1、鱼类生殖内分泌学研究进展鱼类生殖内分泌学研究进展 一诱导淡水养殖鱼类繁殖的新技术发展阶段：鱼类脑垂体匀浆液-HCG-林彼方法半咸水鱼类在淡水中催乳素（PRL）具有高水平，它抑制GnRH的释放，从而抑制GTH，这是鱼在淡水中不育的原因，现通过外源性神经介质儿茶酚乙胺抑制PRL分泌，从而促使GTH分泌，促使性腺发育成熟排卵，这是诱导半咸水鱼类性腺发育成熟的新途径。二诱导海水养殖鱼类繁殖的新技术1诱导海水鱼类性腺发育成熟和改善卵子质量（1）脑高活性GnRH-A；（2）垂体鲤鱼脑垂体匀浆液或HCG；（3）性类固醇激素（T，E2）或其前体（雄烯二酮，ADSD）应用：埋植MT和ADSD促进鳗鲡性腺发育成熟
2、的作用 脑区GnRH升高，垂体和血清GTH升高，性激素升高，雄鳗4次、雌鳗8次埋植后即可成熟。（4）必需脂肪酸（PUFA）对改善卵子质量和提高生殖能力起重要作用。高不饱和脂肪酸促使卵黄蛋白原合成，加速卵母细胞发育成熟和提高卵子质量，产卵量提高，卵受精率、孵化率提高。雄激素生成、排精期延长、精液量增加。22：6W3 ：20：5W3 ：20：4W6 eg 人工诱导成熟鳗鲡产出的卵子，W3、W6含量明显低于正常发育成熟的鱼类，所以认为，PUFA的欠缺可能是诱导鳗鲡较低受精率、孵化率和幼鱼成活率的主要原因之一。2诱导海水鱼类产卵、排卵主要刺激因子是GnRH（神经内分泌因子）。分析3种GnRH（sGnR
3、H，cGnRH-，sbGnRH）及其类似物对条纹鲈垂体GTH释放的活性，表明cGnRH-及其类似物活性最强，但不如目前正推广使用的（D-Ala6 Pro9-LRH-A）。哺乳类LRH-A的特点：能抵抗体内酶的降解作用，和受体有更强的亲和力。LRH-A的缓释制品有两种类型：非降解的埋植鱼体内的类型 用乙烯聚合物和LRH-A混合制成 的小丸，肌肉或腹腔埋植。可降解的注射/埋植鱼体内的类型 用胆固醇、胆固醇-纤维素、聚合脂肪酸二聚体一葵二酸、DL-乳酸乙醇酸共聚物和LRH-A混合制成微球，肌肉或腹腔注射。用不同的缓释制品混合，缓慢释放，可持续30天以上-排精、排卵期延长。3 诱导海水鱼类提早性成熟和
4、性别转化 鲷科鱼类：先雄后雌，鮨科：先雌后雄（1）通过性类固醇激素的处理（2）通过环境因素（如较高温度）和饵料的调控促使鱼类提早成熟（3）利用雌雄激素诱导雌雄同体鱼类提早性转化（牙鲆投喂AI抑制arom表达提早性转化）下丘脑视前区GnRH细胞群对启动或传递雌雄同体鱼类性腺和行为转变起中枢调节作用。4调控海养鱼类在全年都能性腺成熟和产卵利用环境因素（温度，光照，营养等）和激素的作用。如舌齿鲈，持续长光照-产卵期延缓，反之可提前30天左右。三人为的“环境激素”对鱼类生殖的影响环境激素（EDCs）：影响和扰乱内分泌活动的化学物质，影响鱼类、人类的生殖能力，雄鱼雌性化、雌雄同体率增多、雄性退化、导致种
5、群退化。作用机理：A 起内源激素类似物的作用B 起芳香烃（Ah）受体的激动剂的作用 诱导肝脏细胞色素P450酶类的合成影响生长因子及其受体的表达。C 影响免疫系统功能阻碍胸腺素的产生，使淋巴细胞数量下降。D 影响维生素的代谢四.鱼类的性别决定和分化与脊椎动物相比，鱼类的性别种类相当复杂，既有雌雄异体（gonochorism），又有雌雄同体（hemaphroditism）和单性生殖（unisexuality）。其中，雌雄同体又可分为同时具有两性者和不同时具有两性者即可性逆转者（sex reversal）。鉴于鱼类的性别种类非常复杂，其性别决定和性别分化也颇具多变性，为了更好地了解脊椎动物性别决定
6、和性别分化的机制及其系统演化过程，为了能为鱼类水产养殖中进行种间杂交和单性生殖等相关技术提供相应的理论指导，本章将重点介绍鱼类性别决定和性别分化的有关知识及其研究进展。4.1 4.1 性分化诱导假说性分化诱导假说 在脊椎动物中，鱼类是性别决定方式最为多样的一个类群，与高等脊椎动物一样，鱼类性别决定的基础仍然是遗传基因，同时在发育早期，鱼类的性别更明显地表现为双向潜力，这种具有双向潜力的未分化性腺经过程序性发生一系列时间，发育成精巢或卵巢，并出现第二性征的过程即称为性别分化。由于鱼类进化上的原始性，某些外部环境因素能在不同程度上影响鱼类的性分化，甚至在性别分化完成后发生性别转化。Witschi根
7、据两栖类的研究资料，早在本世纪初就提出了性分化诱导假说，该假说认为：性腺皮质产生皮质素，髓质产生髓质素，性分化取决于这两种诱导物质的对比强度；若皮质素占优势则向雌性分化，反之就向雄性分化。关于诱导物质的本质，长期以来存在着两种对立的观点，一种观点认为诱导物质和成体性腺产生的类固醇为同一物质8，另一种观点认为性腺胚胎期的诱导物质可能是蛋白质或蛋白质与类固醇激素的结合体9。根据第一种观点，人们用雌雄激素分别处理鱼类，可诱导表型上出现雌性或雄性特征，说明在个体发育过程中，甾类激素可能是性分化过程的一个重要因素。4.2 性染色体 鱼类性染色体的类型，也如同其复杂的性别种类一样，具有多样性。可以说，在不
8、同动物种类中所能找到的性染色体类型，在鱼类中均能找到，如既有XX/XY型，又有ZW/ZZ型。除在类型上具有多样性以外，鱼类的性染色体还有一个特点，就是在亲缘关系较近的种类中，可能会具有完全不同的性染色体类型。如莫桑比克罗非鱼（T.mossambica）的染色体为XX/XY型，而奥利亚罗非鱼（T.auren）却为ZW/ZZ型。由于圆口类及软骨鱼的染色体资料较少，下面主要介绍硬骨鱼已知的性染色体类型。4.2.1 XX/XY型 高等哺乳类的性染色体属于此类，雄性具有不同型的性染色体XY，称为异型配子；而雌性具有一对相同的性染色体XX，称为同型配子。我国已考查过染色体的鱼类中，有10种具有异型的性染色
9、体，它们分布于4个目，并且染色体数目差异很大，其中鲤形目的鲫鱼，鲇形目的胡子鲇、革胡子鲇、蟾胡子鲇、斑胡子鲇、白绿缘鱼、黑尾拟缘鱼以及鲈形目的刺鱼为此类型。4.2.2 ZW/ZZ型 这种常见于鸟类的性染色体形式，和上述类型正好相反，雌性为异配子型ZW；而雄性为同配子型ZZ。常重杰等（1997）报道鲤形目鳅科大鳞副泥鳅为此类型。日本鳗鲡、美洲鳗鲡等多种鳗类也属于该类型。4.2.3 XO/XX型 除了形状的差异外，性染色体也可能以不同数目的方式存在。在某些昆虫中常见的XO/XX性染色体型即是。一般而言，在XO/XX型中，XX型为雌性，而XO型为雄性，即雄性缺少Y染色体。在鱼类，具有此种性染色体方式
10、的种类似乎不多。目前已知的有虾虎科和灯笼科中的几种鱼类。4.2.4 ZO/ZZ型 某些蛾类具有该类型的性染色体。一般而言，ZZ型为雄性，ZO型为雌性，即雌性缺少W染色体。洪云汉（1984）报道短领鲚为此类型。4.2.5 复性染色体型 此种类型的染色体多半被表现为X1X1X2X2/X1X2Y，花鳅（Cobitis taenia complex）和红鲑鱼（Onchorynchus nerka）即属此类。这类性染色体的成因是由于常染色体（或其一部分）被转移到Y染色体而形成Y常染色体融合所致。以花鳅为例，原来雄花鳅的染色体是X2X2X1Y，其中，X2X2是一对常染色体，而X1Y是一对性染色体。在进化过
11、程中，一个X2染色体转移到Y染色体而组成新的Y染色体，原来的一对X2染色体只剩一个，因此雄性花鳅的染色体只有49条，而雌花鳅的一对X2染色体则未发生此转移现象，所以仍为50条染色体。已研究过的鱼类性别染色体类型，大多属于XX/XY和ZW/ZZ型，约占已知者的70%。到目前为止,在所研究报道的鱼类中,具有异型配子的雄鱼至少是异型配子雌鱼的2倍。部分鱼类的性染色体类型见表1-1。最早使用外源激素诱发鱼类发生性转化的可能是Padao，但最早对鱼类性别决定机制系统阐述的是日本学者Yamamoto。他总结了性腺类型、雌雄同体现象、性别决定的遗传学基础以及性类固醇激素对性分化的影响，提出类固醇激素是自然的
12、“性诱导剂”，雌激素是“雌性诱导剂”，而雄激素是“雄性诱导剂”。此后，应用激素诱导鱼类性转化的研究在各国广泛开展，在15个科47种鱼类中，对雌雄同体和雌雄异体鱼类（9科34种）采用外源激素诱导鱼类发生性转化已经得到了验证12。所使用的31种激素中，11种雄激素、12种雌激素为人工合成，只有5种雄激素、3种雌激素为自然激素，其中以17a-甲基睾酮（17-MT）和17-雌二醇（17-E2）诱导效果最好。五五.环境因子对性别分化的影响环境因子对性别分化的影响 采用的方法有浸泡、投喂药饵、注射等。投喂药饵法是最常用的处理方法，即在饵料中拌和一定量的激素以投喂鱼类；浸泡法尤其适用于冷水性鱼类，在含有激素
13、的水体中阶段性或持续性浸泡胚胎及开口摄食前的鱼，有时可达100%的性转化。但由于上述方法费工费时，且效果不稳定，所以近年国内外还采用注射或埋植缓释药物胶囊的方法，可有效诱导鱼类提早完成性转化，且操作简便，效果稳定可靠。在利用药物诱导鱼类性转化的研究中，都发现性转化过程中伴随着雌性激素和雄性激素明显的升高或降低。激素控制是人为控制鱼类性别的常见方法，用激素处理基因型为雌性或雄性的各种鱼类幼体，可得到性逆转的雄性或雌性个体。用于控制鱼类性别的激素有雌激素（estrogen）和雄激素(androgen)两大类。目前，已经使用过的雄激素有：丙酸脱氢睾丸酮（dehydrotestosterone）、17
14、乙炔基睾丸酮(17-ethynyltestosterone)、17甲基睾丸酮(17-methyltestosterone)、丙酸睾丸酮(testosterone acetate)、乙炔基睾丸酮(ethynyltestosterone)等。雌激素有：乙烯雌酚（stilbestriol）、乙炔基雌二醇(ethynylestradiol)、二乙烯雌酚(diethylstylbestradiol)等。5.1 类固醇激素 Francesc Piferrer总结了用于诱导鱼类雌性化的激素种类，共有12种，其中三种为天然激素，分别为：雌酮（Oestrone,E1），17雌二醇（Oestradiol-17,E
15、2），雌三醇（Oestriol,E3）;9种为人工合成的化合物,如：二乙烯基雌酚（Diethylstilbestrol,DES），17乙炔雌二醇(17-ethynyloestradiol,EE2)等。这些激素虽然都曾用于诱导鱼类雄性化或者雌性化，但它们的作用效果并不一样，有人比较了几种雌激素的平均相对强度，发现EE2的作用效果最强，是DES的1.5倍，E2的3倍，E1的12倍，E3的75倍。组织学研究显示，在硬骨鱼类中性分化时期可以分成两大类群。第一类性分化时期为孵化开始到孵化后的10-40天，第二类性分化时期为幼鱼晚期阶段至此后150-500天，在性分化时期，用一定量激素处理可得到100%性
16、转化。许多学者在此方面做了大量的研究工作。但激素方法处理鱼类有时表现为效果不稳定，出现性别回复，或性转化个体不育现象。支持第二种观点的研究不多，但近年采用芳香化酶及其抑制剂对鱼类、鸟类、爬行类和两栖类等脊椎动物的性分化和性腺发育的研究揭示，诱导它们性分化的更直接的物质可能不是性激素而是支配这些激素合成的酶，很多实验已证实芳香化酶确实参与非哺乳动物性腺分化的调控。AI对对性性腺腺发发育育 的的影影响响AI对对P450aromA mRNA表达的影响表达的影响 5.2 5.2 鱼类芳香化酶活性研究进展鱼类芳香化酶活性研究进展 自80年代初Galland等发现鱼类脑垂体中有芳香化酶活性以来，国外对鱼类
17、产生芳香化酶的组织、芳香化酶活性与鱼类性腺发育关系做了一些研究，国内仅在禽类做了一些尝试，在鱼类方面的研究尚未见报道。鱼类的生殖活动受外部环境因素和神经内分泌的双重调控，下丘脑垂体性腺轴通过相互作用，促进和制约着鱼类生殖细胞的发生、性别分化和性腺发育成熟及繁殖活动。下丘脑产生促性腺激素释放素（GnRH）和促性腺激素抑制因子（GRIF），影响脑垂体分泌促性腺激素（GTH），促性腺激素（GTH）进一步影响性腺产生类固醇激素，从而影响生殖细胞发育成熟和排精排卵。同时，类固醇激素对下丘脑和脑垂体也会产生反馈作用，调节类固醇激素的分泌。芳香化酶是催化雄激素向雌激素转化的关键酶和限速酶。由两个酶组成的复合
18、物，一个是细胞色素P450arom芳香化酶,另一个是NADPH P450arom细胞色素还原酶。在类固醇激素的代谢中，已经证明芳香化酶可催化某些雄激素转化为雌激素，它能将雄激素的A环芳香化，脱去19位的碳原子并将1位的羰基转化为羟基，这样就将催化雄烯二酮和睾酮等雄激素转化为雌酮和雌二醇，芳香化酶参与此过程的最后一步，也是此过程的关键酶和限速酶。因此采用芳香化酶抑制剂可直接影响激素的代谢。芳香化酶广泛存在于大多数脊椎动物的脑和垂体中，且鱼类脑和垂体中的水平比其他脊椎动物高出100-1000倍，而性腺中芳香化酶活性直接与体内雌激素的生成量有关，也与个体发育和性别有密切的关系，并随季节变化而波动。金
19、鱼和三文鱼脑中芳香化酶活性生殖季节高于非生殖季节，而大西洋鲑鱼在生殖季节过后，端脑和间脑中芳香化酶活性降低。对日本鳗鲡的研究表明，芳香化酶活性与血液中17-雌二醇、17a20-双羟孕酮的含量有关，并通过性激素影响性细胞发育过程。已有的研究资料表明，芳香化酶可催化雄激素转化为雌激素，促使肝脏合成卵黄蛋白原，保证了卵母细胞的卵黄生成和积累，使得卵子的发育正常进行。利用芳香化酶抑制剂对雌雄异体及雌雄同体鱼类的研究则表明芳香化酶参与鱼类的性别分化和性别转化。5.3 温度 银汉鱼科大西洋银边鱼（Menidia menidia）南方族群的性别分化受到温度的控制。在性别分化期间，低温（1119）产生较高比率
20、雌性个体，而高温（1725）产生较高比率的雄性个体；且受温度的控制的时间有一定的期限，在孵化46d后，温度对性别决定的影响就很小了。相反，大西洋银边鱼北方族群对温度不太敏感，雌雄性比大致维持1:1，不因温度改变而变化。同时，人们还发现，雌、雄亲鱼的不同均会导致后代性别对温度敏感性的差异。由不同组合家庭中其后代雌雄比例的分布来看，大西洋银边鱼的性别除受温度控制外，遗传因子仍具有很重要的作用，而且遗传因子的控制方式似乎是通过少数几个主要的性别决定基因来控制的。由于在大西洋银边鱼并没有发现典型的性染色体，所以至今还不清楚这些基因究竟是位于性染色体上还是在常染色体上。由此认为，大西洋银边鱼的性别决定不
21、是完全的环境决定型，也不是完全的基因决定型，而是二者的组合。在慈鲷科尼罗罗非鱼中，利用不同温度来处理其刚孵出的仔鱼时，发现在36时所产生的雄性个体比例较高，而且还发现其性别分化受温度影响的时期为孵化后13d之前。另外，温度处理所需要的时间至少为10d。为进一步确认温度对尼罗罗非鱼性别决定的影响，将经雄激素诱导性逆转所产生的XX型雄鱼与雌鱼交配，以获得全雌鱼苗，通过高温处理后，发现所得雄鱼的平均比例为55，远高于对照组的平均比例（11），从而再次证明温度确实能控制尼罗罗非鱼性别，且在该类鱼中并未发现形态相异的性染色体。5.4 pH值 与温度相比，对其他环境因子影响性别的研究较少。其中，对pH值的
22、研究相对要多一些。慈鲷科的Pelvicachromis pulcher、P.taeniatus、Apistogramma borelli/A.caucatoides以及胎鱂科的Xiphophorus helleri的性别决定均受到pH值的影响。通常，pH值越低，产生雄鱼的比例越高；当pH趋于中性时，产生雌鱼的比例开始升高（表1-2）。pH值对鱼类性别决定的影响还有待于进一步研究和探索。一般认为，环境因素主要影响未分化或分化期性腺中生殖细胞的分化。因此，在性别分化完成后，环境因素很难再诱导性逆转。但也有证据表明，在青鱂雄性个体中，用雌激素仍能诱导产生卵母细胞；而且通过植入类固醇也能使雌性金鱼成熟
23、卵巢诱导产生精巢组织。上述事实表明，这些鱼类成熟性腺中的生殖细胞仍然保持有双向的发育潜能，即使在性别分化后，性幼稚阶段的生殖细胞仍然具有分化为卵母细胞或精原细胞的潜能。目前，对环境因子影响性别分化的研究还不待于进一步深入。不过，从水产养殖的实用性来看，在某些需要养殖单性鱼的场合下（如全雄罗非鱼的养殖），运用温度和pH值等简单的环境因子来控制鱼类的性别，要比使用激素或利用复杂的生物技术简便得多。因此，运用环境因子来控制鱼类的性别，在水产养殖业中具有重要的应用价值，而且是行之有效的。六展望海水鱼受DA的抑制作用很小或没有，则必有另一种抑制因子，是什么？需证明和寻找。对海水鱼类生殖内分泌调控机理尚未
24、完全清楚。海水鱼类排卵期很长，注射缓释微球，可持续产卵，效果理想。从细胞、分子水平研究主要经济鱼类生殖内分泌调控机理，建立高新技术。1调节轴分泌激素的结构功能及作用机理分离与纯化GnRH类型，GTH-I，GTH-II等；阐明结构与功能的关系；建立微量测定技术，如RIA，ELISA技术；受体的分离与纯化、分布、数量变动；阐明卵母细胞和精子细胞最后成熟阶段激素的调节作用2GTH合成与分泌的调节机理3调控性分化、性腺发育成熟及性转化的激素与神经因子的作用机理酶的作用；性发育的启动机制；性激素的合成过程，性分化，新技术等4环境条件和营养对性发育成熟和配子质量的影响适宜环境；饵料中主要成分的作用；污染物的不良影响；专有饲料的研制（如亲鱼培育饲料直接影响卵子质量）；提出海水鱼类亲鱼培育和苗种培育的优化措施等5基因重组GTH和其他神经内分泌因子的研制已克隆鲷、鲽等编码GTH-I和GTH-II b-亚基的cDNA并研究其表达，用细菌和杆状病毒表达产量低且需纯化，用真核生物中表达效果较好。分离纯化激素、神经肽、神经内分泌因子及其受体的基因，建立高效表达系统，提高分离纯化的效率，得到一系列有生物活性的海水鱼类基因重组产品，即可直接应用于人工繁殖生产，又可建立其特异的微量测定技术。
