1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序教学课件教学课件抗虫棉的培育的过程：抗虫棉的培育的过程：基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序n（1 1）目的基因的获取）目的基因的获取n（2 2）n（3 3）将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入受体细胞n（4 4）目的基因的检测与鉴定）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建基因表达载体的构建一、目的基因的获取一、目的基因的获取补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构编码区下游编码区下游 非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 启动子启动子终止子终止子补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构内含子内含子 外显
2、子外显子 编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 RNA聚合酶的始结合位聚合酶的始结合位点点RNA聚合酶的末结合位聚合酶的末结合位点点结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNA能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子：内含子：外显子：外显子：1.基因文库基因文库 基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（cDNAcDNA文库）文库）u基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体
3、菌，菌中含基因。基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段，导入到片段，导入到中储存，各个受体菌分别含有这种中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库的构建模式图基因组文库的构建模式图部分基因文库的构建模式图部分基因文库的构建模式图小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以解旋酶催化解旋酶催化1)解旋解旋模板模板2)合成互补子链合成互补子链 以母链为模板进行碱基配
4、对以母链为模板进行碱基配对(在在DNA聚聚合酶合酶的催化下的催化下,利用游离的脱氧核苷酸进行利用游离的脱氧核苷酸进行)母链（旧链）母链（旧链）子链（新链）子链（新链）子代子代DNA:同时进行同时进行(边解旋边复制边解旋边复制)组成组成3)形成新的形成新的DNA分子分子作用：把单个脱氧核苷酸连接成链作用：把单个脱氧核苷酸连接成链(形成磷酸二酯形成磷酸二酯键键)2.利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因1 1概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。2 2原理：原理：DNADNA复制复制原料：模板原料：模板DNADNA；
5、DNADNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNADNA聚合酶聚合酶多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段3 3前提：前提：已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程技术的操作过程a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）
6、：在TaqTaq酶的作用下，合成与酶的作用下，合成与模板互补的模板互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加步骤：每重复一次，目的基因增加_倍倍一一PCR技术的操作过程技术的操作过程PCR技术的操作过程技术的操作过程PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、四种脱氧核
7、苷酸、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复半保留复制、边解旋边复制制半保留复制、全解旋再半保留复制、全解旋再复制复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等聚合酶、解旋酶等n 过程：过程：变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲 变性：变性：90909595 退火：退火：55556060 延伸：延伸：707075753.人工合成法人工合成法利用利用DNADNA合成仪人工合成的前提：基因较小，
8、核苷酸序列已知合成仪人工合成的前提：基因较小，核苷酸序列已知蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？启动子和终止子吗？课堂小结课堂小结1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成种类种类基因组文库：含有一种生物的全部基因基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，部分基因文库：只包含了一种生
9、物的部分基因，如：如：cDNA文库文库归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法思考：为什么要构建思考：为什么要构建基因表达载体？基因表达载体？（1 1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2 2）使目的基因能够表达和发挥作用。）使目的基因能够表达和发挥作用。二、构建表达载体二、构建表达载体作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？不可以。不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子因为目的基因在表达载体中
10、得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。和标记基因等。2.2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因启动子：启动子：终止子：终止子：标记基因：标记基因：位于基因首端的一段特殊的位于基因首端的一段特殊的DNADNA片段，它是片段，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出有了它才能驱动基因转录出mRNAmRNA。位于基因尾端的一段特殊的位于基因尾端的一段特殊的DNADNA片段，能终止片段，能
11、终止mRNAmRNA的转录。的转录。鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。相同点：相同点：不同点：不同点：思考：思考：载体与表达载体的异同载体与表达载体的异同都有标记基因和复制原点。都有标记基因和复制原点。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶切割限制酶切割两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接连接酶连接重组重组DNAD
12、NA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端用同一种限制酶分别切割目的基因个质粒，使之露出相同的粘性末端，并用用同一种限制酶分别切割目的基因个质粒，使之露出相同的粘性末端，并用DNA连接酶使之连连接酶使之连接接 三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化：目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生
13、物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞n农杆菌转化法农杆菌转化法n基因枪法基因枪法n花粉管通道法花粉管通道法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：特点：TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。染能力。转化过程转化过程:TiTi质粒质粒目的
14、基因目的基因构建构建表达载表达载体体导入导入植物植物细胞细胞插入插入植物细胞染色植物细胞染色DNADNA表达表达新性新性状状转入转入农杆农杆菌菌 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体表达载体DNADNA打入受体细胞中，使目的基因打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。与其整合并表达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在穿过花柱直通胚囊。花粉管
15、通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNADNA（含目的（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。受体细胞。2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）（2 2）操作程序）操作程序:提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到输卵管或子宫移植到输卵管或子宫受精卵发育受精卵发育新
16、性状动物新性状动物常用法：常用法：常用菌：常用菌：微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：过程：过程：CaCa2+2+处理大肠杆菌处理大肠杆菌感受态细胞感受态细胞表达载体与感受态细表达载体与感受态细胞混合胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管
17、通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理成感受态细胞处理成感受态细胞小结：将目的基因导入受体细胞小结：将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组入重组DNADNA分子吗？分子吗？1 12 2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定n检测检测:q是否插入目的基因是否插入目的基因q是否转录是否转录q是否翻译是否翻译n鉴定鉴定:q分子水平鉴定分子水平鉴定q个体生物学水
18、平鉴定个体生物学水平鉴定转基因生转基因生物的物的DNA探针探针15151414方法方法DNA分子杂交技术（分子杂交技术（DNA与与DNA）1、检测、检测分子水平的检测分子水平的检测方法方法DNA与与mRNA杂交技术杂交技术探针探针1515转基因生物转基因生物的的mRNA14141、检测、检测分子水平的检测分子水平的检测1、检测、检测分子水平的检测分子水平的检测提取提取苏云金杆苏云金杆菌菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注射小毒蛋白注射小鼠体内鼠体内从小鼠血管抽出血从小鼠血管抽出血液分离出抗液分离出抗Bt毒素毒素的抗体的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现杂交带出现杂交带脱分化脱分化组织培养组织培养
19、（二）鉴定（个体生物学水平）（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等类类型型步骤步骤检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示分分子子检检测测第一步第一步目的基因是否进入受体细目的基因是否进入受体细胞胞DNADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示出杂交是否成功显示出杂交带带第二步第二步目的基因是否转录出目的基因是否转录出mRNAmRNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示出杂交是否成功显示出杂交带带第三步第三步目的基因是否翻译出蛋白目的基因是否翻译出蛋白质质抗原抗原
20、抗体杂交抗体杂交是否成功显示出杂交是否成功显示出杂交带带个个体体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。归纳归纳:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序n获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRu化学方法人工合成化学方法人工合成n构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因n将目的基因导入受体细胞将目的基因
21、导入受体细胞u感受细胞法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）感受细胞法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）n目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译；个体检测：是否插入、转录、翻译；个体课堂练习课堂练习1 1、有关基因工程的叙述中，错误的是、有关基因工程的叙述中，错误的是()()A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、限制性内切酶用于目的基因的获得、限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、人工合成目的基因不用限
22、制性内切酶、人工合成目的基因不用限制性内切酶A课堂练习课堂练习2 2、下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取 从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成 A.A.B.B.C.C.D.D.D课堂练习课堂练习课堂练习课堂练习【拓展深化拓展深化】只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对骤都涉及碱基互补配对课堂练习课堂练习即时
23、应用即时应用(随学随练，轻松夺冠随学随练，轻松夺冠)5(2009年高考浙江卷年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是下列关于基因工程的叙述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达的细胞和促进目的基因的表达D DThank You世界触手可及携手共进，齐创精品工程
