1、第十二章第十二章抗生素类药物的分析抗生素类药物的分析Antibioticsu 抗生素类药物的质量分析抗生素类药物的质量分析鉴别鉴别：真伪检查：检查：含量（效价）测定含量（效价）测定：质量的优劣第一节第一节 概概 述述u 官能团的显色反应官能团的显色反应u 光谱法：光谱法：IRIR,UV,UVu 色谱法u 生物学法（一）（一）鉴别试验鉴别试验1 1控制有机和无机杂质的指标控制有机和无机杂质的指标2 2影响产品稳定性的指标影响产品稳定性的指标3.3.与临床安全性密切相关的指标与临床安全性密切相关的指标 异常毒性、热原、细菌内毒素等异常毒性、热原、细菌内毒素等4 4其他：悬浮时间与抽针试验等其他：悬
2、浮时间与抽针试验等（二）检查（二）检查 抗生素的活性表示抗生素的活性表示每毫升或每毫克抗生素供试品中含有某种抗生素有效成分抗生素有效成分的多少。以效价单位效价单位U U表示 测定方法测定方法微生物检定法理化方法（三）含量或效价测定（三）含量或效价测定微生物检定法微生物检定法 以抗生素对微生物的抑制或杀伤能力来衡量其效价 分子结构复杂、含多个组分的抗生素：分子结构复杂、含多个组分的抗生素：首选方法首选方法理化方法理化方法 根据分子结构，利用物理化学性质进行 主要采用HPLC 适用于：高纯度、化学结构已确定的抗生素 缺点缺点：不一定代表生物效价；易受杂质干扰按化学结构化学结构分：内酰胺类内酰胺类
3、氨基糖苷类氨基糖苷类 四环素类四环素类 大环内酯类、苯烃胺类 多肽类、蒽环类、多烯大环类 其他u 抗生素的分类抗生素的分类一化学结构与性质一化学结构与性质（一）化学结构（一）化学结构 青霉素族：侧链+6-氨基青霉烷酸 母核 头孢菌素族：侧链+7-氨基头孢菌烷酸 母核 第二节-内酰胺类抗生素ONRCO HNSCOOHCH3CH3AB侧链A：-内酰胺环B：氢化噻唑环青霉素(penicillins)ONRCO HNSCOOHAB侧链A：-内酰胺环CH2R1B：氢化噻嗪环头孢菌素(cephalosporins)123456712345678*酰胺侧链青、头的共性结构 游离羧基 内酰胺环 青霉素族代表药
4、物代表药物：青霉素钾（钠）benzylpenicillin potassium(sodium)即苄青霉素钾（钠）羟氨苄青霉素（钠）即阿莫西林（钠）amoxicillin 氨苄青霉素（钠）即氨苄西林（钠）ampicillinCH2CHHONH2CHNH2头孢菌素族代表药物代表药物：头孢氨苄：氨苄头孢菌素 cefalexin头孢羟氨苄：羟氨苄头孢菌素 cefadroxill 溶解性溶解性l 旋光性l 酸性酸性l 内酰胺环的不稳定性内酰胺环的不稳定性l UV UV 特性特性（二）性质（二）性质 酸性酸性n羧基羧基 酸性酸性 与碱金属与碱金属(Na(Na+、K K+)成盐：成盐：易溶于水易溶于水 与有
5、机碱与有机碱(普鲁卡因普鲁卡因)成盐：成盐：难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂n不稳定性因素不稳定性因素四元环张力大酰胺键易水解n稳定性与含水量和纯度的关系稳定性与含水量和纯度的关系干燥、纯净 稳定 水溶液、不纯净 不稳定 青霉素水溶液青霉素水溶液：pH 6-6.8时较稳定内酰胺环的不稳定性内酰胺环的不稳定性共轭体系共轭体系 UV UV 青霉素类：青霉素类：母核无明显母核无明显UVUV，侧链多数含，侧链多数含苯环苯环取代基取代基 头孢菌素类：头孢菌素类：母核：共轭体系母核：共轭体系O=CO=CN NC=C C=C O=C O=CC=CC=C 侧链：多数含苯环取代基侧链
6、：多数含苯环取代基UV UV 特性特性二鉴别试验 光谱法：IR、UV 色谱法 呈色反应 各种盐的反应（一）呈色反应（一）呈色反应u 羟肟酸铁反应羟肟酸铁反应 NSOROCHNCH2R1COOHCHNSROCHNCH2R1COONaONHOHCHNSROCHNCH2R1COOHONHOFe/3H2NOH HClNaOH,C2H5OHFeNH4(SO4)2H+ONSCOOHCH3CH3CH2NH2COHN茚三酮蓝紫色u 类似肽键的反应类似肽键的反应 茚三酮反应：茚三酮反应：双缩脲反应：双缩脲反应：-内酰胺类碱性酒石酸酮开环分解蓝紫色u 重氮化-偶合反应 普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素水溶液酸化 青霉
7、素+普鲁卡因普鲁卡因 u 钾、钠离子的火焰反应（二）各种盐的反应（二）各种盐的反应重氮化重氮化-偶合反应偶合反应（一）聚合物聚合物：凝胶过滤色谱法 （二）有关物质和异构体有关物质和异构体 HPLC：不加校正因子的主成分自身对照法 三特殊杂质检查 适用于原料、各种制剂及生物样品 常采用RP-HPLC 外标一点法定量 p421四含量测定四含量测定HPLC糖+苷元缩合苷氨基糖苷缩合氨基糖+苷元(碱性环己多元醇)第三节 氨基糖苷类抗生素Aminoglycosides antibioticsu 结构结构NHHOHNOHOHCNHH2NOCNHNH2OCH3CHOOHOOHNCH3OHOHCH2OH123
8、4561234512346链霉胍 链霉糖 N-甲基-L-葡萄糖胺 链霉双糖胺苷元糖结合较牢结合较弱一结构与性质链霉素链霉素 庆大霉素庆大霉素（庆大霉素（庆大霉素 C C 复合物）复合物）OCR1HNR3R21234612345612 345NH2OHOH2NNH2OOOHNHCH3OHCH35绛红糖胺 脱氧链霉胺 加洛糖胺糖苷元糖1.溶解性：溶解性：水溶性2.旋光性：旋光性：手性C3.碱性：碱性：多与硫酸成盐 碱性中心：链霉素3个，庆大霉素 5个 4.UV：链霉素：230nm处有紫外吸收庆大霉素：无无UV吸收吸收u 性质性质5 5稳定性稳定性 硫酸链霉素硫酸链霉素：水溶液在 pH5-7.5 条
9、件下，稳定 过酸或过碱易水解失效 硫酸庆大霉素：硫酸庆大霉素：对光，热，空气均较稳定 水溶液在 pH2-12 条件下也稳定(一一)麦芽酚麦芽酚(maltol)(maltol)反应反应 链霉素特征反应链霉素特征反应二鉴别试验HOHNOHOHNHOCNHH2NCHNNH2OCH3OHCHOOOHNCH3OHOHCH2OHOOOHCH3OOOCH3Fe/3H2ONaOHH+Fe 3+麦芽酚麦芽酚紫红色紫红色（二）坂口（二）坂口（SakaguchiSakaguchi）反应）反应 链霉素水解产物链霉素水解产物链霉胍链霉胍的特征反应的特征反应 链霉素NaOH水解链霉胍8-羟基喹啉or -萘酚NaBrONa
10、BrO产物1产物2橙红色产物OHOHN8-羟基喹啉-萘酚（三）光谱法（三）光谱法 IR UV：240-330nm 庆大霉素无无紫外吸收峰 链霉素B（甘露糖链霉素）1.来源来源：反应中间体2.方法方法：TLC中的杂质对照品法 杂质对照品：甘露糖 菌种发酵链酶素B甘露糖链酶素B苷酶甘露糖链酶素+三有关物质及组分分析（一）有关物质（一）有关物质 效价、毒副作用不同 Chp:Chp:规定控制各组分的相对百分含量规定控制各组分的相对百分含量发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致（二）庆大霉素（二）庆大霉素C组分测定组分测定1.测定方法测定方法：HPLC-衍生衍生UV法法(USP)衍生电化学检测（BP)蒸发
11、光散射检测（Ch.P)2.衍生法原理：衍生法原理：3.衍生方式：衍生方式：柱前衍生庆大霉素（氨基）+邻苯二醛+巯基醋酸pH10.4异吲哚衍生物max=330nmNRSCH2COOH4.分离模式分离模式：RP-离子对HPLC SP：ODS MP：水-冰醋酸冰醋酸-甲醇-庚烷磺酸钠庚烷磺酸钠5.定量方法：定量方法：峰面积归一化 Rf:某组分的峰面积；Rs:所有组分峰面积之和%100%sfRR含量6.6.讨论：讨论：流动相流动相：极性过强强，出峰慢 极性过弱弱，出峰快 离子对试剂离子对试剂：克服C 组分的异吲哚衍生物在ODS柱上的吸附，增加保留；衍生化试剂不形成离子对，保留值变化不大u 微生物检定法
12、：微生物检定法：各国药典采用，测定效价u HPLC：衍生化UV或电化学或蒸发光散射检测 离子对色谱法离子对色谱法：烷基磺酸盐为反离子 离子交换色谱法离子交换色谱法：酸性酸性条件下在阳离子交换柱上分离 反相色谱法反相色谱法四含量测定 例：HPLC-蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量 SP：ODS MP：三氟醋酸溶液-甲醇 分离模式：RP-离子对色谱 检测器：蒸发光散射蒸发光散射检测器工作原理蒸发光散射检测器工作原理 检测三步曲检测三步曲流动相要求：流动相要求：必须是挥发性的，不能含有缓冲盐必须是挥发性的，不能含有缓冲盐样品要求：样品要求：挥发性低于流动相挥发性低于流动相检测三步曲示意图检测三步曲示
13、意图色谱流出物与通入的气体混合雾化雾化蒸发蒸发除去流动相样品组分形成气溶胶强光照射气溶胶，产生散射光，检测检测一化学结构与性质一化学结构与性质（一）结构（一）结构 四并苯或萘并萘的衍生物OHOHOHOOOHHCONH2N(CH3)2HOHCH3H四环素*手性C14655a11ABCD第四节 四环素类抗生素OHOHOHOOOHHCONH2N(CH3)2ClOHCH3H金霉素OHOHOHOOOHHCONH2N(CH3)2HOHCH3OH土霉素氢键RR1R3R2多西环素：R3-羟基美他环素：R3-羟基1两性两性与溶解度与溶解度 弱酸性 弱碱性 与酸、碱均能成盐：多用盐酸盐 其盐：溶于水、酸或碱性溶液
14、，不溶于有机溶剂 游离四环素类游离四环素类：pH4.5-7.2 内难溶于水酚羟基、2个烯醇型羟基二甲胺基（二）性质（二）性质2紫外紫外和和荧光荧光性质性质 UV照射下，四环素类及其降解产物有荧光3不稳定性不稳定性干燥避光：游离形式和盐类都较稳定水溶液：对酸、碱、各种氧化剂（包括空气中的氧）都不稳定 差向异构化差向异构化 降解性质降解性质（1 1）差向异构化）差向异构化四环素金霉素4-差向四环素4-差向金霉素pH 2 6蓝色荧光淡黄黑可逆反应l PO43-、枸橼酸根、Ac-等阴离子：可加速差向异构化l 土霉素土霉素：不易差向异构化(氢键形成较稳定)OOHCONH2(CH3)2NOHHOOHCON
15、H2N(CH3)2HOHAApH2.06.0（2）降解性）降解性酸性下降解酸性下降解：6位上-OH与5a位上的H发生消去反应 四环素金霉素脱水四环素脱水金霉素pH 2max=445nmmax=435nmROHCH3OHOOHHRCH3OHOOHRCH3OHOHOH2ODDDCBBCBC脱水四环素类 碱性降解：碱性降解：ROHCH3OHROOHOOHCONH2NHOHCH3CH3CH3CH3ROHROOOHCONH2NHOHOCH3OOH-四环素异四环素1 1浓硫酸反应浓硫酸反应 可区别各种四环素类 盐酸四环素盐酸金霉素盐酸土霉素盐酸多西环素盐酸美他环素浓硫酸深紫色蓝绿朱红色黄色橙红色二鉴别试验
16、2 2三氯化铁反应三氯化铁反应 酚羟基的反应3 3TLCTLC EDTA作用：克服痕量金属离子造成的拖尾4.HPLC4.HPLC5.UV5.UV、IRIR有关物质有关物质 异构体，降解物 4-差向四环素（ETC）差向脱水四环素（EATC）脱水四环素（ATC）盐酸金霉素（CTC）盐酸四环素中有关物质的检查：HPLC 加校正因子的主成分自身对照法加校正因子的主成分自身对照法 不加校正因子的主成分自身对照法不加校正因子的主成分自身对照法 p438p438 三特殊杂质检查四含量测定HPLC法例：盐酸四环素的含测 RP-HPLC 三乙胺 p440 外标一点法 本章基本要求本章基本要求 掌握-内酰胺类抗生素的结构特征、理化性质 掌握-内酰胺类抗生素的呈色鉴别反应、HPLC含量测定方法
