1、第四章第四章 抗体制药抗体制药2023-1-131掌握：掌握：单克隆抗体的制备原理、方法及基本过程；单克隆抗体药物靶标的选择；基因工程抗体的类型。熟悉：熟悉：噬菌体抗体库技术的原理和基本过程；单链抗体、双特异抗体的制备方法；转基因动物表达抗体的方法。了解：了解：抗体药物的发展趋势。学习要求学习要求:u第一节 概述u第二节 单克隆抗体及其制备u第三节 基因工程抗体及其制备u第四节 噬菌体抗体库技术u第五节 转基因动物表达抗体u第六节 抗体治疗药物2023-1-133内内 容容第一节第一节 概概 述述一、基本概念抗体（抗体（antibody，Ab）：）：指能与相应抗原特异性结合指能与相应抗原特异性
2、结合的具有免疫功能的球蛋白。的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗体活性或具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白化学结构与抗体相似的球蛋白IgAb化学结构上的概念生物学功能上的概念2023-1-134抗体工程制药：利用基因工程、细胞工程和转基因动植抗体工程制药：利用基因工程、细胞工程和转基因动植物技术生产抗体药物的过程。物技术生产抗体药物的过程。2023-1-135免疫球蛋白（抗体）的基本结构免疫球蛋白（抗体）的基本结构1、重链和轻链、重链和轻链 重链可分为、链；轻链可分为、型。抗体的类型由重链类型决定，上述重链分别对应了IgA IgD
3、IgE IgG IgM 2、可变区和恒定区、可变区和恒定区 重链和轻链N端第一个结构域为可变区（variable region,V区)，轻链其余的1个及重链的3-4个结构域为恒定区；V区存在3个高变区也称互补决定区(complementarity-determining region,CDR13)及4个骨架区（framework region,FR14).三个高变区共同组成Ig 的抗原识别部位，形成与抗原决定基互补的表位。2023-1-1372023-1-138u多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，对其产生的抗体也是多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。u单克隆抗体：针对一个抗原决
4、定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的、高度特异、均一、来源稳定、可大量生产的抗体。多抗与单抗多抗与单抗传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体混合混合1 234BALB/c12341 234多克隆抗体制备过程1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗体分开单克隆抗体制备过程疾病的诊断和治疗：诊断:检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断。临床治疗：u如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，对器官移植排斥反应有显著抑制作用，用作免疫抑制剂。u作为载体制备导向药物（Antibody drug conjugates,ADC）治疗肿瘤。2023-1
5、-1311抗体的应用抗体的应用需解决的问题需解决的问题：u鼠源性单克隆抗体的免疫原性（HAMA）；u完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度；u延长半衰期。u其他2023-1-1312u基本消除了单克隆抗体的鼠源性（免疫原性）,鼠源氨基酸只占完整抗体分子的1/801/3，只保留同抗原特异性结合的活性。u制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。2023-1-1313基因工程技术为解决问题提供了可能基因工程技术为解决问题提供了可能二、抗体工程发展历程及趋势二、抗体工程发展历程及趋势1890年，Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素1
6、937年，Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、丙种（）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。1975年，Khler and Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出 McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。1976年，Susumu Touegava（利根川进）揭示了抗体多样性的遗传学基础。1984年报道了人鼠嵌合抗体 多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体2023-1-13142023-1-1315 商业化的抗体药物商业化的抗体药物2023-1-13162023-1-13FDA 批准的抗体药物n全抗体全抗体 37个（至个（至2014.
7、10月）月）n抗体片段抗体片段 3个个nADC 3个（个（1个已撤市）个已撤市）n双特异抗体双特异抗体 2个个nFc融合蛋白融合蛋白 7个个鼠源嵌合人源化人源ADC1986OKT31994ReoPro1997RituxanZenapax1998SimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrel2000Mylotarg2001Campath2002ZevalinHumira2003XolairBexxar2004AvastinErbitux2006LucentisVectibix2007Soliris2008Cimzia2009StelaraSinponi2010Act
8、emraNumax2011BenlystaYervoyAdcetris2012PerjetaEylea2013KadcylaGazyva2014Cyramza SylvantEntyvioKeytruda2014年年全球生物药品销售额全球生物药品销售额前前10名名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1 Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai12.54RATNF2Remicade J&J9.24RA、CrohnsTNF3RituxanBiogen-IDEC8.678Non-Hopkins LymphomaCD204Enbr
9、elAmgen8.538RA、牛皮癣TNF4Lantus(insulin glargine)Sanofi7.279I/II型糖尿病/6Avastin Roche/Genentech6.957结肠癌，NSCLCVEGF7Herceptin Roche/Genentech6.793乳腺癌，胃癌HER28Neulasta Amgen4.39白细胞减少症/9Lucentis Roche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35贫血及癌症化疗引起贫血/20132013年年1414个抗体药物销售过个抗体药物销售过1010亿美元亿美元2023-1-1319
10、110.265.687.7683.867567.51生物药物专利悬崖生物药物专利悬崖Pharmaceuticals 2012,5,1393-1408 生物技术药物研发热浪涌向中国重磅化药销售重磅化药销售Pharmaceuticals 2012,5,1393-1408 第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备2023-1-1322一、抗体分子的结构与功能二、单克隆抗体的制备(1)Fab段2个抗原结合片段 fragment with antigen binding (2)Fc段 1个可结晶片段 fragment crystallized Porter 木瓜蛋白酶 (1)F(ab)2 段
11、1个 结合颗粒性抗原出现凝集反应 (2)Fc段 1个 无生物学活性Nisonoff 胃蛋白酶1、酶解片段一、抗体分子的结构与功能（1）、轻链（light chain，L链）214个氨基酸残基，24KD。分为：与2个亚型。（2）、重链（heavy chain，H链）450-550个氨基酸残基，55-75KD。分为5类，、链。IgM，IgG，IgA，IgD，IgE。2、重链和轻链 3、可变区和恒定区（1）可变区（Variable region，V区）L链N端 1/2处（VL）110个aa;H链N端1/5-1/4处（VH）118个aa。HVR1，HVR2，HVR3又分别称为CDR1，CDR2，CDR
12、3骨架区（framework region,FR）高变区（hypervariable region,HVR）互补决定区（complementarity-determining region,CDR），（2）恒定区（constant region，C区）L链C端1/2处，105个aa;H链C端3/4-4/5处，331-431个aa。4、功能区（1）L链：2个，VL，CL各1（2）H链：IgG，IgA，IgD：4个（V区1个，C区3个）IgM，IgE：5个（V区1个，C区4个）（3）功能区的作用：（a）VL和VH：结合抗原决定簇（FV区）（b）CL和CH：具有同种异型的遗传标记（c）CH2：结合补
13、体（d）CH3：结合Fc受体单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，B细胞，NK细胞5、抗体基因结构2023-1-1327人类编码人类编码Ig的基因分别位于不同的染色体的基因分别位于不同的染色体重链（Heavy chain)基因：位于14号染色体；轻链基因：链基因位于2号染色体；链基因位于22号染色体。每条肽链的编码基因可分为每条肽链的编码基因可分为V区和区和C区两大部分区两大部分。V区的基因是由不同的基因片段拼接而成的重链V区：由V、D、J片段拼接；轻链V区：由V、J拼接。C区拼接决定了抗体的类别（、）胚系重链的基因结构：胚系重链的基因结构：(a)鼠鼠 (b)人人重链的重链的VDJVDJ重组重组2023
14、-1-1329轻链基因胚系及重排后结构轻链基因胚系及重排后结构抗体类别转换抗体类别转换2023-1-1331uV区功能：识别并特异性结合抗原uC区功能：激活补体系统：激活补体系统：抗体与抗原结合形成复合物可通过启动C1q激活补体经典途径及补体旁路途径；介导免疫细胞活性介导免疫细胞活性：抗体的调理作用；ADCC作用；介导超敏反应。穿过胎盘和黏膜：穿过胎盘和黏膜：IgG是唯一能从母体通过胎盘屏障转运到胎儿体内的抗体；IgA合成的主要作用部位在黏膜，是黏膜局部抗感染的主要物质。2023-1-13325、抗体的功能2023-1-1333抗体功能（抗体功能（C C区）区）-ADCC-ADCC2023-1
15、-1334抗体功能（抗体功能（C C区）区）-CDC-CDC2023-1-1335IgG4、IgA、IgE二、单克隆抗体及其制备二、单克隆抗体及其制备2023-1-13361.抗原与动物免疫2.细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养3.筛选阳性克隆与克隆化4.杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定5.单克隆抗体的大量制备6.单克隆抗体的纯化单克隆抗体制备原理37单克隆抗体制备的基本技术单克隆抗体制备的基本技术1、抗原与动物免疫抗原抗原：免疫动物：免疫动物：BALB/c小鼠或Lou大鼠；目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和 LOU大鼠。免疫方法：免疫方法：体内免疫和体外免疫(体外致敏淋巴细胞)。体内免疫
16、法体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用812周龄雌性鼠。颗粒性抗原（细胞抗原）颗粒性抗原（细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔13周，追加免疫12次。可溶性抗原：可溶性抗原：按10100g抗原/小鼠与福氏完全佐剂和灭活的分枝杆菌等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔24周，再用不加佐剂原抗原追加免疫12次。一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本方法：脾细胞（基本方法：脾细胞（1 1*10108 8）与骨髓瘤细胞）与骨髓瘤细胞（2 2*10
17、107 733*10107 7）混合，在）混合，在PEGPEG作用下诱导融合作用下诱导融合(2min)(2min)，用培养液将，用培养液将PEGPEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释 。骨髓瘤细胞：SP2/0、P3.653，为缺陷性。PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂；常用浓度为40%50%，相对分子质量4000为佳。为了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。作用机理：作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合 细胞融合的步骤：细胞融合的步骤：v将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：110：1的
18、比例混匀于50ml锥形离心管内v200rpm离心710分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层 v在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG 0.5ml，随后静置60秒 v再于5分钟内边振摇边逐滴加入510ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用 v再静置10分钟。癌细胞可培养生长浆细胞B cell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也可以培养生長产生专一性抗体一個 B cell 只产生一种抗体u细胞融合液中如何去除脾细胞融合液中如何去除脾-瘤以外的瘤以外的融和细胞？融和细胞？解
19、决方法：解决方法：选择性培养基选择性培养基(HAT(HAT）HATHAT培养基筛选杂交瘤细胞培养基筛选杂交瘤细胞uHATHAT是含一定浓度次黄嘌呤（是含一定浓度次黄嘌呤（H H）、氨基喋呤（）、氨基喋呤（A A）及胸腺嘧啶核苷（及胸腺嘧啶核苷（T T）的一种选择性培养基，其中）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞三种成分与细胞DNADNA合成有关。合成有关。mm核酸次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶胸腺嘧啶核苷激酶叶酸拮抗物2023-1-1346选择性培养方法：u将融合的细胞悬浮于HAT的培养液，加入到96孔板内u每23天换液一次。换液时吸去1/22/3培养液，加入等量的新鲜培养液。u7天内:用H
20、AT培养液，杀死瘤-瘤融合细胞后，第714天:改用HT培养液，14天以后:用普通的RPMI1640完全培养液。u从融合后89天就可对所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测，筛选出产生抗体的阳性克隆。u大量细胞在大量细胞在HATHAT培养基中死亡，单个或少数杂培养基中死亡，单个或少数杂交瘤细胞不易存活？交瘤细胞不易存活？u解决办法：饲养细胞解决办法：饲养细胞 小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞 最适的条件下,105个脾细胞形成1个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不能存活，加入饲养细胞才能使其繁殖。u原因:u饲养细胞能释放某
21、些生长刺激因子u能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性u小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故应用较多。三、筛选阳性克隆与克隆化三、筛选阳性克隆与克隆化（1）筛选阳性克隆：u产生特定抗原的抗体产生细胞:占所有脾细胞的5%u微量、快速、特异、敏感、简便，并一次能检测大批标本的方法。检测方法：检测方法：免疫酶技术；免疫酶技术；免疫荧光技术；放射免疫技术；免疫荧光技术；放射免疫技术；FACSFACS2023-1-1350uELISA1、精制破伤风毒素抗原（）吸附（约10g/ml，4，3h）洗涤2、加杂交瘤培养上清液（）（4，1h）3、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（）（4，1h）洗涤洗涤4、加酶作用底物
22、，呈色孔为阳性克隆孔ELISAELISA用于破伤风抗体的筛选用于破伤风抗体的筛选2023-1-1352（2）克隆化有限稀释法和软琼脂法u应尽早克隆化:含不分泌细胞,多株分泌细胞,染色体易丢失u克隆化：单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。其中每个细胞的生物学特征和功能完全相同。u一般3次克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。u常用的克隆化方法有：有限稀释法、软琼脂法、流式细胞法。2023-1-1353有限稀释法：通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的：u杂交瘤细胞悬液稀释，加入到96孔细胞培养板，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。例：u取出阳性孔内的细胞进行计数；
23、用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞；如果在96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一个细胞；加入一定数量的饲养细胞，经过812天后，可观察到有集落生长的孔；据检测的阳性结果再次进行克隆化。2023-1-1354 软琼脂法：u培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶u细胞分裂后形成小球样团块，用毛细吸管将小球吸出u团块打碎后移入96孔板继续培养u可吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，所以该法容易成功。2023-1-1355 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定（一）杂交瘤细胞鉴定：u鼠脾细胞染色体数:40，端着丝粒;u小鼠骨髓瘤细胞染色体:SP2/0细胞为6268，NS-1为546
24、4，中部和亚中部着丝点;u杂交瘤细胞的染色体数目:亲本细胞数目总和，多数为端着丝粒，少数标志染色体;u染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；效价的抗体；uIg类型、亚类测定：双扩法或ELISA法u特异性测定：抗原类似物的交叉反应u效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 u表位测定：竞争抑制法u亲和性测定：测定亲和常数Ku杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法uMcAb靶抗原分子量：常用western blot（二）抗体性状鉴定五、单克隆抗体的制备五、单克隆抗体的制备（1）体外培养法：可获得10g/ml的抗体；多采用多采用RPMI 1640RPMI 16
25、40培养液，添加培养液，添加10%20%10%20%胎牛或小牛血清。胎牛或小牛血清。（2）动物体内诱生法：可获得520mg/ml的抗体。目前多采用2023-1-1358体内诱生法：u因为杂交瘤细胞的两种亲本细胞均来自BALB/c小鼠，所以应选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体。u可于注入细胞的几周前，预先将具有刺激性的有机溶剂降植烷（pristane）注入腹腔内，以破坏腹腔内膜，建立杂交瘤易于增殖的环境。u优点：操作简便，经济，所得单克隆抗体量较多且效价亦高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株2023-1-1359小结小结六、单克隆抗体的纯化六、单克隆抗体的纯化u动物体内
26、诱生法制备单克隆抗体具体纯化方法及过程1、澄清和沉淀处理u离心1000g5min：去除残留的小颗粒物质（小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等）；u0.2m的微孔滤膜过滤：除掉污染的细菌、支原体和脂质；u用饱和硫酸铵沉淀抗体：50%饱和硫酸铵能回收90%以上的单克隆抗体。2023-1-13621.名词解释：抗体；免疫球蛋白；多克隆抗体；单克隆抗体2.单克隆抗体有哪些不足？如何改造？3.大量制备单克隆抗体的方法主要有哪些？4.制备单克隆抗体的一般流程是什么？（如何制备杂交瘤细胞？）思考题思考题2023-1-1363第三节第三节 基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体(Genetic
27、engineering antibody)根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。目的：保留天然抗体的特异性和主要生物活性，去除或减少无关结构及鼠源单抗不足；赋予抗体分子新的生物活性。原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（V），同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区（C）。内内 容容1、人-鼠嵌合抗体（Chimeric Antibody）2、人源化改型抗体（Humanized Antibody）3、单链抗体4、单域抗体与分子识别单位5、双功能抗体6、抗体融合蛋白2023-1-1365基因工程抗体的类型
28、基因工程抗体的类型u人-鼠嵌合抗体u改型抗体（人源化抗体）uFabuFvu单链抗体u单域抗体u最小识别单位u抗体融合蛋白2023-1-1366单域抗体单域抗体最小识别单位最小识别单位单链抗体单链抗体小分子抗体Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L 链嵌合载体共转染细胞启动子人人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠嵌合抗体基因工程改造策略 构建嵌合抗体过程：鼠源单抗的可变区基因连到包含有人抗体恒定区基因并构建到表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细
29、胞人-鼠嵌合基因工程抗体鼠单克隆抗体V区的人源化 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。CDR移植:即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体人源化抗体（humanized antibody)。经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变 结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的28种治疗性单抗中多数是人源化抗体）人源化抗体的构建可用人源化抗体的构建可用全合成法全合成法
30、或或定点突变法定点突变法。全合成法全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDRCDR置换人抗体的置换人抗体的CDRCDR，将整个可变区序列的两条链分解成，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有合成所有DNADNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。建和表达改形抗体。定点突变法定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体
31、是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的的CDR CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的的可变区基因的CDRCDR序列变为鼠抗体的序列变为鼠抗体的CDRCDR序列，然后表序列，然后表达出改型抗体。达出改型抗体。研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDRCDR替换替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列（对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列（FRFR）进行操作。进行操作。单链抗体(sin
32、gle chain Fv,scFv)P154:由一段弹性连接肽（linker）把可变区重链（VH）与轻链（VL）相连而成，具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。u 连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，具有一定弹性和蛋白酶抗性，常用的连接肽是(GGGGS)3它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。Fv由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定,在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到单链抗体。u分子小，保持完整抗原结合位点，易进入组织；u易于进行分子改造，融合毒素、酶、药物等构成双功能抗体。u免疫原性低；u可在大肠杆菌中表达；u缺乏Fc段，不与非靶细胞（Fc受体阳性
33、细胞）结合，易进入组织，偶联成像可用于诊断；u体内半衰期短易从血循环中清除；u亲和力和稳定性较完成抗体低；u因只能与抗原结合，不能激活补体激活细胞免疫（CDC）及抗体依赖细胞毒效应（ADCC）。2023-1-1375单链抗体（ScFv）特点 单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因VH,VL，将二者连接成ScFv基因，再组装到适当的表达载体上。ScFv的基因构建 单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;二是分泌型表达，将细菌
34、的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。重组ScFv的表达双价及多价双价及多价ScFvScFv2023-1-1378连接肽（linker）较短时，同一ScFv分子内VH与VL不能相互配对，分子间的VH，VL功能区配对成一个二价的二聚体，也可构成三聚体或多聚体。抗体的VH、VL约为完整分子的1/12,只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。4、单域抗体和分子识别单位 分子识别单位：约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。即双特异性抗体(bis
35、pecific antibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。5 5、双（多）功能抗体、双（多）功能抗体 Hollinger等将抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后,VLA VHB与VHA VLB交叉连结,形成双特异性抗体。双功能抗体实例 能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂
36、解。与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。CatumaxomabCatumaxomab2023-1-1383多功能抗体多功能抗体 6 6、抗体融合蛋白、抗体融合蛋白u将抗体片段（V区或C区）连接到与抗体无关的其他蛋白上，创造出抗体相关分子，称为抗体融合蛋白（antibody fusion protein）。u分类：Fv抗体融合蛋白：抗体的Fv与其他生物活性蛋白结合，主要用于导向治疗领域。Fc抗体融合蛋白：抗体Fc段与某些有黏附或结合功能的蛋白质融合而获得的融合
37、蛋白。2023-1-1385Fv-Fv-抗体融合蛋白抗体融合蛋白u抗体与毒素、酶、细胞因子等生物活性分子融合达到特异杀伤肿瘤细胞目的。抗体与毒素偶联：绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒素（II期）；抗体与酶蛋白融合：也称为抗体酶（abenzyme），前体药物疗法（ADEPT）；抗体与细胞因子融合：IL-2，免疫介导疗法；2023-1-1386Fc-Fc-抗体融合蛋白抗体融合蛋白u具有与特定蛋白（ProteinA,ProteinG）结合的特点，便于检测与纯化；uFc介导的抗体效应功能，如：ADCC、CDC及免疫调理作用；u延长蛋白在血液中的半衰期；u实例：CD4-Fc;CTLA4-Fc;TNFaR-Fc;V
38、EGFR-Fc(VEGF-TRAP)2023-1-13872023-1-1388思考题思考题一、名词解释1、可变区 2、恒定区 3、互补决定区 4、功能区 5、人鼠嵌合抗体 6、改形抗体 7、Fab抗体 8、Fv抗体 9、单链抗体（scFv）10、单域抗体 11、双特异单链抗体（bisFvs）二、简答1、简述抗体的结构与功能、抗体多样性的遗传学基础。2、基因工程抗体有哪些类型？其特性有何不同？3、抗体融合蛋白有哪些类型，特征和设计策略是什么？试举例说明。4、多价抗体特点？2023-1-1389第四节 噬菌体抗体库技术抗体研究的抗体研究的三个阶段三个阶段：以以1890年年Behring发现白喉抗
39、毒素为代表，其特点是发现白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体；用抗原免疫动物来获得多克隆抗体；以以1975年年Khler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表；代表；以以1994年年Winter 以基因工程方法制备抗体为代表。以基因工程方法制备抗体为代表。抗体研究领域的一次技术革命，完全抗体研究领域的一次技术革命，完全用基因工程技术制备用基因工程技术制备人源化抗体，还能利用基因转移和表达技术，通过细菌发人源化抗体，还能利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体。酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体。在此基础在此基
40、础上发展成抗体工程。上发展成抗体工程。Winter创建了创建了（Repertoire of antibodies displayed on phages）技术）技术,克克服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血制备服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血制备，从而获得人源性基因工程抗体。，从而获得人源性基因工程抗体。用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因（获取目的基因）获取目的基因）克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面（载体构建载体构建）用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。（淘筛和鉴定）（淘筛和鉴定）使抗体基因以分泌的方式表达，筛选可溶性的抗体片段。
41、抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人一、基本原理和程序一、基本原理和程序噬菌体抗体库噬菌体表面展示文库技术的要点外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再
42、将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，1、获取目的基因、获取目的基因：提取：提取RNA，经，经RT-PCR获取抗体某一获取抗体某一特定基因区段。特定基因区段。2、抗体库技术的载体、抗体库技术的载体：普遍使用噬菌粒（：普遍使用噬菌粒（phagemid）载体。载体。3、淘筛（、淘筛（panning）：）：用固相化抗原对表达产物的载体用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量扩增。进行淘筛，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量扩增。4、表达与鉴定：、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌珠，进行可溶性表达，其产物用菌珠，进行可溶性表达，其产
43、物用Western blot 分析确分析确定后，就完成了全过程。定后，就完成了全过程。噬菌体抗体库技术的基本方法小结噬菌体抗体库技术的基本方法小结二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点 1 1、模拟天然全套抗体库、模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。2 2、避开了人工免疫和杂交瘤技术、避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于
44、抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。3 3、可获得高亲和力的人源抗体、可获得高亲和力的人源抗体 在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。第六节第六节 抗体治疗药物抗体治疗药物l自第一个抗体药物批准上市以来，已被成功用于治疗自第一个抗体药物批准上市以来，已被成功用于治疗肿瘤、自身免疫疾病等多种肿瘤、自身免疫疾病等多种“疑难杂症疑难杂症”，截止，截止2012年年6月，美国月，美国FDA批准批准28种抗
45、体药物，抗肿瘤占种抗体药物，抗肿瘤占53.8%，免疫性疾病：，免疫性疾病：19.2%、器官移植、器官移植11.5%、感染性疾、感染性疾病病7.7%、心血管疾病、心血管疾病3.8%、其他、其他3.8%。商业化的抗体药物商业化的抗体药物2023-1-131055个靶标的抗体仿制药开发是热点:CD20，HER2，EGFR,VEGF,TNF-alpha2023-1-13106VEGF TargetAnti-VEGF StrategyHER2 signaling pathway and Anti-HER2 Strategy108Combination strategies to potentiate c
46、ellular response and overcome resistanceNancy E.Hynes and Heidi A.Lane.ERBB receptors and cancer:the complexity of targeted inhibitors.Nat Rev Cancer.2005;5:341-354.2013年全球生物药品销售额年全球生物药品销售额前前10名名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1 Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai11.00RATNF2EnbrelAmgen8.76RA、
47、牛皮癣TNF3Remicade J&J8.37RA、CrohnsTNF4Lantus(insulin glargine)Sanofi7.95I/II型糖尿病/5RituxanBiogen-IDEC7.91Non-Hopkins LymphomaCD206Avastin Roche/Genentech6.97结肠癌，NSCLCVEGF7Herceptin Roche/Genentech6.91乳腺癌，胃癌HER28Neulasta Amgen4.39白细胞减少症/9Lucentis Roche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35贫血及癌症
48、化疗引起贫血/20132013年年1414个抗体药物销售过个抗体药物销售过1010亿美元亿美元2023-1-13110110.265.687.7683.867567.51抗体药物分类抗体药物分类u抗体或抗体片段（小分子抗体药物）u抗体融合蛋白u抗体偶联物或免疫偶联物2023-1-13111抗体与放射性同位素偶联抗体与放射性同位素偶联抗体与抗癌化学药物偶联抗体与抗癌化学药物偶联抗体与免疫毒素偶联抗体与免疫毒素偶联一、放射性同位素标记的抗体治疗药物 抗体作为放射性同位素的导向载体，体内应用较成功。-同位素标记抗体操作简便，用量小，可观测药物在体分布和药物动力学。-治疗起步阶段，人体研究较少。-初步
49、结果证明放射性同位素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。-同位素来源困难，防护和污染问题1、常用的抗癌药物常用的抗癌药物 氨甲喋呤氨甲喋呤(MTX)阿霉素阿霉素(ADM)丝裂霉素丝裂霉素(MMC)环磷酰胺环磷酰胺(CTX)新抑癌蛋白新抑癌蛋白(NCS)正定霉素正定霉素(DOX)-抗体药物偶联物提高体外细胞毒性，对化抗体药物偶联物提高体外细胞毒性，对化学疗法耐药的细胞株仍有效。学疗法耐药的细胞株仍有效。二、抗癌药物偶联的抗体药物抗体-药物偶联体由三个部分组成l靶向单克隆抗体单克隆抗体l稳定的连接子连接子l高活性小分子药物小分子药物抗体-药物偶联体是一类新型的肿瘤治疗药物l靶向治疗靶向治疗：结合单抗的靶
50、向作用和小分子药物的高活性，选择性杀伤肿瘤细胞，从而提高疗效、减少副作用l个体化治疗个体化治疗：诊断、治疗一体化l组合治疗组合治疗：内外兼攻，二石一鸟。有效的克服癌症治疗的病灶转移和抗药性难题Jaracz et al.Bioorg Med Chem.2005;13:5043-5054.Wu et al.Nat Biotechnol.2005;23:1137-1146.Ricart et al.Nat Clin Pract Oncol.2007;4:245-255.Junutula et al.Nat Biotechnol.2008;26:925-932.什么是抗体什么是抗体-药物偶联体（药物偶
