1、2023-2-11DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药分子标记用于中药鉴定鉴定DNA分子标记用于中药鉴定分子生药学molecular pharmacognosy 在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学，所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方学，所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法，是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。法，是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。DNA分子标记用于中药鉴定分子生药学研究内容分子生药学研究内容研究内容鉴定方面生产方面获取有效成分方面DNA分子标记鉴别药材培育选种转基因器官培养技术DN
2、A分子标记用于中药鉴定DNA分子遗传标记分子遗传标记 以形态学为主的生药鉴定方法以形态学为主的生药鉴定方法(性状鉴别、显微鉴别性状鉴别、显微鉴别)和理化鉴别，还不能解决所有生药的真实性鉴定问题，和理化鉴别，还不能解决所有生药的真实性鉴定问题，特别是对同属多来源生药及种内的一些变异特别是对同属多来源生药及种内的一些变异(道地药道地药材材)、动物药等难以专属性地鉴定。、动物药等难以专属性地鉴定。学科发展的需要以及分子生物学技术的飞速发展使学科发展的需要以及分子生物学技术的飞速发展使 DNA 分子遗传标记（分子遗传标记（DNA molecular genetic marker）鉴别生药应运而生）鉴别
3、生药应运而生。DNA分子标记用于中药鉴定道地药材 道地药材的形成是基因型与环境之间相互作用的产物，道地药材的形成是基因型与环境之间相互作用的产物，可用公式表示：可用公式表示：表现型表现型phenotype=基因型基因型genotype+环境饰变环境饰变（environmental modification）DNA分子标记用于中药鉴定 生药生药 DNA 分子遗传标记鉴定是指通过比较生药间分子遗传标记鉴定是指通过比较生药间 DNA 分子遗传多样性差异来鉴别生药基源，确定其分子遗传多样性差异来鉴别生药基源，确定其学名的方法。学名的方法。DNA分子标记用于中药鉴定DNA 分子是由分子是由 G、A、C、
4、T 四种碱基四种碱基构成，生物体特定的遗构成，生物体特定的遗传信息便包含在特定的传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，这就碱基排列顺序中，这就是生物的遗传多样是生物的遗传多样(genetic diversity)。DNA分子标记用于中药鉴定在在 DNA 分子上，有编码分子上，有编码与物种存活密切相关的基与物种存活密切相关的基因区域、编码与物种存活因区域、编码与物种存活不十分密切相关的基因区不十分密切相关的基因区域和非编码基因区域。域和非编码基因区域。基因组基因组 DNA 的这些不同的这些不同区域在生物进化过程中所区域在生物进化过程中所受到的选择压力不同，前受到的选择压力不同，前者所受选择压力大，
5、表现者所受选择压力大，表现出高度保守，后者所受选出高度保守，后者所受选择压力小，表现出较大的择压力小，表现出较大的变异。变异。DNA分子标记用于中药鉴定 正是由于这种正是由于这种 DNA 分子不同区域承受的选择压力不分子不同区域承受的选择压力不同，使得同，使得 DNA 分子的不同区域有不同程度的遗传多分子的不同区域有不同程度的遗传多样性。因此，我们能够选择适当的样性。因此，我们能够选择适当的 DNA 分子遗传标分子遗传标记，在属、种、亚种、居群或个体水平上对研究对象记，在属、种、亚种、居群或个体水平上对研究对象进行准确地鉴别。进行准确地鉴别。下面对生药下面对生药 DNA 分子遗传标记鉴定的相关
6、技术和方分子遗传标记鉴定的相关技术和方法作一简单介绍。法作一简单介绍。DNA分子标记用于中药鉴定一、一、DNA提取技术提取技术 DNA 的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。步骤。总总 DNA 的有效提取要求材料中的的有效提取要求材料中的 DNA 尽可能少的尽可能少的降解。降解。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定 从植物药材中提取从植物药材中提取 DNA 一般可分为两个阶段一般可分为两个阶段:第一阶段是植物细胞破裂后释放出第一阶段是植物细胞破裂后释放出 DNA。第二阶段是第二阶段是 DNA 与其它细胞组分如蛋白质、碳水化与其它细
7、胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离，在这个阶段，重要的是要合物、膜和细胞壁相分离，在这个阶段，重要的是要保证大量的保证大量的 DNA 不能混杂在细胞碎片中，不能混杂在细胞碎片中，DNA 要要与蛋白质和其它污染物完全分离，因为这些污染物的与蛋白质和其它污染物完全分离，因为这些污染物的存在会干扰下一步的分析。存在会干扰下一步的分析。DNA分子标记用于中药鉴定 对于幼嫩器官的材料（鲜品或硅胶快速干燥样品），对于幼嫩器官的材料（鲜品或硅胶快速干燥样品），一般方法都可以得到质量符合要求的一般方法都可以得到质量符合要求的 DNA。但对于中药材，情况则要复杂得多，需要针对具体材但对于中药材，情况则
8、要复杂得多，需要针对具体材料，设计去除含酚羟基的化合物和多糖类化合物的方料，设计去除含酚羟基的化合物和多糖类化合物的方法。法。DNA分子标记用于中药鉴定 DNA 的质量将直接关系到实验的成败。的质量将直接关系到实验的成败。一般而言，所得的一般而言，所得的 DNA 应完整、有足够的量，电泳应完整、有足够的量，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型，此外，检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型，此外，还应满足下游操作的要求，如用于还应满足下游操作的要求，如用于 PCR 分析的分析的 DNA 不应含干扰不应含干扰 PCR 反应的污染物。反应的污染物。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用
9、于中药鉴定二、琼脂糖凝胶电泳技术二、琼脂糖凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA 片段的常片段的常用方法，具有简便、快速的优点。用方法，具有简便、快速的优点。DNA 琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同。本相同。DNA 分子是两性电解质，分子是两性电解质，在高于其等电点在高于其等电点的溶液（的溶液（pH8.0pH8.3）中中，碱基几乎不解离，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中分子带负电荷，在电场中向正极移动向正极移动 DNA分子标记用于中药鉴定 DN
10、A 分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，凝胶介质还有分子筛效应，使分子大小和构象不同使分子大小和构象不同的的 DNA 分子迁移率出现较大差异，从而达到分离目分子迁移率出现较大差异，从而达到分离目的。的。在凝胶中加入少量溴化乙锭，其分子可插入在凝胶中加入少量溴化乙锭，其分子可插入 DNA 的的碱基之间，因此可在紫外光灯下直接观察到碱基之间，因此可在紫外光灯下直接观察到 DNA 片片段在凝胶上的位置，并可在紫外光灯下或经凝胶成像段在凝胶上的位置，并可在紫外光灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。系统观察或拍照。DNA分子标记用于中药
11、鉴定DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定三、三、PCR技术技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，是一种模拟自然是一种模拟自然 DNA 复制过程的体外酶促合成特异复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术性核酸片段技术。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定 PCR 技术能在一个离心管内将所要研究的目的基因或技术能在一个离心管内将所要研究的目的基因或某一某一 DNA 片段于数小
12、时内扩增至十万乃至百万倍，片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，在在EB染色及电泳后，肉眼能直接观察和判断；可从一染色及电泳后，肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研究和检测鉴定。供分析研究和检测鉴定。DNA分子标记用于中药鉴定DNA复制特点复制特点DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定1.PCR 技术的基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶与靶序列两端互补的寡核苷酸引物序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性变性-
13、退火退火-延伸延伸三个基本反应步骤构成：模板模板 DNA 的变性的变性 模板 DNA 经加热至 93 左右一定时间后，模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮循环作准备；模板模板 DNA 与引物的退火与引物的退火(复性复性)模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；DNA分子标记用于中药鉴定 引物的延伸引物的延伸 DNA 模板-引物结合物在 Taq DNA 聚合聚合酶酶的作用下，以以 dNTP 为反应原料，靶序列靶序列为模板，按碱基配碱基配对与半保留复制原理对与半保留复制原理，
14、合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2 4 分钟，2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。DNA分子标记用于中药鉴定2.参加 PCR 反应的物质 主要有五种即引物、酶、主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和、模板和 Mg 2+。（1）引物）引物 是是 PCR 特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR 产物产物的特异性取决于引物与模板的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论互补的程度
15、。理论上，只要知道任何一段模板上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板就可将模板 DNA 在体外大量扩增。在体外大量扩增。DNA分子标记用于中药鉴定（2）酶及其浓度）酶及其浓度 目前有两种目前有两种 Taq DNA 聚合酶供聚合酶供应，应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为指总反应体积为 100l 时时)，
16、浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。量减少。DNA分子标记用于中药鉴定（3）dNTP 的质量与浓度的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度的质量与浓度和和 PCR 扩增效率有密切关系，扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或或 1M Tris-HCl 的缓冲液将其的缓冲液将其 pH 调节到调节到 7.0 7.5，小量分装，小量分装，-20 冰冻保存。多次冻融
17、会使冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。降解。DNA分子标记用于中药鉴定 在在 PCR 反应中，反应中，dNTP 的浓度应为的浓度应为 50 200mol/L，尤其应注意，尤其应注意 4 种种 dNTP 的浓度要相等的浓度要相等(等摩尔配制等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几，如其中任何一种浓度不同于其它几种时种时(偏高或偏低偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低还，就会引起错配。浓度过低还会降低会降低 PCR 产物的产量。产物的产量。dNTP 能与能与 Mg 2+结合，结合，使游离的使游离的 Mg 2+浓度降低。浓度降低。DNA分子标记用于中药鉴定（4）模板）模板(靶基因靶基因)质
18、量质量 是是 PCR 成败与否的关成败与否的关键环节之一，传统的键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶和蛋白酶 K 来消化处理标本。来消化处理标本。再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于用于 PCR 反应。反应。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或酚模板提取一般采用异硫氰酸胍或酚/SDS 法等，法等，要防止要防止 RNase 降解降解 RNA。DNA分子标记用于中药鉴定（5）Mg 2+浓度：浓度：Mg
19、2+对对 PCR 扩增的特异性扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种反应中，各种 dNTP 浓度为浓度为 200mol/L 时，时，Mg 2+浓度为浓度为 1.5 2.0mmol/L 为宜。为宜。Mg 2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产聚合酶的活性，使反应产物减少。物减少。DNA分子标记用于中药鉴定四、生药鉴定常用的四、生药鉴定常用的DNA分子标记方法分子标记方法 DNA分子标记技术分子标记技术 以传统的以传统的south
20、ern杂交杂交为基础的分子标记技术为基础的分子标记技术 RFLP限制性内切酶片段长度多态性限制性内切酶片段长度多态性 以以PCR为基础的分子标记技术为基础的分子标记技术 RAPD 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA SCAR 测序的扩增区段测序的扩增区段 STS 测序的标记位点测序的标记位点 DAF DNA扩增产物指纹分析扩增产物指纹分析DNA分子标记用于中药鉴定 以以PCR和和RFLP相结合相结合的分子标记技术：的分子标记技术：AFLP 扩增扩增的限制性内切酶片段长度多态性的限制性内切酶片段长度多态性 以以重复序列重复序列为基础的分子标记技术为基础的分子标记技术 Satellite:卫星卫星
21、DNA(重复单位为几百几千碱基对重复单位为几百几千碱基对)Microsatellite:微卫星微卫星DNA(重复单位为重复单位为25碱基碱基对对)SSR：短重复序列：短重复序列DNA分子标记用于中药鉴定（一）限制性片段长度多态（restriction fragment length polymorphism，简称 RFLP）生物在进化过程中，由于种种原因引起的基因突变和生物在进化过程中，由于种种原因引起的基因突变和 DNA 分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，在一处或几处发生某种差异，当这种改变的改变，在一处或几处发生某种差异，当这种改变（即
22、使是很小的改变）涉及到限制性酶切位点时，酶（即使是很小的改变）涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的切后产生的 DNA 片段长度将发生变化，即限制性酶片段长度将发生变化，即限制性酶谱的条带方式将出现不同，产生多态性，称为限制性谱的条带方式将出现不同，产生多态性，称为限制性片段长度多态。片段长度多态。DNA分子标记用于中药鉴定 一般应用一般应用 Southern 杂交检测这种多态性，将琼脂糖杂交检测这种多态性，将琼脂糖凝胶中的凝胶中的 DNA 转移到硝酸纤维素膜（或其它膜）上，转移到硝酸纤维素膜（或其它膜）上，然后再用标记的克隆基因作探针进行杂交，经放射自然后再用标记的克隆基因作探针进行杂交，经放
23、射自显影后即可在显影后即可在 X 光片上看到光片上看到 DNA 多态性了。多态性了。该方法试验步骤繁琐（该方法试验步骤繁琐（包括 Southern 转移、探针标记、杂交、检测等），又受到探针来源的限制，所需），又受到探针来源的限制，所需 DNA 样样品量大（品量大（因没有对 DNA 进行扩增），仅适于），仅适于 DNA 未明未明显降解的新鲜材料。显降解的新鲜材料。DNA分子标记用于中药鉴定（二）随机扩增多态性 DNA(RAPD)（random amplified polymorphic DNA）和任意引物 PCR(AP-PCR)（arbitrary primer PCR）RAPD（random
24、 amplified polymorphic DNA）是是 1990 年美国杜邦公司科学家年美国杜邦公司科学家 J.G.K.Williams 和加利福尼亚生物研究所和加利福尼亚生物研究所 J.Welsh 领导的两个小组领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。几乎同时发展起来的一项新技术。Williams 称之为称之为 RAPD，Welsh 称之为称之为 AP-PCR。DNA分子标记用于中药鉴定 RAPD 技术建立在技术建立在 PCR 技术基础上，它是以任意序技术基础上，它是以任意序列的寡核苷酸单链列的寡核苷酸单链(通常为通常为 10 个碱基，个碱基，AP-PCR 则为则为 20 30 个碱
25、基个碱基)为引物，对所研究的基因组为引物，对所研究的基因组 DNA 进行随机扩增。进行随机扩增。RAPD 所用的一系列引物的所用的一系列引物的 DNA 序列各不相同，但序列各不相同，但对于任一引物，它同基因组对于任一引物，它同基因组 DNA 序列有特定的结合序列有特定的结合位点。位点。DNA分子标记用于中药鉴定 这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合合 PCR 扩增的反应条件，即在一定范围内模板扩增的反应条件，即在一定范围内模板 DNA 上有与引物互补的反相重复序列时，就可扩增出此范上有与引物互补的反相重复序列时，就可扩增出此范围的围的
26、DNA 片段。片段。在不同物种基因组在不同物种基因组 DNA 中，这种反相重复序列的数中，这种反相重复序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定的结合位点目和间隔的长短不同，就可导致这些特定的结合位点分布发生相应的变化，而使分布发生相应的变化，而使 PCR 扩增产物增加、减少扩增产物增加、减少或发生分子量的变化。或发生分子量的变化。通过对通过对 PCR 产物的检测和比产物的检测和比较，即可识别这些物种基因组较，即可识别这些物种基因组 DNA 的多态片段。的多态片段。DNA分子标记用于中药鉴定 与常规与常规 PCR 相比，相比，RAPD 主要有以下特点：主要有以下特点：无需专门设计无需专门设计
27、 RAPD 扩增反应的引物，也无需预扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为或是任意选定的。引物长度一般为 9 10 个寡核个寡核苷酸。苷酸。每个每个 RAPD 反应中，仅加单个引物，通过引物和反应中，仅加单个引物，通过引物和模板模板 DNA 链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。DNA分子标记用于中药鉴定 退火温度较低，一般为退火温度较低，一般为 36，这能保证短核苷，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误酸引物与模板的稳定配对，同
28、时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组配对，以扩大引物在基因组 DNA 中配对的随机性。中配对的随机性。较之常规较之常规 PCR，RAPD 反应易于程序化。利用反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量一套随机引物，得到大量 DNA 分子标记，可以借助分子标记，可以借助计算机进行系统分析。计算机进行系统分析。DNA分子标记用于中药鉴定 该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物、微生物物种及中药材的鉴定等各个进化以及动植物、微生物物种及中药材的鉴定等各个领域。在生药鉴定方面，该方法在人参及其伪品、甘领域。在生药鉴定方面，该方
29、法在人参及其伪品、甘草、黄连、冬虫夏草及其伪品、贝母等药材的鉴定中草、黄连、冬虫夏草及其伪品、贝母等药材的鉴定中有应用。有应用。DNA分子标记用于中药鉴定（三）扩增片段长度多态性标记（amplified fragment length polymorphic DNA marker，AFLP）AFLP 标记是标记是 RFLP 与与 RAPD 相结合的产物，是相结合的产物，是 1992 年由荷兰年由荷兰 Keygene 公司科学家公司科学家 Vos Pieter 等等发明并发展起来的一种选择性扩增限制性酶切片段的发明并发展起来的一种选择性扩增限制性酶切片段的方法。方法。AFLP 检测的多态性是酶切
30、位点的变化或酶切检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段间片段间 DNA 序列的插入与缺失，本质上与序列的插入与缺失，本质上与 RFLP 一一致。致。DNA分子标记用于中药鉴定 AFLP 的优越性：的优越性：AFLP 可在不知基因组可在不知基因组 DNA 序序列情况下构建其指纹图谱。列情况下构建其指纹图谱。AFLP 所需所需 DNA 用用量少。量少。AFLP 反应灵敏、快速高效。反应灵敏、快速高效。AFLP 指指纹图谱多态性丰富，可用来检测种和种以下水平的差纹图谱多态性丰富，可用来检测种和种以下水平的差异。异。AFLP 标记呈典型的孟德尔遗传，能检测到标记呈典型的孟德尔遗传，能检测到整个基因组的
31、遗传变异。整个基因组的遗传变异。AFLP 对反映条件的变化对反映条件的变化如模板浓度变化等不灵敏，重复性好。如模板浓度变化等不灵敏，重复性好。AFLP 采用采用的是与接头序列和限制性内切酶位点同源的特异引物，的是与接头序列和限制性内切酶位点同源的特异引物，且采用了较高的退火温度，特异性较高。且采用了较高的退火温度，特异性较高。DNA分子标记用于中药鉴定 正是由于该技术具有以上优点，在遗传多样性、基因正是由于该技术具有以上优点，在遗传多样性、基因追踪及定位、分类与进化、系统发育、品种鉴定等基追踪及定位、分类与进化、系统发育、品种鉴定等基因组研究的几乎所有领域都得到了广泛的应用。其不因组研究的几乎
32、所有领域都得到了广泛的应用。其不足之处是所需仪器和试剂价格昂贵，试验成本较高。足之处是所需仪器和试剂价格昂贵，试验成本较高。另外检测过程中如果使用放射性同位素，会对环境和另外检测过程中如果使用放射性同位素，会对环境和人身安全构成一定的危害人身安全构成一定的危害。DNA分子标记用于中药鉴定（四）DNA 测序法和基于 DNA 序列测定的 PCR-RFLP、特异引物 PCR 方法 基于基于 PCR 技术的技术的 DNA 直接测序技术是以直接测序技术是以 PCR 扩增扩增引物作为测序引物，采用循环测序法对引物作为测序引物，采用循环测序法对 PCR 扩增的双扩增的双链链 DNA 进行直接测序。进行直接测
33、序。PCR 扩增所需要的基本条件是引物所覆盖区域的扩增所需要的基本条件是引物所覆盖区域的 DNA 序列必须是已知的，以便根据其序列来设计引序列必须是已知的，以便根据其序列来设计引物，也就是说需要预先知道靶基因的序列信息。物，也就是说需要预先知道靶基因的序列信息。DNA分子标记用于中药鉴定 由于生药的遗传信息缺乏，应用由于生药的遗传信息缺乏，应用 DNA 测序法鉴定中测序法鉴定中药，一般是选择合适的目的基因，根据其保守区的序药，一般是选择合适的目的基因，根据其保守区的序列设计通用引物，使其在靶基因保守区识别并扩增，列设计通用引物，使其在靶基因保守区识别并扩增，这样可以对不同分类等级生物类群的这样
34、可以对不同分类等级生物类群的 DNA 进行扩增进行扩增，而不需要预先知道靶基因的序列信息，使应用，而不需要预先知道靶基因的序列信息，使应用 DNA 测序法鉴别生药成为可能。测序法鉴别生药成为可能。DNA分子标记用于中药鉴定 生药的生药的 DNA 测序鉴定就是运用测序鉴定就是运用 DNA 测序技术建立测序技术建立正品药材及相关混伪品的原动植物的基因序列数据库，正品药材及相关混伪品的原动植物的基因序列数据库，用同样的方法对待检测样品进行测序，对照数据库即用同样的方法对待检测样品进行测序，对照数据库即可鉴定出中药材的真伪。该方法重现性好，鉴定结果可鉴定出中药材的真伪。该方法重现性好，鉴定结果准确可靠
35、。但是，实际应用中，采用全序列比对的方准确可靠。但是，实际应用中，采用全序列比对的方法比较麻烦，为此又在序列测定的基础上发展了更加法比较麻烦，为此又在序列测定的基础上发展了更加简便的简便的 PCR 扩增的特定片段的限制性位点分析扩增的特定片段的限制性位点分析（PCR-RFLP）和位点特异性鉴别）和位点特异性鉴别 PCR 方法方法（diagnostic PCR）。）。DNA分子标记用于中药鉴定 PCR-RFLP 是在是在 PCR 和和 DNA 序列分析基础上产生序列分析基础上产生的的 RFLP 技术。该方法是通过技术。该方法是通过 PCR 扩增一段扩增一段 DNA 片段，然后再选择适当的限制性内
36、切酶，消化片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳，可得到有种属特异性的电泳谱带，从产物，经电泳，可得到有种属特异性的电泳谱带，从而达到品种鉴定的目的。例如该方法在贝母类、人参而达到品种鉴定的目的。例如该方法在贝母类、人参类和术类药材鉴定中应用。类和术类药材鉴定中应用。DNA分子标记用于中药鉴定 自自 De Salle R,Birstein VJ 1996 年在年在 Nature 上上发表了利用人工设计的引物鉴别鱼子酱中鱼卵所属鲟发表了利用人工设计的引物鉴别鱼子酱中鱼卵所属鲟鱼的种类后，鉴别性鱼的种类后，鉴别性 PCR 不断得到推广和应用。位不断得到推广和应用。位点特异性
37、鉴别点特异性鉴别 PCR（diagnostic PCR）方法是根）方法是根据正品及其混伪品特定区域的据正品及其混伪品特定区域的 DNA 序列数据，设计序列数据，设计有高度特异性的正品药材的鉴别引物。有高度特异性的正品药材的鉴别引物。DNA分子标记用于中药鉴定 与通用引物不同的是，这对引物在与通用引物不同的是，这对引物在 PCR 扩增时只能对扩增时只能对来自正品的药材的来自正品的药材的 DNA 模板中的特定的区域进行有模板中的特定的区域进行有效扩增，而对来自混伪品或其它样品中该区域不能进效扩增，而对来自混伪品或其它样品中该区域不能进行扩增。高特异性行扩增。高特异性 PCR 鉴别反应条件与普通鉴别
38、反应条件与普通 PCR 基基本一样，但在本一样，但在 PCR 循环中复性温度较高，一般在循环中复性温度较高，一般在 60 左右。在这样的左右。在这样的 PCR 条件下，如果引物设计合条件下，如果引物设计合理，假阳性出现的概率非常之微。理，假阳性出现的概率非常之微。DNA分子标记用于中药鉴定 当有样品鉴定时，从待鉴定的样品中提取少量当有样品鉴定时，从待鉴定的样品中提取少量 DNA，以此为模板，用高特异性的鉴别引物在适当的条件下以此为模板，用高特异性的鉴别引物在适当的条件下进行进行 PCR 扩增，扩增，PCR 产物用产物用 0.8%1.2%的琼脂的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如为阳性，则为正品，否
39、糖凝胶电泳检测扩增结果，如为阳性，则为正品，否则为非正品药材，以此达到鉴别目的。高特异性鉴别则为非正品药材，以此达到鉴别目的。高特异性鉴别引物设计所依据的引物设计所依据的 DNA 序列资料，可以通过对相关序列资料，可以通过对相关物种的物种的 DNA 进行测序研究获得，也可以从进行测序研究获得，也可以从 GenBank 或或 EMBL 等等 DNA 数据库中直接查得。例如该方法已数据库中直接查得。例如该方法已在贝母类、石斛类、蛇类和龟甲类药材鉴定中应用。在贝母类、石斛类、蛇类和龟甲类药材鉴定中应用。DNA分子标记用于中药鉴定五、基因芯片技术五、基因芯片技术 基因芯片（基因芯片（DNA chip）
40、，又称），又称 DNA 微阵列微阵列(DNA microarray)。基因芯片技术是基于碱基互补。基因芯片技术是基于碱基互补原理，在固体表面按一定的阵列集成大量的基因探针，原理，在固体表面按一定的阵列集成大量的基因探针，通过与待测基因进行杂交反应，进而对大量基因进行通过与待测基因进行杂交反应，进而对大量基因进行平行瞬时分析检测的技术。平行瞬时分析检测的技术。DNA分子标记用于中药鉴定 DNA 芯片技术能够对微量样本中的核酸序列信息进芯片技术能够对微量样本中的核酸序列信息进行快速、高通量和低成本检测和分析，特别是其大通行快速、高通量和低成本检测和分析，特别是其大通量并行化采集生物信息的特点，是目前其它分析技术量并行化采集生物信息的特点，是目前其它分析技术无法相比的。无法相比的。2023-2-11DNA分子标记用于中药鉴定
