1、第一节 微生物原生质体育种原生质体：1953年首次用巨大芽孢杆菌制备成功1955年发现再生方法 微生物原生质体的特点：对渗透压特别敏感对诱变剂的诱变效应更敏感失去对噬菌体的敏感性不受感受态的影响第一节 微生物原生质体育种一、原生质体再生育种二、诱变育种三、转化育种四、融合育种五、其他微生物原生质体育种一、原生质体再生育种：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异株，最终得到优良性状提高的正变菌株原生质体再生育种正变率高于常规育种？制备和再生过程中相关因素 微生物组成和结构改变 一般选用对数期细胞制备原生质体 不需要加遗传标记第一节 微生物原生质体育种一、原生质体再生育种出发菌株选
2、择菌种活化和预培养原生质体制备原生质体再生高产菌株分离二、原生质体诱变育种微生物制备原生质体后诱变处理，分离到再生培养基中再生，从再生菌落中分离筛选高产正变菌株二、原生质体诱变育种操作：物理诱变剂 化学诱变剂特点：操作繁琐、技术要求高 再生时间长、容易染菌 P223 扩展青霉PF-868原生质体诱变 第一节 微生物原生质体育种三、原生质体转化育种何种形式DNA转化率高？质粒第一节 微生物原生质体育种五、其他微生物原生质体育种脂质体转移原生质体转染等第二节 微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合
3、，并产生重组子的过程。生质体发生融合，并产生重组子的过程。聚乙二醇诱导 电场 诱导 微生物原生质体融合育种的优点？1、大幅度提高亲本间重组频率2、扩大重组的亲本范围3、集中双亲本优良性状机会更大 第二节 微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合 育种程序（见图9.2）14 原生质体融合技术的一般步骤v融合亲本的选择与标记；融合亲本的选择与标记；v原生质体的制备；原生质体的制备；v原生质体的融合；原生质体的融合；v原生质体的再生；原生质体的再生；v融合子的选择与鉴定；融合子的选择与鉴定；v目标菌株的筛选。目标菌株的筛选。一、直接亲本及其遗传标记的选择 1.营养缺陷型、抗性标记、热致死 孢子颜色、
4、菌落形态等注意：多数营养缺陷型菌株会影响代谢产物的产量 2.常把一方灭活后再融合 3.可用不同荧光标记直接亲本 3.可用不同荧光标记直接亲本 提取拟南芥叶片的原生质体，并转化带有GFP标签的目的蛋白表达载体，瞬时表达观察目的蛋白在亚细胞中的定位情况红色为叶绿体自发荧光绿色为GFP的荧光。二、原生质体制备与再生制备过程：分离、收集、纯化、活性鉴定、保存去壁方法：1.机械法2.非酶分离法3.酶法酶法分离原生质体：参考图9.3第二节 微生物原生质体融合育种酶法分离原生质体的影响因素？（1）培养基组成放线菌 加入亚适量甘氨酸黑曲霉 第二节 微生物原生质体融合育种酶法分离原生质体的影响因素？（2）菌体培
5、养方式：1.平板玻璃纸法：丝状菌2.振荡沉没培养法 细菌和酵母菌酶法分离原生质体的影响因素？（3）菌体年龄丝状真菌 菌丝体尖端细胞放线菌 对数期到静止期细菌 对数期酵母菌 菌体同步化酶法分离原生质体的影响因素？（4）稳定剂 高渗溶液无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2有机物：蔗糖、甘露醇、山梨醇丝状真菌 无机盐细菌 蔗糖、氯化钠稳定剂常用浓度：0.31mol/L（）酶解前的预处理 加入某种物质，抑制或阻止细胞壁某种成分合成酵母菌、丝状真菌 巯基乙醇酵母菌 EDTA放线菌 甘氨酸细菌 亚适量青霉素酶法分离原生质体的影响因素？（）酶系和酶的浓度细菌、放线菌 溶菌酶真菌 蜗牛酶注意事项：
6、酶法分离原生质体的影响因素？（）酶的作用温度和值酶的最适温度、菌株生长最适温度（）菌体密度酶法分离原生质体的影响因素？（）酶解方式 使用培养皿分离效果好分离时保持良好的通气条件、适当振荡分离条件经试验可确定 如计算测定原生质体形成率第七节 微生物原生质体融合育种如何计算测定原生质体形成率？原生质体形成率=（A-B）/A100%细菌、酵母菌 血球计数板计数法 高渗再生培养基培养法霉菌、放线菌 高渗再生培养基培养法二、原生质体制备与再生原生质体的鉴定（）低渗爆破法 p233 （）荧光染色法 荧光增白剂 荧光显微镜二、原生质体制备与再生原生质体的收集和纯化（）过滤法适于丝状微生物（）密度梯度离心法
7、离心后，原生质体上浮（）界面法离心后，原生质体在界面（）漂浮法适于细胞较大的微生物二、原生质体制备与再生原生质体的活力测定（）荧光素双醋酸盐染色法（）酚藏花红染色法（）伊文思蓝染色法二、原生质体制备与再生原生质体的保存液氮冷藏加入保护剂，如：二甲亚砜、甘油等二、原生质体制备与再生原生质体的再生：在高渗再生培养基上，原生质体重新合成细胞壁，恢复成完整细胞。参见p234 图9.41.原生质体再生的影响因素（234）菌体生理状态稳定剂酶浓度和作用时间再生培养基组成残存菌体的分离 ；再生培养基上冷凝水原生质体密度、再生方法二、原生质体制备与再生再生率及其计算 p236目的：找出最佳的原生质体制备 和再
8、生条件再生频率（%）=（C-B）/（A-B）100%三、原生质体融合（一）原生质体融合过程 P236（二）原生质体融合的影响因素、融合剂、温度、亲株的亲和力和原生质体的活性、无机离子（二）原生质体融合的影响因素、融合剂化学融合剂：PEG 不同微生物适合不同相对分子质量的 PEG 真菌 4000-6000细菌 1500-6000物理融合剂：电场、激光（二）原生质体融合的影响因素、融合剂电场融合的优点：适于动植物、微生物细胞；融合频率高可在显微镜下观察（二）原生质体融合的影响因素、融合剂、温度 2030、亲株的亲和力和原生质体的活性、无机离子PEG介导融合 钙离子、镁离子电场融合 糖或糖醇四、融合
9、体再生复原：再生培养基 细胞壁重建 形成菌落P239 图9.8四、融合体再生（二）融合体的检出和分离利用营养缺陷型标记选择融合体利用抗药性用灭活原生质体利用荧光染色法双亲对碳源利用不同四、融合体再生（二）融合体的检出和分离1.利用营养缺陷型标记选择融合体 双亲原生质体的融合体形成菌落 亲本不能在基本培养基上生长生产育种不常用，可用于遗传研究（二）融合体的检出和分离2.利用抗药性选择融合体营养缺陷型和抗药性结合筛选P240（二）融合体的检出和分离3.用灭活原生质体检出融合体灭活方法：药物 紫外线 温度（二）融合体的检出和分离4.利用荧光染色法亲本分别带上不同颜色荧光融合后直接根据荧光颜色选出融合
10、体注意事项：四、融合体再生（二）融合体的检出和分离观察形态生化指标测定DNA含量：分光光度计五、融合重组体检出与遗传特性分析（一）重组体的检出和鉴别方法1、直接法 图9.92、间接选择法 图9.103、钝化选择法（灭活一方原生质体）五、融合重组体检出与遗传特性分析（二）融合率见表9.2五、融合重组体检出与遗传特性分析（三）DNA含量及孢子形态测定1、DNA含量测定2、单倍化3、酶活性及孢子体积测定4、分子生物学方法六、原生质体融合的应用1、提高产量或质量，合成新物质2、改良菌种遗传特性3、优化菌种发酵特性4、质粒转移5、原生质体与细胞核融合6、进行遗传分析第三节 细菌原生质体融合育种 细菌细胞
11、壁如何降解？P247 第三节 细菌原生质体融合育种 1.如何提高细菌原生质体制备率和再生率？（1）预处理：目的改变细胞壁的性质（2）溶菌酶：（3）细菌生理状态：对数期（4）培养基和培养条件：第三节 细菌原生质体融合育种 2.建立最佳融合体系PEG 相对分子质量：40006000 浓 度：40%50%融合时间：30min第三节 细菌原生质体融合育种（三）操作方法 p251斜面活化两代液体振荡培养第四节 放线菌原生质体融合育种（二）菌体培养及预处理水解酶：溶菌酶预处理：加甘氨酸第五节 酵母菌原生质体融合育种一、酵母细胞壁结构和遗传标记菌龄菌龄对原生质体形成影响大亲本灭火的方法：紫外线 热 药物第五节 酵母菌原生质体融合育种一、酵母原生质体制备 p259预处理：EDTA；巯基乙醇 蜗牛酶第六节 霉菌原生质体融合育种二、培养基及相关溶液 p262（1）查氏培养基的作用：菌丝生长（3）酶液的制备：第六节 霉菌原生质体融合育种三、霉菌原生质体融合的关键步骤 p262（一）原生质体制备1、水解酶的选择2、菌丝的制备：常用玻璃纸法
