1、第六节第六节 脂质体制备技术脂质体制备技术2 一、概述一、概述 脂质体(liposome，或称类脂小球，液晶微囊)是指将药物包封于类脂质双分子层形成的薄膜中间所制成的超微型球状体，是一种类似微型胶囊的新剂型。1971年英国莱门(Rymen)等人开始将脂质体用药物载体。3 4 脂质体透射电镜图 二、脂质体的作用特点二、脂质体的作用特点 脂质体是以磷脂、胆固醇等类脂质为膜材，具有类细胞膜结构，故作为药物的载体，能被单核吞噬细胞系统吞噬，增加药物对淋巴组织的指向性和靶组织的滞留性。剂型的特点剂型的特点:制备工艺简单制备工艺简单,一般药物都较容易包封在脂质体中一般药物都较容易包封在脂质体中水溶性及脂溶
2、性两种类型药物都可包裹在同一脂质水溶性及脂溶性两种类型药物都可包裹在同一脂质体中体中毒性小毒性小,并且对人体无免疫抑制作用并且对人体无免疫抑制作用在体内使药物具有靶向性特征在体内使药物具有靶向性特征可制成免疫脂质体可制成免疫脂质体能降低药物毒性能降低药物毒性,增强药理作用增强药理作用能降低药物的消除速率能降低药物的消除速率,延长药物作用时间延长药物作用时间,增强药增强药物体内外稳定性物体内外稳定性7 靶向性靶向性 被动靶向性被动靶向性 物理化学靶向性物理化学靶向性 转移靶向性转移靶向性 主动靶向性主动靶向性 长效性长效性 组织相容性与细胞亲和性组织相容性与细胞亲和性 降低药物毒性降低药物毒性
3、提高药物稳定性提高药物稳定性三、脂质体的组成、类型和理化性质（一）（一）制备脂质体的材料制备脂质体的材料 脂质体的膜材主要由磷脂与胆固醇构成，这两种成分不但是形成脂质体双分子层的基础物质，而且本身也具有极为重要的生理功能，由它们所形成的“人工生物膜”易被机体消化分解，不像合成微囊(如尼龙微型胶囊)那样往往在机体中难以排除。10 1、磷脂类 磷脂类包括卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂以及其它合成磷脂等都可以作为脂质体的双分子层基础物质。我国研究脂质体，以采用大豆磷脂最为适宜，因其成本比卵磷脂低廉，乳化能力强，原料易得，是今后工业生产脂质体的重要原料，而卵磷脂的成本要比豆磷脂高得多，不宜大量生产。11 磷
4、脂为天然生理化合物，其生理功能：(1)可使巨噬细胞应激性增强，即巨噬细胞数增加，吞噬功能增强；(2)使血红蛋白明显增高；(3)增加红细胞对抵抗力，使红细胞在低渗液中避免溶血作用；12 (4)磷脂与胆固醇在血液中应维持一定比例，磷脂在血浆中起着乳化剂的作用，影响胆固醇化脂肪的运输沉着，静脉给予磷脂，可促进粥样硬化斑的消散，防止胆固醇引起的血管内膜损伤；(5)能增强纤毛运动，肌肉收缩，加速表皮愈合，增强胰岛素功能、骨细胞功能及神经细胞功能。13 2、胆固醇 胆固醇与磷脂是共同构成膜和脂质体的基础物质。胆固醇具有一定的抗癌功能，在人体血液中的白细胞中有一种称为“噬异变细胞的白血球”分泌出一种抗异变素
5、来杀伤和吞噬异变癌细胞，从而使癌细胞去活力。14 血液中的胆固醇是维持这种噬异变细胞白血球生存必不可少的物质。如果血液中胆固醇过低，噬异变细胞白血球对癌症的辨别能力和分泌抗异变素的能力显著降低。所以认为胆固醇也具有一定的抗癌能力。还有报道指出卵磷脂能够使胆固醇阻留在血液中，使血液中胆固醇量提高，有利于抗癌作用的发挥。15 (二二)脂质体结构原理脂质体结构原理 脂质体结构原理与由表面活性剂构成的胶团不同，后者是由单分子层组成，而脂质体是由双分子层所组成。胶团溶液用肉眼观察，呈透明状；而脂质体是用类脂质(如卵磷脂，胆固醇等)构成双分子为膜材包合而成。16 17 磷脂的结构式中含有一个磷酸基团和一个
6、含氨的碱基(季铵盐)，均为亲水性基团，还有两个较长的烃链为亲油团。分子中磷酸部分极性很强，溶于水；但烃链R与R为非极性部分，不溶于水。18 21 把类脂质的醇溶液倒入水面时，醇很快地溶解于水，而类脂分子则排列在空气-水的界面上，它们的极性部分在水里，亲油的非极性部分则伸向空气中，当极性类脂分子被水完全包围时，其极性基团面向两侧的水相，而非极性的烃链彼此面对面缔合成双分子而形成球状。22 胆固醇亦属于两亲物质，其结构上亦有亲油和亲水两种基团，从胆固醇的结构来看，其亲油性较亲水性强。用磷脂与胆固醇作脂质体的膜材时，必须先将类脂质溶于有机溶剂中配成溶液，然后蒸发除去有机溶剂，在器壁上使成匀的类脂质薄
7、膜，此薄膜是由磷脂与胆固醇混合分子相互间隔定向排列的双分子层所组成。（三）脂质体的类型1.根据结构和粒径分类24 （1）单室脂质体(unilamellar vesicles,ULV)球径0.020.08m为小单室脂质体(single unilamellar vesicles,SUV)，0.11m为大单室脂质体(large unilamellar vesicles,LUV)，水溶性药物的溶液只被一层类脂质双分子层所包封，脂溶性药物则分散于双分子层中。凡经超声波分散的脂质体悬液，绝大部分为单室脂质体。25 （2）多室脂质体(multilamellar vesicles,MLV)球径 15m，有几层
8、脂质双分子层将包含的药物(水溶性药物)的水膜隔开，形成不均匀的聚合体，脂溶性药物则分散于几层分子层中。26 （3）大多孔脂质体(Multivesicular vesicles,MVV)球径约0.130.06m，单层状，比单室质体可多包封10倍的药物。2.按脂质体性能分类（1）一般脂质体（2）特殊性能脂质体 热敏脂质体 pH敏感脂质体 多糖被复脂质体 免疫脂质体 光敏脂质体或磁性脂质体3.按脂质体荷电性分类（1）中性脂质体（2）负电性脂质体（3）正电性脂质体4.按用途和给药途径分类（1）聚合膜脂质体（2）气雾化脂质体（3）其他 静脉滴注脂质体 口服给药脂质体 眼部用药脂质体 粘膜给药脂质体 外用
9、脂质体 经皮给药脂质体（四）脂质体的理化性质相变温度(phasetransitiontemperature)当升高温度时脂质双分子层中酰基侧链从有序排列变为无序排列，这种变化引起脂膜的物理性质一系列变化，可由“胶晶”态变为“液晶”态，膜的横切面增加，双分子层厚度减小，膜流动性增加，这种转变时的温度称为相变温度。脂质体荷电性 含酸性脂质如磷脂酸(PA)和磷脂酰丝氨酸(PS)等的脂质体荷负电，含碱基(胺基)脂质例如十八胺等的脂质体荷正电，不含离子的脂质体显电中性。脂质体表面电性与其包封率、稳定性、靶器官分布及对靶细胞作用有关。测定方法：荧光法显微电泳法3脂质体粒径和粒度分布测量显微镜法电子显微镜法
10、Coulter计数法激光散射法离心沉降法微孔滤膜吸光度法 33 四、脂质体的制法四、脂质体的制法 1、薄膜分散法 将磷脂、胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶于氯仿(或其他有机溶剂中)然后将氯仿溶液在茄形瓶中旋转蒸发，在瓶内壁上形成一层薄膜；将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液中，加入烧瓶中不断搅拌，即得脂质体。34 2、注入法 将磷脂与胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶于有机溶剂中(一般多采用乙醚)，然后将此药液经注射器缓缓注入加热至50(并用磁力搅拌)的磷酸盐缓冲液(或含有水溶性药物)中，加完后，不断搅拌至乙醚除尽为止，即制得大多孔脂质体，其粒径较大，不适宜静脉注射。再将脂质体混悬液通过高压乳匀机二次，则所得成
11、品大多为单室脂质体，少数为多室脂质体，粒径绝大多数在1m以下。35 3、超声波分散法 将水溶性药物溶于磷酸盐缓中，加入磷脂，胆固醇与脂溶性药物共溶于有机溶剂的溶液，搅拌蒸发除去有机溶剂，残液以超声波处理，然后分离出脂质体再混悬于磷酸盐缓冲液中，制成脂质体的混悬型注射剂。经超声波处理大多为单室脂质体，所以多室脂质体经超声波进一步处理亦能够得到相当均匀的单室脂质体。36 4、冷冻干燥法 脂质体亦可用冷冻干燥法制备，对遇热不稳定的药物尤为适宜。先按上述方法制成脂质体悬液后分装于小瓶中，冷冻干燥制成冻干燥制剂，惟全部操作应在无条件菌条件下进行。5、其它方法，如逆相蒸发法、复乳法、熔融法、表面活性剂处理
12、法、离心法、前体脂质体法和钙融合法等。37 (六)脂质体的作用特点 脂质体在体内细胞水平上的作用机制有吸附、脂交换、内吞(endocytosis)、融合(fusion)等。38 体内作用途径体内作用途径 1、膜间转运与接触释放39 2、吸附与融合40 3、内吞41 脂质体广泛用作抗癌药物载体，具有以下作用特点：1、淋巴系统定向性 抗癌药物包封于脂质体中，能使药物选择性地杀伤癌细胞或抑制癌细胞的繁殖，增加药物对淋巴的定向性，使抗癌药物对正常细胞和组织无损害或抑制作用，改变药物在组织中分布。因此，用脂质体为载体的抗癌药物新剂型能使药物的疗效提高，减少剂量，降低毒性，减轻变态和免疫反应。42 如甲氨
13、蝶呤的脂质体给小鼠静脉注射后，被巨噬细胞吞噬速度快，不像游离药物3小时内即被肾排泄；6小时后在肝、脾、肾、肠、肺等组织中的浓度比游药物高20倍。Juliano 等对放线菌素D、长春花碱、柔红霉素、阿糖胞苷脂质体的体内分布进行了研究，发现制成脂质体后组织内分布大大改变，在组织中包封的药物量大大增加。43 如阿糖胞苷脂质体注射16小时后，包封药物在肝中的浓度比游离药物大68倍，包封的阿糖胞苷在316小时内消除很少，尤其在肝中；放线菌素D脂质体注射3小时后，各种组织中包封的药物为游离的2-20倍；44 丝裂霉素C包封于脂质体中，静脉给药后，此超微粒载体能透入癌细胞内，然后逐渐释放药物，引起癌细胞裂解
14、与死亡。有关抗癌药物采用脂质体为载体的报导很多，其它尚有氟脲嘧啶、博莱霉素、门冬酰酶、8-氮杂鸟嘌呤、6-巯嘌呤等。这些化疗药物包封于脂质体中，给带瘤小鼠腹腔注射后，存活率和存活时间都有不同程度的增加。45 2、脂质体中药物释放过程 包在脂质体内药物释放，有的是通过内吞作用被体内网状内皮系统的吞噬细胞作为外来异物所吞噬。有的是融合作用(Fusion)，即脂质体的膜材与细胞膜构成物相似而融全进入细胞内。46 凡带电荷和液体中性的脂质体主要通过细胞内吞作用进入溶酶体，然后裂解释放出药物。由于溶酶体的通透性有限，故分子的药物就不能释放到细胞的其它部位，而融合作用往往不受这种限制，因此脂质体的释放药物
15、是具有选择性的。47 3、使抗癌药物在靶区具有滞留性 由于肿瘤细胞中含有比正常细胞较高浓度的磷酸酶及酰酶、因此将抗癌药物包制成脂质体，不仅由于酶使药物容易释出，且可促使药物中肿瘤细胞部位特异地蓄积。因此，如将包封于脂质体的抗癌药物直接注入瘤体，能使局部有效的药物浓度维持较长的时间，利于杀癌细胞。48 4、脂质体在体内的生物运转 静脉注射甲氨喋呤脂质体制剂，考察它的血药浓度及各脏器的分布。结果显示与静注单纯的甲氨喋呤喋比较，脂质体制剂长时间高浓度地滞留于血液中，而尿中排泄却显著迟缓。且经超声波处理的脂质体比用薄膜分散法制成的脂质体维持更高的血药浓度。49 如以对照(静注甲氨喋呤水溶液)4小时的血
16、药浓度为1，则薄膜分散法制剂的血药浓度为10，超声波处理的脂质体制剂为70。各脏器中的分布浓度差别更大，对照组中，各脏器的分布浓度都很低，而脂质体制剂组中，脾和肝的分布浓度非常高，这种体内分布的奇特现象可能与脂质体所带电荷状态以及它与脏器细胞膜的相互作用形式相关。50 5、延缓释药 药物包封于脂质体后在体内延缓释放，延长作用时间，如将白蛋白、放线菌素D和5氟脲嘧啶包封于经超声波处理的大脂质体中，注射于小白鼠睾丸中能延缓释药。51 6、控制药物在组织内分布与在血液内的清除率 小分子药物如氟脲嘧啶等可以从载扩散到血液中；大分子药物如酶类不易扩散，主要转运到肝和脾，而放线菌素D、秋水仙碱则留在载体内
17、并到达靶区。52 文献报导当柔红霉素分别与NAD(辅酶)和聚谷氨酸结合时，能大大增加这两种药物在脂质体中的滞留时间。通过改变脂质体的面积大小，表面电荷和组成成份，可以改变脂质体在给药部位的消除速度以及进入靶区的速度。毫微型的脂质体经静脉注射后，在血液中可维持较长时间，并可直接到达肿瘤组织内，而同样的脂质体经肌肉注射后，则集中于淋巴结中。53 7、对瘤细胞的亲合性 国内文献报导利用显微放射自显影方法，研究H-油酸在艾氏腹水癌细胞的代谢定位。取接种艾氏腹水癌细胞7天后的小白鼠，将H-油酸的剂量以100mg/kg由小鼠尾静脉注入，1小时后的显微放射自显影表明，H-油酸分布在腹水癌细胞周围，可以看到大
18、量的H-油酸的放射性铝颗粒定位在癌细胞膜上，并具有一定亲合力。油酸在艾氏腹水癌的代谢定位，尤其是在细胞核及分裂相细胞的纺锤体中分布，可能与油酸的抗癌作用密切相关。54 酸不稳定性抗生素如青霉素G或V的钾盐口服容易被胃酸破坏，如制成脂质体，则可保护和改善不稳定性抗生素的口服吸收效果。五、脂质体的稳定性研究和质量控制五、脂质体的稳定性研究和质量控制（一）脂质体的稳定性研究 1化学稳定性研究（1）温度对氧化反应的影响（2）脂质体类型对氧化反应的影响（3）抗氧剂对氧化反应的影响（4）金属离子的影响（5）辐射和电离辐射的影响（6）脂质体膜材的水解反应 2物理稳定性研究（1）脂质体中药物渗漏率考察（2）凝
19、聚速率的测定（3）测定相转化温度法（4）沉降分析法（5）库尔特(Coulter)计数法（6）核磁共振(NMR)法（7）其它方法 3在血浆中的稳定性 含药脂质体进入血循环到达靶部位前，必须保持完整形态。测定的方法：将脂质体样品加入人的血浆，于透析管中37孵育，测定不同时间从脂质体中渗出药物的量，并同时在显微镜下观察脂质体形态变化。（二）脂质体的质量评价 1大小与形态观察 2主药含量测定 3体外释放度测定 4包封率测定 包封率脂质体中药量（介质中的药量脂质体中的药量）影响脂质体包封率的因素有：（）药物的性质和浓度（）脂质体的制备方法和结构类型（）类脂膜的组成（）溶剂组成 5渗漏率的测定渗漏率贮存一定时间后渗漏到介质中的药量贮存前包封的药量6药物体内分布的测定
