1、食品微生物学刘书亮微生物的遗传变微生物的遗传变异与菌种选育异与菌种选育（2）第五章第五章5.3 微生物的基因重组微生物的基因重组基因重组（遗传传递）：指遗传物质从一个微生物基因重组（遗传传递）：指遗传物质从一个微生物细胞向另一个微生物细胞传递细胞向另一个微生物细胞传递(接触或不接触接触或不接触)而而达到基因的改变，形成新遗传型个体的过程。达到基因的改变，形成新遗传型个体的过程。原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组噬菌体的基因重组噬菌体的基因重组真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组食品微生物学刘书亮1.转化：转化：1928，Griffith2.转导：转导：1951，Lederberg和和
2、 Zinder3.接合：接合：1946，Lederberg 和和 Tatum4.溶原性转变溶原性转变一、原核微生物的基因重组一、原核微生物的基因重组食品微生物学刘书亮转化转化：受体细胞直接吸收供体细胞的受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段片段,并与其染色并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性状的现象。传性状的现象。转化（转化（transformation）转化因子转化因子受体细胞受体细胞感受态感受态转化子转化子高高1000倍倍吸附吸收吸附吸收整合整合供体供体(strR)ds DNA感受态受体感受态受体(strS)酶
3、解与吸收单链酶解与吸收单链同源区段配对同源区段配对单链整合单链整合复制与分离复制与分离转化子转化子(strR)非转化子非转化子(strS)转化因转化因子进入子进入细胞细胞 转化因转化因子单链子单链配对与配对与整合整合 复制复制 分离分离 转导（转导（transduction）转导：转导：利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。前者部分遗传性状的现象。由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为转导子转导子（t
4、ransductant）携带供体部分遗传物质（携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为片段）的噬菌体称为转导噬菌体。转导噬菌体。细菌转导的二种类型：普遍性转导普遍性转导特异性转导特异性转导1、普遍性转导（、普遍性转导（generalized transduction）通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性转导。转导。(1)意外的发现意外的发现 1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了
5、证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌LT22A（P22）和LT2 实验：用“U”型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌 另一株LT2是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的(在接种LT22A的一端出现了原养型)（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）沙门氏菌的普遍性转导沙门氏菌的普遍性转导 进入受体的外源进入受体的外源D
6、NA通过与细胞染色体的通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子重组交换而形成稳定的转导子（完全转导）（完全转导）如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌DNA片段后，在其体内片段后，在其体内不不发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。这种转导被称为这种转导被称为流产转导流产转导.供体片段供体片段单单线线传传递递大肠杆菌中大肠杆菌中噬菌体的正常裂解及半噬菌体的正常裂解及半乳糖基因转导噬菌体的形成过程乳糖基因转导噬菌体的形成过程galbiogalbiogalbiogalbiobiogal正常
7、正常误切误切 溶原性转变（lysogenic conversion）：一个与转导相似又不同的现象定义:温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。溶原性转变与转导的不同？溶原性转变与转导的不同？a）噬菌体不携带任何供体菌的基因；b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；接合接合(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！为减少所培养的结果是回复突变的机会，采用双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想上的。F
8、菌株高出几百高出几百倍以上倍以上 食品微生物学刘书亮F+F-F+F-F+F+F+F+起点起点接合管接合管断裂断裂进入进入滚环复制滚环复制合成互补链合成互补链分开分开接合管接合管染色体染色体DNAF因子因子复制起点，复制起点，开始复制开始复制1条链进入条链进入复制互补链复制互补链重组重组易断裂易断裂食品微生物学刘书亮二、噬菌体的基因重组二、噬菌体的基因重组 烈性噬菌体烈性噬菌体 噬菌体噬菌体h+r-h-r+产生的四种子裔噬菌体形成的噬菌斑产生的四种子裔噬菌体形成的噬菌斑 透明而小透明而小半透明而大半透明而大半透明而小半透明而小透明而大透明而大温和性噬菌体：温和性噬菌体：溶原现象。溶原现象。无速溶
9、性状无速溶性状,寄寄主范围扩大主范围扩大寄主范围正常寄主范围正常,但具速溶性状但具速溶性状食品微生物学刘书亮1.有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生染色体有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。重组，并产生新遗传型后代的一种方式。2.准性生殖：指不经过减数分裂就能导致基因重组准性生殖：指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。染色体的交换和减数分裂不规则。的生殖过程。染色体的交换和减数分裂不规则。菌丝联结：菌丝联结：形成异核体：独立生活。形成异核体：独立生活。核融合核融合(2倍体倍体)：10-5-10-7分离子的产生：有丝分裂过程中染色体会发生交换分离子
10、的产生：有丝分裂过程中染色体会发生交换和单倍体化和单倍体化。三、真核微生物的基因重组三、真核微生物的基因重组5.4 微生物的菌种选育微生物的菌种选育食品微生物学刘书亮 方法、地点、时间和周围环境记录方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：物获得单个菌落：1稀释平板稀释平板(倾注倾注/涂布涂布)分离法分离法 2平板划线分离法平板划线分离法 一、自然界工业菌种筛选程序一、自然界工业菌种筛选程序目标菌目标菌数量少数量少问题？具体实例问题？具体实例/如何鉴定如何鉴定食品微生物学刘书亮1、步骤和方法、步骤和方法原菌株（出发菌株）原菌株（出发菌株）纯化
11、纯化细胞或孢子悬浮液细胞或孢子悬浮液诱变处理诱变处理中间培养中间培养突变株分离突变株分离初筛初筛复筛复筛生产性试验生产性试验诱变预备实验诱变预备实验活细胞计数活细胞计数离心收集菌体离心收集菌体离心洗涤离心洗涤玻璃珠振荡分散玻璃珠振荡分散过滤过滤活细胞计数活细胞计数物理方法：物理方法：紫外线、紫外线、射线、等离子等射线、等离子等化学方法：化学方法：与碱基反与碱基反应、碱基类似物、移应、碱基类似物、移码突变剂码突变剂复合法：复合法：形态突变：形态突变：淘汰淘汰平皿反应：平皿反应：挑取变异菌挑取变异菌株（变色圈、透明圈、株（变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等）生长圈、抑菌圈等）二、诱变育种二、诱变育种
12、90-99.9%食品微生物学刘书亮2.筛选方法筛选方法（1）抗药性突变型的筛选）抗药性突变型的筛选食品微生物学刘书亮（2）营养缺陷型突变体的筛选）营养缺陷型突变体的筛选什么叫营养缺陷型菌株什么叫营养缺陷型菌株?？指某些微生物通过诱变处理使其在一些营养物质的指某些微生物通过诱变处理使其在一些营养物质的合成能力上出现缺陷，不能合成，只能外源提供。合成能力上出现缺陷，不能合成，只能外源提供。明确几种培养基明确几种培养基:基本培养基基本培养基(MM)完全培养基完全培养基(CM)补充培养基补充培养基(SM)食品微生物学刘书亮营养缺陷型菌株筛选步骤营养缺陷型菌株筛选步骤诱变处理诱变处理淘汰野生型菌株淘汰野
13、生型菌株(浓缩缺陷型浓缩缺陷型)检出缺陷型检出缺陷型确定生长谱确定生长谱食品微生物学刘书亮抗生素法抗生素法:诱变处理液在诱变处理液在MM中培养短时中培养短时,野生型生野生型生长活化长活化,缺陷型处于缺陷型处于“休眠休眠”,加入抗生素加入抗生素,杀死野生杀死野生型型,保存缺陷型保存缺陷型.青霉素、制霉菌素。青霉素、制霉菌素。菌丝过滤法菌丝过滤法：丝状真菌。野生型孢子萌发菌丝而缺：丝状真菌。野生型孢子萌发菌丝而缺陷型不能，过滤除去菌丝，反复几次，达到浓缩。陷型不能，过滤除去菌丝，反复几次，达到浓缩。差别杀菌法差别杀菌法：细菌芽孢较营养体耐热。：细菌芽孢较营养体耐热。诱变处理诱变处理:同一般诱变处理
14、同一般诱变处理.淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株：百分之几至千分子几：百分之几至千分子几食品微生物学刘书亮检出缺陷型检出缺陷型：方法四种方法四种基本培养基基本培养基含诱变处理后菌液的含诱变处理后菌液的基本培养基基本培养基基本培养基基本培养基第1次长出的菌落第2次长出的菌落夹层培养法夹层培养法完全培养基（第完全培养基（第1次培养后，再倒）次培养后，再倒）食品微生物学刘书亮逐个检出法逐个检出法完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基基本培养基基本培养基食品微生物学刘书亮影印法影印法食品微生物学刘书亮限量补充培养法限量补充培养法补充培养基补充培养基(如如0.01%蛋白胨蛋白胨)含菌的基本培养基含菌的基本
15、培养基食品微生物学刘书亮确定生长谱确定生长谱含菌含菌MM含某生长含某生长因子因子MM食品微生物学刘书亮三、杂交育种三、杂交育种基因重组是杂交育种的理论基础。前述。基因重组是杂交育种的理论基础。前述。亲本菌株（供体和受体）已知性状；有方向性亲本菌株（供体和受体）已知性状；有方向性食品微生物学刘书亮四、原生质体育种四、原生质体育种将遗传性状不同的两种菌（种内、间、属间）融合将遗传性状不同的两种菌（种内、间、属间）融合为一个新细胞的技术。为一个新细胞的技术。五、基因工程技术用于工业菌种改良五、基因工程技术用于工业菌种改良基因工程技术：基因操作、基因克隆、DNA重组。是将含目的基因DNA片段经体外操作
16、与载体连接，转入一个受体细胞并使之扩增、表达的过程。目的基因目的基因载体选择载体选择体外重组体外重组导入细胞导入细胞筛选筛选鉴定鉴定分离、合成、逆转为分离、合成、逆转为cDNA、PCR扩增等扩增等质粒、噬菌体、病毒质粒、噬菌体、病毒工具酶、连接酶工具酶、连接酶原核细胞（转化、感染等）；真核细胞（微量注原核细胞（转化、感染等）；真核细胞（微量注射法、电穿孔法、基因枪法等）射法、电穿孔法、基因枪法等）抗性等抗性等食品微生物学刘书亮5.4 微生物菌种的退化、复壮与保藏微生物菌种的退化、复壮与保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：
17、a）变异）变异b）污染）污染c）死亡）死亡食品微生物学刘书亮一、菌种退化与复壮一、菌种退化与复壮（一）菌种退化现象（一）菌种退化现象1.概念：菌株生产性状的劣化或遗传标记的丢失。概念：菌株生产性状的劣化或遗传标记的丢失。2.退化的表现退化的表现1）原有形态形状变得不典型；）原有形态形状变得不典型；2）生长速度变慢；）生长速度变慢；3）代谢产物生产能力下降；）代谢产物生产能力下降；4）致病菌对宿主侵袭力下降；）致病菌对宿主侵袭力下降；5）对外界不良环境的抵抗力下降。）对外界不良环境的抵抗力下降。（二）菌种退化原因（二）菌种退化原因1）根本原因在于基因自发突变根本原因在于基因自发突变；2）传代次数
18、影响,使负突变株的比例逐渐占优势3）与培养条件有关。退化是发生在微生物细胞群体中的一个由量变到质变量变到质变的逐步演变的过程。食品微生物学刘书亮1.合理的育种合理的育种;2.选用合适的培养基选用合适的培养基;3.创造良好的培养条件创造良好的培养条件4.控制传代次数控制传代次数5.用不同类型的细胞进行接种传代用不同类型的细胞进行接种传代6.采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法（三）菌种退化的防治（三）菌种退化的防治(p172)食品微生物学刘书亮（四）、菌种的复壮（四）、菌种的复壮1.衰退群体衰退群体少数个体（未退化），重新获得具有少数个体（未退化），重新获得具有 原有典型性状的菌种原有典
19、型性状的菌种(狭义复壮狭义复壮，消极措施，消极措施)。2.有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 维护工作中不断筛选维护工作中不断筛选“正变正变”个体个体(广义复壮广义复壮，积极措施，积极措施)。a）纯种分离;（有哪些方法？见下一页）b）通过寄主进行复壮；二、菌种的保藏二、菌种的保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱、不污染在一定时间内使菌种不死、不变、不乱、不污染基本要求：基本原理：创造一个微生物代谢不活动、生长受抑制（休眠）环境条件创造一个微生物代谢不活动、生长受抑制（休眠）环境条件（干燥、低温、真空、缺营养、添加保护剂、酸
20、度中和剂）（干燥、低温、真空、缺营养、添加保护剂、酸度中和剂）基本方法：生活态生活态休眠态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥食品微生物学刘书亮菌种保藏机构菌种保藏机构 由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。食品微生物学刘书亮复习思考题复习思考题
