1、蛋白质的分离与纯化的基本原理一、蛋白质的提取二、蛋白质的分离与纯化三、蛋白质的纯度鉴定、含量测定和结构分析一、蛋白质的提取1材料的选择 选择适当的材料，所需蛋白质含量较高，来源方便。注意保存条件（低温）2组织细胞的粉碎 超声、反复冻融、溶菌酶等3提取 选用适当的溶媒防止蛋白酶对有效成分的破坏。二、蛋白质的分离与纯化（一）根据溶解度不同的分离纯化方法（二）根据分子大小不同的分离纯化方法（三）根据电离性质不同的分离纯化方法（四）根据配基特异性的分离纯化方法根据溶解度不同的分离纯化方法1.溶液的pH等电点沉淀 2.离子强度盐析沉淀3.溶剂性质低温有机溶剂沉淀注意：温度 低温分子大小不同的分离纯化方法
2、透析（dialysis）法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与其他小分子物质分开。超滤法(ultrafiltration)是依据分子大小和形状，在10-8cm数量级进行选择性分离的技术。其原理是利用超滤膜在一定的压力或离心力的作用下，大分子物质被截留而小分子物质则滤过排出。半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）超滤膜，是一种孔径规格一致，额定孔径范围为0.001-0.02微米的微孔过滤膜。在膜的一侧施以适当压力，就能筛出小于孔径的溶质分子，以分离分子量大于500道尔顿、粒径大于220纳米的颗粒。：分子筛层析、凝胶过滤葡聚糖凝胶(Sep
3、hadex)丙烯酰胺凝胶(Bio-gel)琼脂糖凝胶(Sepharose)聚糖凝胶是以葡聚糖与交联剂形成有三维空间的网状结构物，两者的比例和反应条件决定其交联度的大小，用G表示。G越小、交联度越大、孔径越小。（density gradient centrifugation）蛋白质颗粒的沉降速度取决于它的大小和密度当其在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降得快并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停滞不前，可分步收集。根据电离性质不同的分离纯化方法带电质点在电场中向电荷相反的方向移动，这种性质称为电泳蛋白质在电场中移动的速度和方向主要取决于蛋白质分子所带的电荷的性质
4、、数量及质点的大小和形状。外界影响因素：电场强度、溶液的pH、离子强度及电渗等醋酸纤维薄膜电泳：临床用于血浆蛋白电泳分析。1.滤纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板聚丙烯酰胺凝胶电泳:它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，具有电泳和凝胶过滤的特点等电聚焦电泳两性电解质作为支持物，电泳时即形成一个由正到负极逐渐增加的pH梯度。分辨率高，pl相差0.02 pH单位即可分开两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在3001000之间。载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形
5、成一个连续的pH梯度。对两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度 加样品，然后继续电泳凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布等电聚焦电泳进行过程中等电聚焦电泳结束后（）（）（）（）高pH高pH低pH低pH免疫电泳电泳技术和抗原与抗体反应的特异性相结合，一般以琼脂或琼脂糖凝胶为支持物。方法是先将抗原中各蛋白质组分经凝胶电泳分开，然后加入特异性抗体经扩散可产生免疫沉淀反应。免疫电泳二维电泳根据蛋白质等电点和相对分子量采用等电聚焦方式和SDS-PAGE在两个相互垂直的方向上进行分
6、离。双向电泳的第一向为等电聚焦（等电点信息），第二向为SDS-PAGE（分子量信息）。是目前所有电泳技术中分辨率最高，信息量最多的技术。第一向电泳：等电聚焦电泳聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳第二向电泳：SDS-PAGE分子量大分子量小pH9pH3pH9pH3大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片利用离子交换基质上的可解离活性基团对各种蛋白结合力不同而达到分离目的的一种分离方法常用的支持基质：纤维素，琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、树脂CH2COO-H+DEAE+Cl-活性基团：阳离子：羧甲基（CM）阴离子：二乙基氨基乙基（DEAE）由于蛋白质分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也
7、可用阴离子交换剂进行蛋白的分离纯化。阴离子交换层析分离蛋白质阳离子交换层析原理洗脱方法：改变盐浓度和改变pH的方法亲和层析(affinity chromatography)利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的技术。这种分离纯化方法专一性强，理论上可以从复杂的体系中一步提取所需的物质。免疫亲和层析：抗原抗体凝集素亲和层析：糖凝集素金属螯和层析：如NTA-Nipoly-His根据配基特异性的分离纯化方法氨基酸、多肽、蛋白质类生物药物八种必需氨基酸：是人体必需从食物中获取的营养物胱氨酸、酪氨酸为非必需AA，但由蛋氨酸、苯丙氨酸产生所以食物中若有足够的胱氨酸和Tyr
8、，可以减少对Met和Phe的需求量，故胱氨酸和Tyr也称为半必需氨基酸。Lys对婴幼儿来说具有特殊的重要意义赖氨酸的需求量，按每天每kg体重计算，成年人为12mg，1岁以下婴幼儿为103mg。谷氨酸 谷氨酰胺 乙酰谷酰胺铝 组胺酸盐酸盐 甘氨酸及其铝盐 谷氨酸盐酸盐 通过调节胃液酸碱度，实现治疗作用通过保护消化道粘膜或促进粘膜增生而防治胃及十二指肠溃疡精氨酸盐酸盐磷葡精氨酸鸟天氨酸谷氨酸钠瓜氨酸赖氨酸盐酸盐天冬氨酸支链氨基酸谷氨酸钙盐及镁盐 维持神经肌肉正常兴奋，治疗神经衰弱 氢溴酸，谷氨酸钠 官能症 酪氨酸 中枢神经系统的抑制性递质，治疗记忆、色氨酸 语言障碍、脑外伤后遗症 5羟色氨酸 酪氨
9、酸亚硫酸盐 治疗脊髓灰质炎、结核性脑膜炎偶氮丝氨酸治疗白血病 氯苯丙氨酸治疗癌症综合症 磷乙天冬氨酸治疗B16黑色素瘤及Lewis肺癌 氨基酸药物中治疗作用比较显著的多数是其衍生物。促皮质素（ACTH）促黑激素（MSH）垂体多肽激素 脂肪水解激素（LPH）催产素（OT）加压素（AVP）促甲状腺激素释放激素（TRH）下丘脑激素 生长素抑制激素（GRIF）促性腺激素释放激素（LHRH）甲状腺激素 甲状旁腺激素（PTH）降钙素（CT）胰岛激素 胰高血糖素（不包括胰岛素，因为胰岛素是蛋白）胰解痉多肽 胃泌素 胆囊收缩素促胰酶素（CCKPZ）肠泌素胃肠道激素 肠血管活性肽 抑胃肽(GIP)缓激肽 P物质
10、 胸腺素胸腺激素 胸腺肽 胸腺血清因子这是一类目前研究十分活跃的多肽类药物。已批准生产的细胞因子多肽药物名称适应症IFN白血病、Kaposi肉瘤、肝炎、癌症、AIDSIFN慢性肉芽肿、生殖器疣、过敏性皮炎、感染性疾病、类风湿关节炎G-CSF自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞减少症、AIDS、白血病、再生障碍性贫血G M-CSF自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞减少症、AIDS、再生障碍性贫血、MDSEPO慢性肾衰竭导致的贫血、癌症或癌症化疗导致的贫血、失血后贫血IL-2癌症、免疫缺陷、疫苗佐剂IFN多发性硬化症TF免疫缺陷症、病毒感染、肿瘤EGF烧伤 已批准临床试验的细胞因子多肽药物名称适应症IL-1
11、放化疗所导致的骨髓抑制、癌症IL-1同上、促进伤口愈合IL-3骨髓衰竭、血小板缺乏、自身骨髓移植、化疗佐剂、外周血干细胞移植IL-4免疫缺陷、癌症、疫苗佐剂IL-6放化疗所导致的血小板减少、癌症、疫苗佐剂M-CSF癌症、白血病、骨髓移植、降胆固醇TNF癌症干细胞因子（SCF）骨髓衰竭TNF-炎症IL-11血小板减少症IL-1受体拮抗剂败血性休克、类风湿关节炎PIXY321骨髓衰竭 有可能用于临床的细胞因子多肽药物名称适应症IL-7免疫缺陷、血小板减少症IL-8肿瘤局部治疗IL-9造血功能障碍、免疫缺陷IL-10感染、炎症IL-12癌症IL-13感染、炎症、移植排斥MIF（巨噬细胞移动抑制因子）
12、感染、疫苗佐剂MIP（巨噬细胞炎症蛋白）感染、肿瘤MCP（巨噬细胞趋化因子）感染、肿瘤LIF（白血病抑制因子）白血病、造血功能障碍GIF（糖基化抑制因子）炎症 骨宁 抗关节炎、镇痛 眼生素 用于眼科疾病 脑氨肽 作用类似脑活素 蜂毒 治疗关节炎 蛇毒 抗血栓 谷胱甘肽解毒剂 妇血宁 胎盘提取物 花粉提取物 脾水解物 肝水解物 生长素（GH）催乳激素（PRL）垂体蛋白质激素 促甲状腺素（TSH）促黄体生成激素（LH）促卵泡激素（FSH）人绒毛膜促性腺激素（HCG）促性腺激素 绝经尿促性腺激素(HMG)血清性促性腺激素(SGH)胰岛素 胰岛素及其它蛋白质激素 胰抗脂肝素 松弛素 尿抑胃素 白蛋白 纤维蛋白溶酶原 血浆纤维结合蛋白（FN）两种免疫球蛋白 抗淋巴细胞免疫球蛋白 抗HBs免疫球蛋白 抗血友病球蛋白 纤维蛋白原 抗凝血酶 凝血因子 凝血因子 干扰素（、）神经生长因子（MGF）肝细胞生长因子（HGF）血小板衍生的生长因子（PDGF）组织纤溶酶原激活因子（tPA）促红细胞生成素（EPO）胃发生蛋白（BMP）（从小牛骨中提取，促进断骨接上）胃膜素 硫酸糖肽 内在因子 血型物质A和B等 明胶 氧化聚合明胶、阿胶、新阿胶、冻干猪皮等 硫酸鱼精蛋白 胰蛋白酶抑制剂（抑肽酶）大豆胰蛋白酶抑制剂 PHA、ConA(促进淋巴细胞转化)
