1、l第一节 微生物的生长繁殖l一 什么叫微生物的生长、繁殖？l微生物生长(Growth)：是指细胞物质有规律地、不可逆增加的生物过程。l微生物繁殖(Reproduction)：是微生物生长到一定阶段由于细胞内各种细胞结构的复杂和重建导致产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的整个生物学过程。l单细胞微生物的生长：一个微生物个体应具备生长和繁殖的全能性。单细胞微生物的生长就是细胞的不断增大。l单细胞微生物的繁殖：但这种过程 在适宜的环境中，一种微生物如大肠杆菌（E.coli），从一个个体（细胞）出发，通过生长与繁殖，逐渐形成与秦代细胞相似的子代细胞，使得个体数量增加，这种现象与过程称为单细胞微生
2、物的繁殖。l微生物个体生长与个体繁殖是持续交替进行的，所导致的结果就是群体生长。因此，群体生长是以微生物的个体生长与繁殖为基础的。l多细胞微生物的生长只是细胞数量增加,不伴随个体数目的增加。l多细胞微生物的繁殖：如果不但细胞数目增加，个体数目也增加，则称为多细胞微生物的繁殖。l世代时间：细菌两次细胞分裂之间的时间。不同微生物的生长繁殖速度不同，所以世代时间也不同。原核微生物的繁殖速度比真核微生物快，专性厌氧菌的世代时间多数比好氧菌长。l对微生物群体生长的研究表明，微生物的群体生长规律因其种类不同而异，单细胞微生物与多细胞微生物的群体生长表现出不同的生长动力学特性。但就单细胞微生物来说，在特定的
3、环境中，不同种的微生物表现出趋势相近的生长动力学规律。l（一）、细菌纯培养生长曲线（分批培养）l是将某种单细胞微生物少量接种到恒定容积的液体培养基中培养，定时取样分析。以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标作图而的得到的生长曲线。图5-1 细菌的生长曲线l1迟缓期（Lag phase）:l2.对数期(Logarithmic phase):l3稳定期（Stationary phase）:l4衰亡期（Decline phase）:l细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少。迟缓期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一
4、般为14小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。l又称指数期(Exponential phage)。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。l细菌的世代时间Gl G=(t2-t1)/n l因为 n=3.3(lgX2-lgX1)l所以 G=(t2-t1)/3.3lg(X2/X1)l n：繁殖世代数；lX：不同时期的菌数。l1）生长速度为零，新生
5、=死亡，达到动态平衡；l2）活菌数的总量达到最大值；l 3）胞内的储藏物开始形成（如肝糖粒、脂肪粒等）；l 4）某些芽孢菌的芽孢开始形成；l 5）某些细菌过量积累次级代谢产物，如抗生素、维生素等。l1）营养物质耗尽，微生物进行内源呼吸；l2）有毒代谢产物产生，生长速率负增长；l3）细胞形态多样，出现畸形，形成衰退型；l4）蛋白水解酶活跃，出现细胞自溶现象；l 5）芽孢细菌芽孢大量释放。l纯培养纯培养(Pure culture)：微生物学中将在实验室条：微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养为纯培养l获得纯培养的技术获得
6、纯培养的技术l稀释平板分离法稀释平板分离法;平皿划线分离法平皿划线分离法;l单细胞挑取法单细胞挑取法;利用选择性培养基分离法利用选择性培养基分离法;l富集培养富集培养;l二元培养：是纯培养的一种特殊形式，主要用于二元培养：是纯培养的一种特殊形式，主要用于分离寄生微生物的方法。分离寄生微生物的方法。l 共培养共培养(Coculture).图图5-2 稀释平板分离法稀释平板分离法图图5-3 平皿划线分离法平皿划线分离法图图5-4 接种技术接种技术图图5-5 接种针与接种环接种针与接种环l培养的方法：分批培养、连续培养、同步培养。l(一)分批培养：将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养
7、基的容器内，保持一定的温度，pH和溶解氧量，微生物在其中生长繁殖；结果出现微生物数量由少变多，达到高峰又由多变少，甚至死亡的变化规律，即细菌的生长曲线。l(二)连续培养：有恒浊连续培养和恒化连续培养两种。l恒浊连续培养：使培养基中的细菌浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。通过调节进水流速，使浊度达到恒定。l恒化连续培养：维持培养基中的营养成分恒定，以恒定流速进水，以相同流速流出代谢产物，使细菌始终处于最高生长速度状态的培养方式。l 恒化连续培养尤其适合于污水生物处理。除了SBR法外，其余的污水生物处理法均采用恒化连续培养。入流 曝气池 出水l（三）同步培养：保持细菌的形态一致，处于同一生长阶
8、段。图5-6 连连 续续 培培 养养 法法 装装 置置 图5 7 恒浊与恒化培养控制装置恒浊与恒化培养控制装置同步培养同步培养通过机械方法和调控培养条件使某一群体中的所有微生物个体通过机械方法和调控培养条件使某一群体中的所有微生物个体细胞尽可能处于同一生长和分裂周期中，从而使细胞群体中各个细胞尽可能处于同一生长和分裂周期中，从而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，这种生长状态称为同步生长体处于分裂步调一致的生长状态，这种生长状态称为同步生长(synchronous growth)。l1 微生物总数的测定；l计数器计数法：血球计数板计数器计数法：血球计数板、细菌计数板细菌计数板、涂片染
9、色计数涂片染色计数法法、比浊法比浊法。l2 活菌数的测定；l平板菌落计数法平板菌落计数法、液体稀释培养测数液体稀释培养测数,MPN法）法）、l 薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法。l3 计算生长量:l干重法干重法、含氮量测定法含氮量测定法、DNA测定法测定法、其他生理指标测定其他生理指标测定法法、物质的消耗物质的消耗、产生量产生量、对氧的吸收对氧的吸收、发酵糖产酸量发酵糖产酸量、l二氧化碳的释放量等二氧化碳的释放量等。血球计数板血球计数板(1625)血球计数板血球计数板中格放大中格放大(2516)l1、2516计数室微生物数目的计算公式l微生物数目（个/ml）=A/80400101000稀释倍数lA
10、为80个小格内的微生物数目l2、1625计数室微生物数目的计算公式l微生物数目（个/ml）=A/100400101000稀释倍数lA为100个小格内的微生物数目l1充足的营养：必须有充足的营养物质才能为细菌的新陈代谢及生长繁殖提供必需的原料和足够的能量。l2适宜的温度：细胞生长的温度极限为-790。各类细菌对温度的要求不同，可分为嗜冷菌,最适生长温度为(1020)；嗜温菌,2040;嗜热菌,在高至5660生长最好。故实验室一般采用1830培养细菌。l有些嗜温菌低温下也可生长繁殖，如5冰箱内，金黄色葡萄球菌缓慢生长释放毒素，故食用过夜冰箱冷存食物，可致食物中毒。l3合适的酸碱度：在细菌的新陈代谢
11、过程中，酶的活性在一定的范围才能发挥。大多数细菌、藻类和原生动物的最适pH为6.57.5，它们的pH适应范围在410之间。l多数病原菌最适pH为中性或弱碱性（pH7.27.6）。人类血液、组织液pH为7.4，细菌极易生存。胃液偏酸，绝大从数细菌可被杀死。个别细菌在碱性条件下生长良好，如霍乱孤菌在pH8.49.2时生长最好;也有的细菌最适pH偏酸，如结核杆菌（pH6.56.8）、乳酸杆菌（pH5.5）。细菌代谢过程中分解糖产酸，pH下降，影响细菌生长，所以培养基中应加入缓冲剂，保持pH稳定。l4必要的气体环境：氧的存在与否和生长有关，有些细菌仅能在有氧条件下生长（好氧微生物，溶解氧的浓度在2mg
12、/L以上）；有的只能在无氧环境下生长（厌氧微生物，如甲烷要求溶解氧的浓度在1.4810-56mol/L以下才能生存）；而大多数病原菌在有氧及无氧的条件下均能生存。l一般细菌代谢中都需CO2，但大多数细菌自身代谢所产生的CO2即可满足需要。有些细菌，如脑膜炎双球菌在初次分离时需要较高浓度的CO2（510%），否则生长很差甚至不能生长。l消毒（Disinfection）杀灭病原微生物的方法。用以消毒的药物称为消毒剂(Disinfectants)一般消毒剂在常用浓度下，只对细菌繁殖体有效。对于芽胞则需要提高消毒剂的浓度和延长作用的时间。l灭菌（Sterilization）杀灭物体上所有的微生物（包括
13、病原体和非病原体的繁殖体和芽胞）的方法。因此，灭菌比消毒的要求高；但在日常生活中，消毒和灭菌这两个术语往往通用。l无菌（Asepsis）是指物体上或容器内无活菌存在的意思。无菌操作是防止微生物进入机体或其他物品的操作技术。l一、物理因素l（一）热力灭菌、（二）电磁波与射线l（三）滤过除菌法、（四）超声与超声波 l（五）干燥、（六）低温l二、化学因素l（一）化学消毒剂l（二）化学消毒剂的作用机制 l三 抗生素对微生物的影响 l（一）热力灭菌l高温对细菌有明显的致死作用。热力灭菌主要是利用高温使菌体变性或凝固，酶失去活性，而使细菌死亡。但是，更细微的变化已发生于细菌凝固之前。有人认为DNA单螺旋的
14、断裂可能是主要的致死因素。l此外，高温亦可导致胞膜功能损伤而使小分子物质以及降解的核糖体漏出。干热的致死作用与湿热不尽相同，一般属于蛋白变性、氧化作用受损和电解质水平增高的毒力效应。l1湿热灭菌法l 在同样的温度下，温热的杀菌效果比干热好，其原因有：蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。湿热灭菌的菌体蛋白质吸收水分，比在同一温度的干热空气中易于凝固。l温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高湿度。因而湿热灭菌比干热所要温度低，如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。l湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。湿热灭菌法包括：（1）煮
15、沸法：煮沸100，5分钟，能杀死一般细菌的繁殖体。许多芽胞需经煮沸56小时才死亡。水中加入2%碳酸钠，可提高其沸点达105。既可促进芽胞的杀灭，又能防止金属器皿生锈。煮沸法可用于饮水和一般器械（刀、剪、注射器等）的消毒。（2）流通蒸汽灭菌法：利用100左右的水蒸汽进行消毒，一般采用流通蒸汽灭菌器（其原理相当于我国的蒸笼），加热15到39分钟，可杀死细菌繁殖体。消毒物品的包装不宜过大、过紧，以利于蒸汽穿透。（3）间歇灭菌法：利用反复多次的流通蒸汽，以达到灭菌的目的。一般用流通蒸汽灭菌器，100加热1530分钟，可杀死其中的繁殖体；但芽胞尚有残存。取出后放37孵箱过夜，使芽胞发育成繁殖体，次日再蒸
16、一次，如此连续三次以上。本法适用于不耐高温的营养物（如血清培养基）的灭菌。l（4）巴氏消毒法（Pasteurization）：利用热力杀死液体中的病原菌或一般的杂菌，同时不致严重损害其质量的消耗方法。由巴斯德创用以消毒酒精类，故名。加温61.162.8半小时，或71.71530秒钟。常用于消毒牛奶和酒类等。l（5）高压蒸汽灭菌法：压力蒸汽灭菌是在专门的压力蒸汽灭菌器中进行的，是热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的一种方法。其优点是穿透力强，灭菌效果可靠，能杀灭所有微生物。l目前使用的压力灭菌器可分为两类：下排气式压力灭菌器和预真空压力灭菌器。适用于耐高温、耐水物品的灭菌。高压蒸汽高压蒸汽锅锅表面
17、皿的包装表面皿的包装吸管的包装吸管的包装试管的包装试管的包装棉塞的制作棉塞的制作l干热灭菌比湿热灭菌需要更高的温度与较长的时间。l（1）干烤：利用干烤箱，加热1601802小时，可杀死一切微生物，包括芽胞菌。主要用于玻璃器皿、瓷器等的灭菌。l（2）烧灼和焚烧：烧灼是直接用火焰杀死微生物，适用于微生物实验室的接种针等不怕热的金属器材的灭菌。焚烧是彻底的消毒方法，但只限于处理废弃的污染物品，如无用的衣物、纸张、垃圾等。焚烧应在专用的焚烧炉内进行。l(3)红外线：红外线辐射是一种0.771000微米波长的电磁波,有较好的热效应,尤以110微米波长的热效应最强。亦被认为一种干热灭菌。l红外线由红外线灯
18、泡产生,不需要经空气传导，所以加热速度快，但热效应只能在照射到的表面产生，因此不能使一个物体的前后左右均匀加热。l（4）微波：微波是一种波长为1毫米到1米左右的电磁波，频率较高，可穿透玻璃、塑料薄膜与陶瓷等物质，但不能穿透金属表面。l微波能使介质内杂乱无章的极性分子在微波场的作用下，按波的频率往返运动，互相冲撞和磨擦而产生热，介质的温度可随之升高，因而在较低的温度下能起到消毒作用。一般认为其杀菌机理除热效应以外，还有电磁共振效应，场致力效应等的作用。消毒中常用的微波有2450MHZ与915MHZ两种。微波照射多用于食品加工。在医院中可用于检验室用品、非金属器械、无菌病室的食品食具、药杯及其它用
19、品的消毒。l微波长期照射可引起眼睛的晶状混浊、睾丸损伤和神经功能紊乱等全身性反应，因此必须关好门后才开始操作。l1日光与紫外线l日光是有效的天然杀菌法，对大多数微生物均有损害作用，直射杀菌效果尤佳，其主要的作用因素为紫外线，此外，热与氧气起辅助作用。但光线效应受很多因素的影响，如烟尘笼罩的空气、玻璃及有机物等都能减弱日光的杀菌力。l紫外线是一种低能量的电磁辐射，波长范围为240280nm,最适的波长为260nm，这与DNA吸收光谱范围相一致。其杀菌原理是紫外线易被核蛋白吸收，使DNA的同一条螺旋体上相邻的碱基形成胸腺嘧啶二聚体，从而干拢DNA的复制，导致细菌死亡或变异。紫外线的穿透能力弱，不能
20、通过普通玻璃、尘埃，只能用于消毒物体表面及空气、手术室、无菌操作实验室及烧伤病房，亦可用于不耐热物品表面消毒。l2电离辐射l包括高速电子、X线和r线等。具有较高的能量与穿透力，可在常温下对不耐热的物品灭菌，故又称“冷灭菌”。其机理在于产生游离基，破坏DNA。可用于消毒不耐热的塑料注射器和导管等；亦能用于食品消毒而不破坏其营养成份。l将液体或空气通过含有微细小孔的滤器，只允许小于孔径的物体如液体和空气通过，大于孔径的的物体不能通过。主要用于一些不耐热的血清、毒素、抗生素、药液、空气等除菌。一般不能除去病毒、支原体和细菌的L型。l滤器的种类很多常用的有：l滤膜滤器（Membrane filter）
21、由硝基纤维素制成薄膜，装于滤器上，其孔径大小不一，常用于除菌的为0.22um。硝基纤维素的优点是本身不带电荷，故当液体滤过后，其中有效成分丧失较少。l蔡氏滤器（Seitz）是用金属制成，中间夹石棉滤板，按石棉K、EK、EK-S三种，常用EK号除菌。l玻璃滤器 是用玻璃细砂加热压成小碟，嵌于玻璃漏斗中一般为G1、G2、G3、G4、G5、G6六种，G5、G6可阻止细菌通过。l实验室等处应用的超净工作台，就是利用过滤除菌的原理去除进入工作台空气中的细菌。l每秒钟超过200，000次振动的声波不被人耳感受，称为超声波。l微生物对强度高的超声波很敏感。其中以革兰氏阴性菌最敏感，而葡萄球抵抗最强。虽然声波
22、强烈地振动可使菌群死亡，但往往有残存者。因此，这种方法在消毒灭菌方面无实用价值。主要用以裂解细胞分离提取细胞组分或制备抗原。超声波灭菌的机理尚不清楚，可能是细菌外表受细微气泡的作用，扰乱细胞内容物及破坏细胞壁致细菌崩解而死亡。l多数细菌的繁殖体在空气中干燥时很快死亡，例如脑膜炎双球菌、淋球菌、霍乱弧菌、梅毒螺旋体等。l有些细菌抗干燥力较强，尤其有蛋白质等物质保护时。例如溶血性链球菌在尘埃中存活25日，结核杆菌在干痰中数月不死。芽胞抵抗力更强，例如炭疽杆菌耐干燥20余年。l干燥法常用于保存食物。浓盐或糖渍食品，可使细菌体内水分逸出，造成生理性干燥，使细菌的生命活动停止。l1.重金属盐类：重金属盐
23、类：0.1%HgCl2、AgNO3等等。l2.氧化剂：氧化剂：KMnO4、H2O2、Cl2等等。l3.还原剂：甲醛等还原剂：甲醛等。l4.表面活性剂：表面活性剂：乙醇、酚、来苏儿等乙醇、酚、来苏儿等。l5.其它化学药物：其它化学药物：1%KOH、1%H2SO4、结晶紫等结晶紫等。l6.化学疗剂：抗生素、抗代谢物化学疗剂：抗生素、抗代谢物。l不同的化学消毒剂其作用原理也不完全相同，大致归纳为三个方面。一种化学消毒剂对细菌的影响常以其中一方面为主，兼有其他方面的作用。l（1）改变细胞膜通透性l 表面活性剂（Surface-active agent）、酚类及醇类可导致胞浆膜结构紊乱并干扰其正常功能。
24、使小分子代谢物质溢出胞外，影响细胞传递活性和能量代谢。甚至引起细胞破裂。l（2）蛋白变性或凝固 l酸、碱和醇类等有机溶剂可改变蛋白构型而扰乱多肽链的折叠方式，造成蛋白变性。如乙醇、大多数重金属盐、氧化剂、醛类、染料和酸碱等。l（3）改变蛋白与核酸功能基团的因子l 作用于细菌胞内酶的功能基（如SH基）而改变或抑制其活性。如某些氧化剂和重金属盐类能与细菌的-SH基结合并使之失去活性。l（1）消毒剂的性质、浓度与作用时间l各种消毒剂的理化性质不同，对微生物的作用大小也差异。例如表面活性剂对革兰氏阳性菌的灭菌效果比对革兰氏阴性菌好，龙胆紫对葡萄球菌的效果特别强。l同一种消毒剂的浓度不同，其消毒效果也不
25、一样。大多数消毒剂在高浓度时起杀菌作用，低浓度时则只有抑菌作用。在一定浓度下，消毒剂对某种细菌的作用时间越长，其效果也越强。若温度升高，则化学物质的活化分子增多，分子运动速度增加使化学反应加速，消毒所需要的时间可以缩短。l（2）微生物的污染程度 l微生物污染程度越严重，消毒就越困难，因为微生物彼此重叠，加强了机械保护作用。所以在处理污染严重的物品时，必须加大消毒剂浓度，或延长消毒作用的时间。l（3）微生物的种类和生活状态 l不同的细菌对消毒剂的抵抗力不同，细菌芽胞的抵抗力最强，幼龄菌比老龄菌敏感。l（4）环境因素 l当细菌和有机物特别是蛋白质混在一起时，某些消毒剂的杀菌效果可受到明显影响。因此
26、在消毒皮肤及器械前应先清洁再消毒。l（5）温度、湿度、酸碱度l 消毒速度一般随温度的升高而加快，所以温度越高消毒效果越好。湿度对许多气体消毒剂有影响。酸碱度的变化可影响剂杀灭微生物的作用。例如，季胺盐类化合物的戊二醛药物在碱性环境中杀灭微生物效果较好；酚类和次氯酸盐药剂则在酸性条件下杀灭微生物的作用较强。l（6）化学拮抗物 l阴离子表面活性剂可降低季胺盐类和洗比泰的消毒作用，因此不能将新洁尔灭等消毒剂与肥皂、阴离子洗涤剂合用。次氯酸盐和过氧乙酸会被硫代硫酸钠中和，金属离子的存在对消毒效果也有一定影响，可降低或增加消毒作用。l五、微生物对高温的抗性五、微生物对高温的抗性l嗜高温菌（高度好热菌）：
27、嗜高温菌（高度好热菌）：75 嗜亚高嗜亚高温菌温菌(中度好热菌中度好热菌):5575l高温菌耐高温机理高温菌耐高温机理l酶对热稳定酶对热稳定；核酸核酸G+C mol%较高较高,Tm值值较大较大；细胞膜长链脂肪酸含量高细胞膜长链脂肪酸含量高,主要是一主要是一些分支的长链饱和脂肪酸些分支的长链饱和脂肪酸(17,18和和19碳原子碳原子)保护因子保护因子,如金属离子如金属离子(Mg2+,Ca2+等等)和一些和一些低分子物质如多胺等低分子物质如多胺等。l六、微生物对重金属离子毒害的抗性六、微生物对重金属离子毒害的抗性 微生物一般对重金属的需要量极为微量，微生物一般对重金属的需要量极为微量，在在0.1m
28、g/L或更少即可满足，并有一定的刺激或更少即可满足，并有一定的刺激生长的作用。过量产生毒害。但也有某些微生长的作用。过量产生毒害。但也有某些微生物可生长在浓度已大大超过对生物产生毒生物可生长在浓度已大大超过对生物产生毒性的高含量重金属的环境中。性的高含量重金属的环境中。在高浓度环境中藻类、真菌、原生动物、在高浓度环境中藻类、真菌、原生动物、和细菌都有抗高浓度重金属的种类。和细菌都有抗高浓度重金属的种类。l微生物对重金属离子毒害的抗性机理微生物对重金属离子毒害的抗性机理l改变细胞膜透性，阻止金属离子进入细胞改变细胞膜透性，阻止金属离子进入细胞 产生某种螯合剂如胞外多糖，抵抗金属离产生某种螯合剂如
29、胞外多糖，抵抗金属离子的毒害子的毒害 通过酶促反应，使有毒物质转变通过酶促反应，使有毒物质转变成无毒化合物成无毒化合物l竞争关系l原始合作关系l共生关系l偏害关系l捕食关系l寄生关系l一、一、微生物菌种的保藏要求微生物菌种保藏的要求：l 是广泛收集各种研究、教学和生产性菌种，满足各方面需求；l 高质量保藏，即要求保藏的菌种不死亡、活性不衰老、特性不变异、分类不紊乱；l 随时可提供保持有原始特性的菌种用于交换和使用。l菌种保藏的基本原理是将微生物菌种保存在不利于微生物活跃生长和代谢的不良环境中，如干燥、低温、缺氧、黑暗、营养饥饿等等，使微生物代谢速率极为缓慢或处于休眠状态。而一旦恢复所保存菌种生长的正常环境和营养条件，即可获得具有高生理活性和保持原种优良性状的菌种培养物。l菌种保藏的方法有多种多样，常用方法简介如下：l1、培养物传代保藏法 l2、低温保藏法 l3、干燥保藏法l保藏菌种的活化是使用保藏菌种的第一步。活化的要求是使保藏菌种恢复旺盛的生命活动和显示其原有的代谢和生产性能。l保藏菌种的活化必须使用保藏菌种时使用的相同培养基和培养条件，或以保藏菌种生长和代谢最佳的培养基和培养条件，以使保藏菌种能迅速恢复其原有的代谢速率和生理特性。
