性考察待测物的标准物、其分析溶液在室温、光照等稳定性 B:B:方法建立过程中考察模拟生物样本预处理、室温或冰箱贮方法建立过程中考察模拟生物样本预处理、室温或冰箱贮 存、冻融等稳定性。存、冻融等稳定性。2.2.
24、生物样品稳定性生物样品稳定性 1 1）短期稳定性）短期稳定性 考察模拟生物样品在室温、考察模拟生物样品在室温、4 4C C或或-20-20C C、冻融循环的稳定性、冻融循环的稳定性 2 2）长期稳定性）长期稳定性 考察实际生物样品经长期冰冻（考察实际生物样品经长期冰冻（-20-20C C或或-80-80C C）后稳定性。）后稳定性。期限为从生物样本采集到分析完毕期限为从生物样本采集到分析完毕 3.3.测定方要求测定方要求1 1）测定方法与限度要求）测定方法与限度要求 A:A:高、中、低高、中、低3 3个浓度样本，置于适当的容器内，在不同个浓度样本，置于适当的容器内，在不同 条件、不同存放时间后
25、，每个样本重复测定条件、不同存放时间后，每个样本重复测定3 3次以上，其平均次以上，其平均 值应在零时的值应在零时的5%5%内。内。B:B:考察时间在一个工作日以上，则应与新制的样品在相同条件考察时间在一个工作日以上，则应与新制的样品在相同条件 下的测得值比较。下的测得值比较。C:C:若生物样本的长期稳定性考察，可与液态氮中保存的生物若生物样本的长期稳定性考察，可与液态氮中保存的生物样样 本本，在相同条件的测定值比较在相同条件的测定值比较 2 2）稳定性期限要求）稳定性期限要求 A:A:在室温条件下仅需观察在室温条件下仅需观察1 1日内稳定性日内稳定性 B:B:在冰箱（在冰箱（4 4C C、-
26、20-20C C、-80-80C C）中应考察数个工作日内的稳）中应考察数个工作日内的稳定性定性 C:C:血浆冻融至少经历血浆冻融至少经历2 2个循环（冻个循环（冻-融融-冻冻-融）以上。每次冷冻融）以上。每次冷冻时间在时间在24h24h以上以上七七 提取回收率提取回收率 主要考察生物样本在制备过程中造成的待测组分的损失主要考察生物样本在制备过程中造成的待测组分的损失 1.1.测定方法测定方法 A:A:取空白生物基质数份，制备高、中、低取空白生物基质数份，制备高、中、低3 3个浓度模拟样本，个浓度模拟样本，每种浓度每种浓度5 5个平行样本，每个样本测定一次个平行样本，每个样本测定一次 B:B:
27、另取等量的相同另取等量的相同3 3个浓度的标准溶液，进样测定个浓度的标准溶液，进样测定 C:C:计算计算 A AT T/A/AS S100100，在相同条件的测定值比较，在相同条件的测定值比较 D:D:提取回收率测定，若采用内标，内标物应在提取之后，溶剂提取回收率测定，若采用内标，内标物应在提取之后，溶剂 挥发之前加入，溶剂挥发后测定挥发之前加入，溶剂挥发后测定 E:E:内标法测定生物样品，应测定内标物的提取回收率。仅制备内标法测定生物样品，应测定内标物的提取回收率。仅制备 一个浓度，一个浓度，5 5个平行样本，同法测定、计算个平行样本，同法测定、计算 2.2.限度要求限度要求 A:A:待测物
28、的提取回收率高、中、低待测物的提取回收率高、中、低3 3个浓度均个浓度均50%50%，且高中，且高中 的的RSD15%RSD15%，低浓度，低浓度RSD20%RSD20%。B:B:内标物内标物提取回收率提取回收率50%50%，RSD15%RSD15%八八.质量控制质量控制 1.1.质控（质控（QCQC）样品）样品 A:A:将已知待测物加到空白基质中，配制的模拟生物样品，用于将已知待测物加到空白基质中，配制的模拟生物样品，用于 整个分析的质量控制，一般高、中、低整个分析的质量控制，一般高、中、低3 3个浓度的质控样。个浓度的质控样。B:B:质控样品池质控样品池，试验研究初配制，与实际生物样相同条
29、件下同试验研究初配制，与实际生物样相同条件下同 时保存时保存 C:C:制备质控样品时，不能用制备标准曲线用的标准液，另配。制备质控样品时，不能用制备标准曲线用的标准液，另配。2.2.质量控制质量控制 A:A:未知样品的测定在方法确定后进行，每个样品测定一次，必要未知样品的测定在方法确定后进行，每个样品测定一次，必要时复测。时复测。B:B:每批生物样品测定的同时应建立相应的标准曲线，并随行间隔每批生物样品测定的同时应建立相应的标准曲线，并随行间隔测定高、中、低测定高、中、低QCQC样品，根据样品，根据QCQC分析数据的可靠性。分析数据的可靠性。1 1）测定法）测定法 QCQC样品以高低或低高顺序以一定间隔，均匀地插入样品以高低或低高顺序以一定间隔，均匀地插入整个分析批，与生物样本同时测定，并用随行标准曲线计算。整个分析批，与生物样本同时测定，并用随行标准曲线计算。2 2）限）限度要求度要求 每一分析批内，随行穿插每一分析批内，随行穿插6 6个个QCQC样品。有样品。有4 4个在正个在正 常浓度的常浓度的80%-120%80%-120%内，内，RSDRSD20%20%。允许有。允许有2 2个（不是同一种浓度）个（不是同一种浓度）超出各自正常值的超出各自正常值的20%20%。
