1、海藻酸钠降解菌株的筛选海藻酸钠降解菌株的筛选 指导教师：姚子昂指导教师：姚子昂 教授教授 答辩人：许媛丽答辩人：许媛丽 答辩内容答辩内容n研究背景研究背景n选题依据和意义选题依据和意义n实验材料实验材料n实验方法实验方法n分析讨论分析讨论n致谢致谢研究背景研究背景n海藻酸钠海藻酸钠-又名褐藻酸又名褐藻酸钠、褐藻胶，是一种来钠、褐藻胶，是一种来源于海洋褐藻的阴离子源于海洋褐藻的阴离子酸性多糖酸性多糖，是海带中提，是海带中提取的由取的由-L-1,4古罗糖古罗糖醛酸醛酸(G)及及-D-1,4甘露甘露糖醛酸糖醛酸(M)随机组合形成随机组合形成的线性高分子量聚合物，的线性高分子量聚合物，广泛应用于食品、
2、医药广泛应用于食品、医药等方面。等方面。研究背景研究背景n由于海藻酸钠具有凝胶性强，粘度大，水溶性由于海藻酸钠具有凝胶性强，粘度大，水溶性较差，不容易被吸收等特点，限制了海藻酸钠较差，不容易被吸收等特点，限制了海藻酸钠许多其他方面的应用，所以具有多种生理活性许多其他方面的应用，所以具有多种生理活性的褐藻胶多糖降解产物的褐藻胶多糖降解产物-褐藻胶寡糖褐藻胶寡糖(Alginate Oligosaccharides，AOS)逐渐进逐渐进入人们的视野。入人们的视野。研究背景研究背景n褐藻胶寡糖是一类新型生物制剂，褐藻胶寡糖是一类新型生物制剂，具有可自具有可自然降解、不污染环境和无残留等优点。近年来，然
3、降解、不污染环境和无残留等优点。近年来，通过对褐藻胶寡糖生物活性的研究发现：褐藻通过对褐藻胶寡糖生物活性的研究发现：褐藻胶寡糖具有整肠和解毒、降血糖血脂、抗凝血、胶寡糖具有整肠和解毒、降血糖血脂、抗凝血、抗炎、免疫调节等作用。抗炎、免疫调节等作用。n因此通过各种降解方法制备的褐藻胶寡糖在糖因此通过各种降解方法制备的褐藻胶寡糖在糖化学、糖生物学、糖工程及糖类药物研究领域化学、糖生物学、糖工程及糖类药物研究领域具重要的研究价值。具重要的研究价值。选题依据和意义选题依据和意义n目前褐藻胶寡糖的获取方法主要应用酶解法，目前褐藻胶寡糖的获取方法主要应用酶解法，它是一种条件温和、它是一种条件温和、可控性强
4、和特异性高的可控性强和特异性高的生物降解方法生物降解方法,在寡糖制备各方面明显优于化在寡糖制备各方面明显优于化学和物理降解。学和物理降解。选题依据和意义选题依据和意义n本实验利用微生物作用于海藻酸钠得到降解酶本实验利用微生物作用于海藻酸钠得到降解酶并最终获得寡糖，通过诱导筛选出产酶量高、并最终获得寡糖，通过诱导筛选出产酶量高、酶活性强的优势菌株，测定其生长曲线和酶活酶活性强的优势菌株，测定其生长曲线和酶活曲线曲线,对其发酵条件进行优化研究。为大规模对其发酵条件进行优化研究。为大规模生产海藻酸钠裂解酶奠定理论基础，对海藻胶生产海藻酸钠裂解酶奠定理论基础，对海藻胶寡糖的应用具有推动作用，并且对进一
5、步研究寡糖的应用具有推动作用，并且对进一步研究海洋寡糖提供研究方向。海洋寡糖提供研究方向。实验材料实验材料n腐烂的海带，取自大连开发区海贝广场海域腐烂的海带，取自大连开发区海贝广场海域实验方法实验方法一一.筛选菌株筛选菌株n1样品的处理样品的处理 用无菌生理盐水系列稀释海带样品，取合适浓度用无菌生理盐水系列稀释海带样品，取合适浓度涂布，涂布，30，恒温培养，恒温培养72 h。n2初筛初筛 以海藻酸钠作为唯一碳源分离和筛选海藻酸钠降以海藻酸钠作为唯一碳源分离和筛选海藻酸钠降解菌，解菌，30 恒温培养恒温培养72h。n3复筛复筛 将初筛得到菌株先接到斜面培养基活化，再挑取将初筛得到菌株先接到斜面培
6、养基活化，再挑取2环接入复筛培养基中环接入复筛培养基中30，150 r/min，培养，培养24 h，再进行测定。，再进行测定。二二.测定高产菌株生长曲线和酶活曲线测定高产菌株生长曲线和酶活曲线n1.生长曲线测定生长曲线测定 每隔每隔3h从种子液中取样按比浊法测定种子液的生从种子液中取样按比浊法测定种子液的生物量（以物量（以OD540 nm表示）。表示）。n2.酶活曲线测定酶活曲线测定 采用采用DNS法，法，1ml粗酶液和粗酶液和1ml海藻酸钠底物海藻酸钠底物40反应反应30min，加入，加入2mlDNS沸水浴沸水浴3min，冷，冷却，测却，测540nm处处OD值。值。实验方法实验方法n三三.产
7、酶条件的研究产酶条件的研究n1.碳源种类碳源种类 发酵培养基分别以琼胶、淀粉、海藻酸钠和卡拉胶作为唯发酵培养基分别以琼胶、淀粉、海藻酸钠和卡拉胶作为唯一碳源，浓度为一碳源，浓度为0.2%，其他物质含量不变。，其他物质含量不变。n2.碳源浓度碳源浓度 在发酵培养基中分别添加浓度为在发酵培养基中分别添加浓度为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的海藻酸钠，其他物质含量不变。的海藻酸钠，其他物质含量不变。n3.氯化钠浓度氯化钠浓度 在发酵培养基中分别添加浓度为在发酵培养基中分别添加浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和和2.5%的氯化钠，接其他物质含量不变的氯化钠，接其他物质含量
8、不变。实验方法实验方法n4.pH 在发酵培养基中，分别按在发酵培养基中，分别按6.0、6.4、6.8、7.2、7.6调节培养基的调节培养基的pH，接其他物质含量接其他物质含量不变不变。n5.蛋白胨浓度蛋白胨浓度 在发酵培养基中分别添加浓度为在发酵培养基中分别添加浓度为0.1%、0.3%、0.5%和和0.7%的蛋白胨，接其他物质含量不变的蛋白胨，接其他物质含量不变。实验结果实验结果-菌株筛选菌株筛选n本实验本实验初筛后分离得到初筛后分离得到10多株能够产海藻胶裂解酶的多株能够产海藻胶裂解酶的细菌，通过比较菌落周围透明圈细菌，通过比较菌落周围透明圈与菌落的直径比值以与菌落的直径比值以及透明圈的透明
9、度，选择菌株及透明圈的透明度，选择菌株11为后期的实验菌。为后期的实验菌。实验结果实验结果-生长曲线和酶活曲线生长曲线和酶活曲线n由图可以看出，菌株由图可以看出，菌株11在在3 h后开始进入对数生长期，后开始进入对数生长期，并于并于30 h达到最大生物量。随后，随培养时间延长，达到最大生物量。随后，随培养时间延长，该菌很快开始衰亡。该菌很快开始衰亡。实验结果实验结果-生长曲线和酶活曲线生长曲线和酶活曲线n由图由图4可以看出，菌株可以看出，菌株11的酶活曲线在开时的酶活曲线在开时3h后呈增后呈增长趋势，并在长趋势，并在27h达到最大活性，随后，随培养时间达到最大活性，随后，随培养时间延长，酶的活
10、力开始降低。延长，酶的活力开始降低。n菌株菌株11的酶活曲线与生长曲线基本吻合，即菌株的酶活曲线与生长曲线基本吻合，即菌株11生长和产酶基本一致。生长和产酶基本一致。实验结果实验结果-碳源种类对菌株产酶影响碳源种类对菌株产酶影响n由图可以看出由图可以看出,分别以相同浓度的琼胶、卡拉胶、海分别以相同浓度的琼胶、卡拉胶、海藻酸钠和淀粉作为发酵培养的唯一碳源时，菌株藻酸钠和淀粉作为发酵培养的唯一碳源时，菌株11在在以海藻酸钠为唯一碳源时产酶活力高于其他，表明菌以海藻酸钠为唯一碳源时产酶活力高于其他，表明菌株株11所产的海藻胶酶为诱导酶。所产的海藻胶酶为诱导酶。实验结果实验结果-碳源浓度碳源浓度对菌株
11、产酶影响对菌株产酶影响n由图可以看出，在培养基中海藻酸钠浓度为由图可以看出，在培养基中海藻酸钠浓度为0.7时，时，菌株菌株11的产酶活力最高，因此选择海藻酸钠浓度为的产酶活力最高，因此选择海藻酸钠浓度为0.7的培养基为最适培养基。的培养基为最适培养基。实验结果实验结果-氯化钠浓度对菌株产酶影响氯化钠浓度对菌株产酶影响n由图可以看出，在培养基中氯化钠浓度为由图可以看出，在培养基中氯化钠浓度为2.5时，时，菌株菌株11的产酶活力较高于其他浓度，因此选择氯化钠的产酶活力较高于其他浓度，因此选择氯化钠浓度为浓度为2.5的培养基为最适培养基。的培养基为最适培养基。实验结果实验结果-pH对菌株产酶影响对菌
12、株产酶影响n由图可以看出，在培养基中的由图可以看出，在培养基中的pH为为7.2时，菌株时，菌株11的产酶活力明显高于其他的产酶活力明显高于其他pH，因此选择，因此选择pH7.2为最适为最适pH。实验结果实验结果-蛋白胨浓度对菌株产酶影响蛋白胨浓度对菌株产酶影响n由图可以看出，在培养基中蛋白胨浓度为由图可以看出，在培养基中蛋白胨浓度为0.3时，时，菌株菌株11的产酶活力最高，因此选择蛋白胨浓度的产酶活力最高，因此选择蛋白胨浓度0.3的培养基为最适培养基。的培养基为最适培养基。讨论分析讨论分析n1.从腐烂的海带上筛选出从腐烂的海带上筛选出得到得到10多株能够产海多株能够产海藻胶裂解酶的细菌，通过比
13、较菌落周围透明圈藻胶裂解酶的细菌，通过比较菌落周围透明圈与菌落的直径比值以及透明圈的透明度，与菌落的直径比值以及透明圈的透明度，选择选择菌株菌株11为后期实验的出发菌株。为后期实验的出发菌株。n2.从生长曲线和酶活曲线可看出，菌株从生长曲线和酶活曲线可看出，菌株11 生生长和产酶活动基本一致。长和产酶活动基本一致。n3.通过对碳源种类、碳源浓度、氯化钠浓度、通过对碳源种类、碳源浓度、氯化钠浓度、pH、蛋白胨浓度等因素对菌株、蛋白胨浓度等因素对菌株11产酶的影响产酶的影响的分析，初步得产酶的最佳培养条件为：碳源的分析，初步得产酶的最佳培养条件为：碳源为海藻酸钠为海藻酸钠0.7%，氮源为蛋白胨，氮
14、源为蛋白胨0.3%，NaCl 2.5%，PH7.2。致谢致谢n本论文是在姚子昂老师和吴海歌老师的悉心指本论文是在姚子昂老师和吴海歌老师的悉心指导下完成的。他们以敏锐的学术思想、从课题导下完成的。他们以敏锐的学术思想、从课题的选题、实验设计到论文撰写过程都给予正确的选题、实验设计到论文撰写过程都给予正确的引导和帮助。感谢高凤山老师对我论文的评的引导和帮助。感谢高凤山老师对我论文的评阅。在论文完成过程中，我得到了张玉娟、何阅。在论文完成过程中，我得到了张玉娟、何宇、高征等师兄师姐的帮助和指导，在此对他宇、高征等师兄师姐的帮助和指导，在此对他们表达真挚的感谢。们表达真挚的感谢。n最后，感谢四年的大学生活，感谢学院所有老最后，感谢四年的大学生活，感谢学院所有老师四年来对于我的关心和爱护。师四年来对于我的关心和爱护。
