1、乳腺癌基因治疗研究进展乳腺癌基因治疗研究进展Theresearchprogressofhumanbreastcancergenetherapy分子生物学系2 乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤。据国际抗癌协会（肿瘤。据国际抗癌协会（IARC）公布的统计资料表明，乳腺癌在全公布的统计资料表明，乳腺癌在全世界大多数地区的发病率有逐年增世界大多数地区的发病率有逐年增高的趋势，现已成为女性发病率最高的趋势，现已成为女性发病率最高的恶性肿瘤。高的恶性肿瘤。第一节第一节 乳腺癌基因治疗研究背景乳腺癌基因治疗研究背景3乳腺癌的危险因素：乳腺癌的危险因素：(1)与发育、激素水平有
2、关与发育、激素水平有关(2)与营养膳食有关与营养膳食有关(3)与家族史和基因改变遗传因素有关与家族史和基因改变遗传因素有关 a.抑癌基因失活抑癌基因失活 b.癌基因异常癌基因异常(4)其它危险因素其它危险因素4乳腺癌肿瘤治疗乳腺癌肿瘤治疗模式模式 手术、放疗、化疗、激素治疗是肿瘤治疗的常规模式。这些治疗方法常难彻底消灭肿瘤细胞又易伤及正常组织，特别是伤害机体的免疫系统。目前肿瘤的基因治疗日益受到人们的重视，显示出良好的应用前景。5乳腺癌发病的分子机理主要有两个方面：第一、基因表达异常。最常见的基因表达异常是cyclin D1、neu和ras、c-myc 或 Wnt-1 原癌基因过表达。第二、基
3、因结构改变。包括染色体缺失与基因扩增。第二节第二节 乳腺癌自杀基因治疗的乳腺癌自杀基因治疗的概念、内容与特点概念、内容与特点6Breast cancer gene therapy using tumour suppressor genes Clinical trials of p53 gene replacement have had limited success;PTEN expression alters metastatic potential and reduces neovascularization 7Prospects The ability to induce growth
4、arrest and apoptosis Downstream targets of p53 and Rb is necessaryClinical trials of second-generation oncolytic virusesCombinations of tumour suppressor genes8乳腺癌抗体治疗乳腺癌抗体治疗 单克隆抗体HerceptinHerceptin(贺赛汀)针对HER-2/neu原癌基因的人/鼠嵌合单抗，与细胞表面的erb-B2受体结合,抑制乳腺癌细胞的生长,产生抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。免疫基因治疗免疫基因治疗指在基因水平，通过诱发或加强机体
5、内针对肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原（TAAs）的特异性免疫反应，调动宿主的免疫系统来识别并破坏癌细胞。乳腺癌组织表达多种TAAs，包括HER-2/neu（c-er-2）、MACG-1和MUC-1等，机体针对这些TAAs产生一定的特异性体液和细胞免疫反应。将编码促进免疫反应的细胞因子的基因直接在体内转染到肿瘤细胞内，或在体外将这些基因转染到肿瘤细胞内，在肿瘤细胞经放射线照射灭活后，自身移植于体内，以增强免疫反应。包括IL-2、IL-12、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等。10 采用特异的靶抗原作为疫苗对肿瘤的免疫反应更有效。目前用于乳腺癌免疫治疗的特异抗原包括HER-2、CE
6、A、MAGE-1、MUC-1等。采用基因工程将编码这些抗原的基因修饰后，克隆到逆病毒载体，转入体内；或在体外采用基因工程，将这些抗原的不同抗原簇克隆，产生不同抗体，筛选出能抑制肿瘤细胞生长的抗体。赫赛汀（Herceptin）就是针对c-er-2细胞外区域不同抗原簇的人单克隆抗体。它可有效抑制c-er-2的下游信号传导，从而抑制乳腺癌细胞的生长。特异性靶抗原的免疫治疗特异性靶抗原的免疫治疗肿瘤抑癌基因治疗 野生型p53基因具有通过调控视网膜母细胞瘤基因控制细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用。但是，由于乳腺癌细胞中p53易突变而失活，影响了p53基因治疗乳腺癌应用。在乳腺癌家族中发现抑癌基因BRCA1常
7、存在突变而表达过低。在乳腺癌动物模型中采用装有BRCA1的逆病毒载体，直接注射入瘤内，可抑制晚期乳腺癌胸壁转移瘤的生长。化学基因治疗 将耐药基因，如多药耐药基因（MDR）转入造血干细胞，然后自体回输以增加化疗药物剂量，增强疗效，也不影响机体的造血系统。Cowan等将4例乳腺癌病人的造血细胞提取后，体外转染MDR基因，并且在体外应用大剂量化学药物杀死可能污染的肿瘤细胞后，将转染了MDR的造血细胞自身移植。给予大剂量的化学药物治疗后，3例病人移植细胞中仍可检测到MDR的表达，转染MDR的细胞存活率与骨髓抑制成反比，无严重毒副作用发生。药物前体激活基因治疗（GPAT）可以利用正常和肿瘤细胞之间的某一
8、基因转录差异，选择性驱动表达导入肿瘤细胞内的无活性化疗药物前体转化为有活性的代谢产物，特异性杀伤肿瘤细胞。氟脲类药物对乳腺癌有杀伤作用，但5-氟胞嘧啶核苷酸（5-FC）作为药物前体，对细胞无杀伤作用，而它在嘧啶脱氨酶的转化下，可代谢为有活性的5-FU（5-氟尿嘧啶）而具有杀伤肿瘤细胞的能力。化合物中筛选出一种名为维生素B17的化合物。维生素B17可以通过竞争性结合ATP，不可逆地抑制c-er-2活性，而不影响其蛋白表达。动物实验表明，维生素B17可使c-er-2过度表达的乳腺癌肿瘤缩小。显性基因敲除治疗敲除显性的癌基因，削弱肿瘤的生长和浸润能力。研究表明，一种myc反义核酸对雌激素依赖型和非依
9、赖型乳腺癌细胞均有抑制作用，转化生长因子（TNF-）的反义信使RNA能够抑制雌激素诱导的雌激素反应性乳腺癌细胞的增殖。抗血管生成基因治疗抗血管生成基因的因子包括内皮抑素、血管抑素和干扰素-。基于肿瘤和正常内皮细胞之间基因表达的差异，选择性抑制肿瘤内皮细胞中异常基因的表达，抑制肿瘤血管生成，从而达到治疗肿瘤的目的。最强的血管生成细胞因子是VEGF。反义核酸，可溶性VEGFR、核糖酶、抗VECF单克隆抗体和受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂已被用于抗肿瘤血管生成的基因治疗。18自杀基因治疗乳腺癌的作用机理自杀基因治疗乳腺癌的作用机理病毒载体病毒载体病毒蛋白病毒蛋白自杀基因自杀基因药物前体药物前体 毒性
10、代谢物毒性代谢物乳腺癌细胞乳腺癌细胞直接杀伤直接杀伤癌癌细胞细胞通过旁通过旁观者观者效效应杀伤应杀伤癌癌细胞细胞19 自杀基因 HSVtk 编码胸腺嘧啶激酶，在细胞内，自杀基因HSVtk 能将核苷类似物 GCV 磷酸化，使其进一步代谢为三磷酸 GCV，抑制细胞 DNA 聚合酶，影响 DNA合成，导致细胞死亡，达到清除肿瘤的目的。20 存在的问题存在的问题？目的基因的表达不受控制，存在过度表达或不适当表达，特别是当插入基因是一些毒性的基因或对机体有影响时，不仅对疾病的治疗不利，甚至会导致致命的副作用。21 特异性的转录调控元件使治疗基因准确、有效地表达于肿瘤细胞，使治疗基因的表达受体外因素的调控
11、，提高基因治疗的有效性和可控性，是基因治疗领域的一个重要问题。第三节第三节 乳腺癌自杀基因调控治疗乳腺癌自杀基因调控治疗22乳腺癌基因治疗的调控元件乳腺癌基因治疗的调控元件1)乳腺癌相关基因：erbB-2、Muc-1、p53、BRCA1、BRCA2、nm23、p16等；2)组织特异性基因:雌激素反应元件(ERE)、人乳白蛋白基因(hALA)、羊乳球蛋白基因(oBLG)等；3)缺氧反应元件(HRE)等。23Tet Tet 基因表达调控系统基因表达调控系统 Tet 系统利用大肠杆菌抗系统利用大肠杆菌抗四环素操纵子四环素操纵子 的阻遏与去的阻遏与去阻遏作用来调控基因表达，阻遏作用来调控基因表达，使基
12、因表达受四环素的精使基因表达受四环素的精确调控。确调控。Tet 激活系统激活系统（Tet-On）是突变的）是突变的 tet 阻遏蛋白与阻遏蛋白与 VP16 的激活的激活域融合表达域融合表达 rtTA,强力霉强力霉素存在时，素存在时，rtTA 与与 tetOp 结合，激活靶向转结合，激活靶向转录录。24 Tet-On 调节乳腺癌细胞株调节乳腺癌细胞株 HSVtk 表达及表达及 体外调控性治疗作用的实验研究体外调控性治疗作用的实验研究25 重组逆转录病毒载体重组逆转录病毒载体 pRevTRE/tk的构建的构建 PCR 扩增获得扩增获得HSVtk 基因基因DNA 片段，设片段，设计引物时，在计引物时
13、，在引物引物 TK1 的的 5加上加上BamH酶酶切位点，引物切位点，引物 TK2 的的 5 加上加上Hind 酶切酶切位点，定向克位点，定向克隆到隆到pRevTRE质粒上质粒上,得到得到pRevTRE/tk质质粒。粒。26重组逆转录病毒载体重组逆转录病毒载体 pRevTRE/tk的鉴定的鉴定M 1 2图 1 重组质粒 pRevTRE/tk的 酶切鉴定结果M:DNA/Hind DNA Markerlane 1:pRevTRE/HSVtk/Bam HI+Hind;lane 2:pRevTRE/HSVtk plasmid DNA图 2 重组质粒pRevTRE/tk 的PCR鉴定结果M:100bp
14、DNA ladder Marker;lane 1:PCR product with primer TK1 and TK2;lane 2:PCR product with primer TK3 and TK427 MCF-7细胞转染实验细胞转染实验 28 Tet-On 基因调控系统中，其发挥作用所需的两个组成元件：TRE 元件和rtTA 元件，分别克隆于两个载体系统中。使用时先将含有TRE元件和目的基因转染入宿主细胞，然后再以含有 rtTA 的质粒转染该细胞，经过两次转染而构建出细胞株。29MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞 HSVtk 基因的表达 图图 3 Dox 调节调节 MCF/TR
15、E/tk/Tet-On 细胞中细胞中 HSVtk 基因的表达基因的表达 M:100 bp DNA Marker;Lane 1-6代表代表 Dox 浓度为浓度为0，0.1，1，10，100,1000 g/ml时细胞时细胞HSVtk 基因的表达基因的表达30MTT MTT 法检测分析法检测分析 MCF/TRE/tk/Tet-On MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活率细胞存活率 图图 4 在在 Dox 浓度为浓度为 1g/ml 时，时，MTT 法检测法检测 GCV不不同浓度时同浓度时 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活率的变化细胞存活率的变化31Dox 浓度对浓度对 MCF/TR
16、E/tk/Tet-On 细胞生长的影响细胞生长的影响 01234567890200400600800100012001500D D o o x x c c y y c c l l i i n n e e c c o o n n c c e e n n t t r r a a t t i i o o n n (n n g g/m m l l)Cell number(1x104 cells/ml)图图 5 GCV 浓度为浓度为 1 g/ml 时，不同浓度时，不同浓度 Dox 对对 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活数的影响细胞存活数的影响32旁观者效应旁观者效应 表 1 MCF/TRE/
17、tk/Tet-On 细胞旁观者效应的克隆记数1 1组组(n=4)(n=4)2 2组组(n=4)(n=4)3 3组组(n=4)(n=4)4 4组组(n=4)(n=4)5 5组组(n=4)(n=4)6 6组组(n=4)(n=4)MCF-7 MCF-7 100%95%90%75%50%0%MCF/TRE/tk/Tet-MCF/TRE/tk/Tet-On On 0%5%10%25%50%100%克隆计数克隆计数(均值均值SE)SE)36.00.8134.00.0.81814.50.60.65 55.00.0.71715.00.50.58 83.50.0.505033可调控性自杀基因乳腺癌动物模型的建立
18、可调控性自杀基因乳腺癌动物模型的建立 以表达 HSVtk基因及调控系统 Tet-On 的乳腺癌细胞 MCF/TRE/tk/Tet-On 直接接种SCID 小鼠成功建立了可调控性自杀基因乳腺癌动物模型，为探讨自杀基因体外调控机制的研究奠定了基础。34SCID小鼠体内成瘤及治疗前后肿瘤大小的变化小鼠体内成瘤及治疗前后肿瘤大小的变化 图图 6 乳腺癌细胞乳腺癌细胞 MCF/TRE/tk/Tet-On 接种接种 SCID小鼠后，小鼠后，NS组、组、GCV组、组、GCV+Dox组组 SCID小鼠肿瘤体积的变化小鼠肿瘤体积的变化35SCID小鼠肿瘤组织病理学观察小鼠肿瘤组织病理学观察 图图 7 三组三组（
19、NS组、组、GCV组、组、GCV+Dox组）组）SCID 乳腺癌小鼠乳腺癌小鼠 经治疗经治疗15天后肿瘤组织病理学观察天后肿瘤组织病理学观察 H-E染色（染色（250）NS 对照组对照组;GCV 治疗组治疗组;A.Dox+GCV 治疗组治疗组36RT-PCR 检测 SCID小鼠肿瘤组织 HSVtk的表达 M 1 2 3图图 8 RT-PCR 检测各组检测各组 SCID小鼠肿瘤治疗小鼠肿瘤治疗15天后天后 HSVtk的表达的表达M:100bp Marker;1.GCV治疗组治疗组;2.Dox+GCV治疗组治疗组;3.NS 对照组对照组37研究背景 逆转录病毒载体用于 ex vivo基因治疗，实际
20、感染效率低。原因:一、感染正在分裂的细胞；二、获得病毒滴度低；三、病毒半衰期短，移动距离有限,在一个半 衰期内大多数病毒不能到达靶细胞。重组逆转录病毒介导的重组逆转录病毒介导的 HSVtk基因基因 表达及提高逆病毒滴度的初步研究表达及提高逆病毒滴度的初步研究38逆转录病毒的纯化 将初步浓缩的病毒液经冷冻干燥去除更多的水分，以小体积的缓冲液（DMEM）复溶后70冻存得到浓缩病毒液。39产毒 PA317 阳性细胞克隆筛选培养 图图 14 微乒乓感染微乒乓感染 pRevTRE/HSVtk、pRevTet-On、pRevTRE 载体的载体的 PA317 细胞经潮霉素细胞经潮霉素B、G418 筛选筛选2
21、周周后形成的抗性克隆后形成的抗性克隆 (100)40不同培养时间与重组病毒滴度的关系不同培养时间与重组病毒滴度的关系 不同培养时间对克隆不同培养时间对克隆 PA317 细胞产生重组细胞产生重组 病毒滴度的测定病毒滴度的测定41不同丁酸钠浓度和重组病毒滴度的关系不同丁酸钠浓度和重组病毒滴度的关系 0 5 10 15 20 不同丁酸钠浓度下对克隆不同丁酸钠浓度下对克隆 PA317 细胞培养细胞培养 30h 产生重组病毒滴度的测定产生重组病毒滴度的测定42SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无病毒蛋白表达聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无病毒蛋白表达 克隆克隆 PA317 细胞上清细胞上清 SDS-聚丙烯酰胺凝
22、胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳M：蛋白质分子标准；蛋白质分子标准；Lane 1：pRevTRE DNA转染转染 PA317 30 h 后细胞上清；后细胞上清；Lane 2：pRevTRE/tk DNA转染转染 PA317 30 h 后细胞上清后细胞上清43PCR 检测克隆的细胞上清有无 HSVtk 基因插入片段 1,240 bppRevTRE/tk DNA转染转染 PA317 30 h 后细胞上清；后细胞上清；pRevTRE DNA转染转染 PA317 30 h 后细胞上清后细胞上清 44RT-PCR 检测被逆转录病毒浓缩液感染的 MCF-7 细胞中 HSVtk 基因的表达-actin420 bp图
23、图 13 逆转录病毒浓缩液感染的逆转录病毒浓缩液感染的 MCF-7细胞中细胞中 HSVtk 基因的表达基因的表达M：100 bp DNA 标准物；标准物；Lane 1：MCF-7 细胞细胞；Lane 2：被重组逆转录病毒液感染的被重组逆转录病毒液感染的 MCF-7 细胞细胞 45产毒性细胞系分泌重组病毒的产毒性细胞系分泌重组病毒的 PCR鉴定鉴定图图 15 pRevTRE/tk、pRevTet-On、pRevTRE 乒乓转染的乒乓转染的 PA317 细胞上清细胞上清PCR 扩增目的基因扩增目的基因M：100 bp ladder marker；1：转染转染 pRevTRE/HSVtk 质粒载体的
24、克质粒载体的克 隆隆 PA317 细胞上清；细胞上清；2：转染转染 pRevTet-On 质粒载体的克隆质粒载体的克隆 PA317 细胞上清；细胞上清；3：转染转染 pRevTRE质粒载体的克质粒载体的克 PA317 细胞上清细胞上清46重组病毒感染重组病毒感染 MCF-7 细胞及阳性克隆细胞及阳性克隆细胞株的筛选细胞株的筛选 图图 16 重组病毒感染重组病毒感染 MCF-7 细胞后筛选的潮霉素细胞后筛选的潮霉素B和和 G418 抗性克隆抗性克隆 (100)可调控性重组逆转录病毒在乳腺癌基因治疗中可调控性重组逆转录病毒在乳腺癌基因治疗中的实验研究的实验研究47 制备重组逆转录病毒 RevTRE
25、/HSVtk 和 RevTet-On，然后通过逆转录病毒感染靶细胞，将 Tet-On 基因调控系统中的反应元件 TRE 和 rtTA 调控元件共同整合到同一宿主细胞中，使目的基因导入靶细胞，并处于 Tet-On 基因的有效调控，同时也提高了外源目的基因的转导效率。48病毒感染细胞基因组 DNA 的提取与酶切 图图 17 病毒感染细胞基因组病毒感染细胞基因组 DNA 的提取与酶切图的提取与酶切图M：Lambda DNA/EcoRI+Hind DNA Marker；1：逆病毒逆病毒 RevTRE/HSVtk 和和 RevTet-On 感染感染 MCF-7 细胞基因组细胞基因组 DNA；2：MCF-
26、7 细胞基因组细胞基因组 DNA；3：MCF-7 细胞基因组细胞基因组 DNA EcoRI酶切；酶切；4：逆病毒逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染感染 MCF-7 细胞基因组细胞基因组 DNA EcoRI酶切酶切49逆病毒感染细胞 Southern印迹杂交分析 M 1 2 3 图图 18 细胞细胞 Southern 印迹杂交分析图印迹杂交分析图 M：100 bp ladder marker；1：MCF-7 细胞；细胞；2：逆病毒逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 一次感染的一次感染的 MCF-7 细胞；细胞；3：逆病毒逆病毒 RevTRE/HSVtk、
27、RevTet-On 重复感染的重复感染的 MCF-7细胞细胞50利用微乒乓感染的方法将制备的重组逆转录病毒 RevTRE/HSVtk 和 RevTet-On 导入乳腺癌细胞株 MCF-7 细胞。实验中观察到，HSVtk 基因的表达受 Dox 的诱导调控，随着 Dox 的浓度增高，GCV 对乳腺癌细胞的杀伤能力加强。51台盼蓝排斥试验和细胞计数分析检测细胞活力台盼蓝排斥试验和细胞计数分析检测细胞活力图图 19 不同不同 Dox 浓度诱导下台盼蓝排斥试验和细胞计数浓度诱导下台盼蓝排斥试验和细胞计数52MTT 法检测重组病毒感染的 MCF-7 细胞不同药物浓度诱导 24 h 的存活率53流式细胞分析
28、图图 20 流式细胞仪流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡图）检测细胞凋亡图1：MCF-7 细胞；细胞；2：逆病毒逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染的感染的 MCF-7 细胞；细胞；3：1g/ml Dox、2g/ml GCV 作用作用 48 h 的逆转录病毒感染的逆转录病毒感染 MCF-7 细胞细胞54流式细胞仪（FCM）检测细胞周期 图图 21 流式细胞仪流式细胞仪（FCM）检测细胞周期图）检测细胞周期图 1：MCF-7 细胞；细胞；2：逆病毒逆病毒RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染的感染的 MCF-7 细胞；细胞；3：1g/ml Dox、2g/ml GC
29、V作用作用 48 h 的逆转录病毒感染的逆转录病毒感染 MCF-7 细胞细胞55半定量 RT-PCR 的方法探讨重组逆转录病毒感染MCF-7 细胞在 Dox不同浓度诱导下自杀基因的表达 56TUNEL分析图图 22 TUNEL法检测逆转录病毒感染法检测逆转录病毒感染 MCF-7 细胞镜下改变（细胞镜下改变（1040）1：MCF-7 细胞在细胞在 DMEM 完全培养基条件下培养完全培养基条件下培养 48 h；2：1g/ml Dox、2g/ml GCV作用作用 48 h 的逆转录病毒感染的逆转录病毒感染 MCF-7 细胞；细胞；“”示凋亡小体。示凋亡小体。57BALB/c裸鼠乳腺癌移植瘤模型的建立
30、裸鼠乳腺癌移植瘤模型的建立 58 通过逆病毒直接注射将调控因子 Tet-On 基因及反应元件 TRE 转入到乳腺癌细胞株 MCF-7 裸鼠成瘤模型内，使得裸鼠的体内肿瘤能受到外源诱导剂 Dox 的诱导控制，使自杀基因 HSVtk 转录与表达受到Tet-On 系统的调控，并激活前药 GCV，在体内发挥杀瘤作用。59BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验60BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验A：DMEM 组；组；B：GCV+Dox 组；组；C：GCV+病毒组；病毒组；D：Dox+GCV+病毒组病毒组61BALB/c裸鼠移植瘤治疗结束后湿重 62M:100 bp Marker；1：DMEM 组荷瘤裸鼠肿瘤；组荷瘤裸鼠肿瘤；2：GCV+Dox 组荷瘤裸鼠肿瘤；组荷瘤裸鼠肿瘤；3：GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤；病毒组荷瘤裸鼠肿瘤；4：Dox+GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤病毒组荷瘤裸鼠肿瘤 RT-PCR 检测检测 BALB/c 荷瘤裸鼠治疗荷瘤裸鼠治疗35天后天后肿瘤肿瘤 HSVtk 的表达的表达 63BALB/c裸鼠移植瘤的病理形态学检测 NoImageA：DMEM 组；组；B：GCV+Dox 组；组；C：GCV+病毒组；病毒组；D：Dox+GCV+病毒组病毒组NoImageC乳腺癌自杀基因调控治疗的问题与展望靶组织特异性靶组织特异性调控特异性调控特异性杀瘤有效性杀瘤有效性64
