1、干扰素干扰素药学院药学院张倩倩张倩倩1interferon(IFN)病毒感染后的机体反应病毒感染后的机体反应干扰素及白介素干扰素及白介素自然杀伤细胞自然杀伤细胞T细胞免疫细胞免疫非特异性免疫非特异性免疫特异性免疫特异性免疫 一一 干扰素的概念干扰素的概念二二 干扰素的种类干扰素的种类 三三 干扰素的作用干扰素的作用 四四 干扰素抗病毒机理干扰素抗病毒机理五五 生物学活性生物学活性 一一 干扰素的概念干扰素的概念概念：概念：干扰素（干扰素（IFNIFN）是一种细胞因子，它是机体感染是一种细胞因子，它是机体感染病毒病毒时，宿主细胞通过抗病毒反应，而产生的一时，宿主细胞通过抗病毒反应，而产生的一组结
2、构类似，功能相近的低分子组结构类似，功能相近的低分子糖蛋白糖蛋白。二二 干扰素的种类干扰素的种类细胞来源细胞来源诱生剂诱生剂型型IFNIFN白细胞白细胞病毒病毒IFNIFN成纤维细胞成纤维细胞型型IFNIFN淋巴细胞淋巴细胞 NKNK细胞细胞抗原抗原 三三 干扰素的作用干扰素的作用一、一、型干扰素型干扰素（1）抗病毒和抗肿瘤）抗病毒和抗肿瘤 1）诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒复制；）诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒复制；2）增强）增强NK细胞对病毒感染细胞和肿瘤细胞杀伤；细胞对病毒感染细胞和肿瘤细胞杀伤；3）促进）促进MHC-类分子表达，增强类分子表达，增强CTL对病毒感染对病毒感染
3、 细胞和肿瘤等靶细胞的杀伤。细胞和肿瘤等靶细胞的杀伤。（2）免疫调节）免疫调节（较弱）（较弱）：与与型干扰素类似。型干扰素类似。三三 干扰素的作用干扰素的作用二、二、型干扰素型干扰素（1）主要起免疫调节作用）主要起免疫调节作用 1）活化巨噬细胞；）活化巨噬细胞；2）促进）促进APC(s)表达表达MHC-类分子，提高抗原递呈能力；类分子，提高抗原递呈能力；3）促进）促进MHC-类分子表达和增强类分子表达和增强CTL细胞的杀伤活性细胞的杀伤活性;4）增强）增强NK细胞的杀伤活性；细胞的杀伤活性；5）促进）促进B细胞分化、增殖；细胞分化、增殖；（2）抗病毒和抗肿瘤作用）抗病毒和抗肿瘤作用(与与型干扰
4、素类似型干扰素类似，次要，次要)。T细胞细胞巨噬细胞巨噬细胞B 细胞细胞粒细胞粒细胞IFNNK 细胞细胞内皮细胞内皮细胞T 细胞细胞lNK 细胞细胞激活激活提高提高NK细胞活性细胞活性1.抗病毒活性抗病毒活性2.抑制细胞分裂抑制细胞分裂3.抑制血细胞生成抑制血细胞生成4.促进促进MHC和和 MHC 分子表达分子表达多种细胞多种细胞干扰素的作用干扰素的作用 四四 干扰素抗病毒机理干扰素抗病毒机理l最初感染的细胞由于最初感染的细胞由于病毒核酸剌激被诱导产生干病毒核酸剌激被诱导产生干扰素扰素，它透过细胞膜向外扩散并进入血液循环进，它透过细胞膜向外扩散并进入血液循环进入其它细胞。入其它细胞。l干扰素不
5、能直接阻止病毒吸附、穿入或释放，而干扰素不能直接阻止病毒吸附、穿入或释放，而是作用于宿主细胞，使其是作用于宿主细胞，使其产生抗病毒蛋白质产生抗病毒蛋白质，附，附着于细胞的核蛋白体上，选择性地抑制病毒着于细胞的核蛋白体上，选择性地抑制病毒mRNAmRNA翻译为病毒蛋白质，从而影响病毒结构蛋白和酶翻译为病毒蛋白质，从而影响病毒结构蛋白和酶类的合成，使复制受到阻类的合成，使复制受到阻碍碍而呈现抗病毒的作用而呈现抗病毒的作用。四四 干扰素抗病毒机理干扰素抗病毒机理l干扰素具有干扰素具有广谱抗病毒作用广谱抗病毒作用，又具有，又具有细胞种属特细胞种属特征征。即某一种动物产生的干扰素只能保护同种属。即某一种
6、动物产生的干扰素只能保护同种属或近缘种属动物细胞。或近缘种属动物细胞。l干扰素是一种活性很强的生物制剂干扰素是一种活性很强的生物制剂，既能既能治疗病治疗病毒性疾病毒性疾病，又又具有具有抗肿瘤和调节免疫机能抗肿瘤和调节免疫机能的作用的作用。四四 干扰素抗病毒机理干扰素抗病毒机理干扰素抗病毒作用干扰素抗病毒作用作用机理作用机理不是直接杀灭病毒不是直接杀灭病毒 IFN 抗病毒蛋白基因抗病毒蛋白基因 抗病毒蛋白抗病毒蛋白 (蛋白激酶蛋白激酶,磷酸二脂酶磷酸二脂酶)降解病毒降解病毒mRNA 抑制病毒蛋白合成抑制病毒蛋白合成 抑制病毒组装、释放抑制病毒组装、释放 抑制病毒复制抑制病毒复制 中断病毒感染；限
7、制病毒扩散中断病毒感染；限制病毒扩散 五五 生物学活性生物学活性:广谱的抗病毒作用，一种广谱的抗病毒作用，一种IFN可以抑制多可以抑制多种病毒；种病毒；抑制病毒感染、阻止病毒在体内扩散、促抑制病毒感染、阻止病毒在体内扩散、促进痊愈进痊愈;调节免疫功能；调节免疫功能；抑制肿瘤细胞生长；抑制肿瘤细胞生长；IFN作用特点作用特点:产生的时间早；产生的时间早；中断受染细胞的病毒感染，限制病毒扩散；中断受染细胞的病毒感染，限制病毒扩散；IFN诱导的抗病毒蛋白，只对病毒起作用，诱导的抗病毒蛋白，只对病毒起作用，不影响宿主细胞蛋白质合成。不影响宿主细胞蛋白质合成。专题二专题二 抗体制药抗体制药l第一节 概述
8、l第二节 单克隆抗体l第三节 基因工程抗体l第四节 噬菌体抗体工程l第五节 抗体诊断试剂和抗体药物19第一节第一节 概述概述 1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、球蛋白，并证明抗体活性主要存在于球蛋白组分。20抗体工程药物的概念抗体工程药物的概念通过细胞工程或基因工程方法制备，用于治疗的单克隆抗体、抗体片段、基因工程改造的抗体，以及抗体免疫偶联物或抗体融合蛋白,称为抗体工程药物。又称抗体药物、单克隆抗体治疗剂、抗体治疗剂。l抗 原(antigen,Ag)-是指那些能够刺激和是指那些能够刺激
9、和/或诱导机体免疫系或诱导机体免疫系统发生免疫应答、产生抗体和统发生免疫应答、产生抗体和/或致敏（效或致敏（效应）淋巴细胞，同时又能与免疫应答产物应）淋巴细胞，同时又能与免疫应答产物在体内外特异性结合，发生免疫反应的物在体内外特异性结合，发生免疫反应的物质。质。如：病原微生物、免疫血清、药物、疫苗如：病原微生物、免疫血清、药物、疫苗l对机体来说，抗原相当于一个国家已知的对机体来说，抗原相当于一个国家已知的或潜在的、外部的或内部的或潜在的、外部的或内部的“敌人敌人”。23l免疫原性：指能刺激机体产生抗体和/或致 敏淋巴细胞的性能。l反应原性：能与相应的抗体和/或淋巴细胞 发生特异性结合，发生反应
10、的性能。24l完全抗原：既具有免疫原性，又具有反应原性的抗原。如微生物、异种血清l半抗原：又称不完全抗原。是指其本身只有反应原性，但没有免疫原性的简单小分子的抗原物质。如某些药物（青霉素等）、多糖、类脂。25 目前，在中草药中发现广泛存在半抗原，如小檗碱、茶碱、丹参酮等，具有生化活性基因的化学成分都有可能成为半抗原，这些半抗原可与体内蛋白质结合成完全抗原，造成一些过敏反应。26l抗原的特异性既表现在免疫原性上，也表现在反应原性上。沙门氏杆菌沙门氏杆菌大肠杆菌大肠杆菌抗大肠杆菌的抗体抗大肠杆菌的抗体抗沙门氏杆菌的抗体抗沙门氏杆菌的抗体结合结合结合结合27抗体抗体：能与相应抗原特异性结合的具有能与
11、相应抗原特异性结合的具有 免疫功能的球蛋白免疫功能的球蛋白。抗体的产生过程：抗体的产生过程：机体免疫系统受抗原物质机体免疫系统受抗原物质刺激后，刺激后，B B淋巴细胞淋巴细胞被激被激活，增殖和分化为浆细活，增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。泌的球蛋白。免疫球蛋白免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)(immunoglobulin,Ig)分子量范围从分子量范围从150,000150,000到到950,000950,000道尔顿。道尔顿。IgGIgG在血清中含量最高，达在血清中含量最高，达7575 80%,80%,是抗感染是抗感染 的主要抗体的主要抗体;
12、IgMIgM是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为 五聚体五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的是对一个抗原作出反应时产生的 ；IgAIgA在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参 与局部的免疫反应与局部的免疫反应;IgDIgD在血清中含量很低在血清中含量很低;IgEIgE在血清含量最少。在血清含量最少。动物血清中产生抗体的时间示意图动物血清中产生抗体的时间示意图抗原刺激的第一至三周，IgM生成；抗原再刺激后，Ig将取代IgM抗体研究的发展阶段：抗体研究的发展阶段：以以18901890年年BehringBehring发现发现为代表为代表,
13、用抗原用抗原免疫动物来获得免疫动物来获得多克隆抗体多克隆抗体。以以19751975年年Milstein&KohlerMilstein&Kohler创建创建制制备备单克隆抗体单克隆抗体(McAb)(McAb)为代表。为代表。以以19941994年年Winter,Winter,创建了创建了噬菌体抗体库噬菌体抗体库(repertoire of antibodies displayed on(repertoire of antibodies displayed on phages)phages)技术技术,以基因工程方法制备抗体为代表。以基因工程方法制备抗体为代表。在此基础上发展成抗体工程。在此基础上发
14、展成抗体工程。多克隆抗体多克隆抗体:一种抗原一种抗原具有具有多个多个抗原决定簇抗原决定簇,每个每个抗原决定簇都能刺激抗原决定簇都能刺激B B细胞产生一种细胞产生一种抗体。这样所获得的免疫血清是多种抗体抗体。这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。的混和物。单克隆抗体单克隆抗体(Monoclonal antibodyMonoclonal antibody McAb):McAb):由由一个一个抗原决定簇抗原决定簇刺激的、刺激的、单一单一的的B B细细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高高度均一度均一的抗体。的抗体。1 234多克隆抗体和单克隆抗体多克隆抗体和单克隆
15、抗体Pure single AbAfter immunization,the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies.Each B cell produces only one kind of antibody,which binds to its specific antigen.Conventional antiserum is the mixture of all antibodies producedby B cells from spleen.If a single B cell was picked u
16、p and cultured,then it will produce only one kind of antibody.But B cell can not survive well in the culture.Each hybridoma line can produce pure single antibody,called monoclonal antibody.If B cell is fused with myeloma,the fused cell might be cultured and produce antibody.Adapted from Milstein(198
17、0)Scientific American,Oct.p.581234mmmm12341234MonoclonalantibodiesCell fusionSpleen cells+MyelomaxAntiseumAntigenImmunizationA mixture of all Ab1 234BALB/c12341 234B cellPure single AbAfter immunization,the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies.Each B cell produces only one kin
18、d of antibody,which binds to its specific antigen.Conventional antiserum is the mixture of all antibodies producedby B cells from spleen.If a single B cell was picked up and cultured,then it will produce only one kind of antibody.But B cell can not survive well in the culture.Each hybridoma line can
19、 produce pure single antibody,called monoclonal antibody.If B cell is fused with myeloma,the fused cell might be cultured and produce antibody.Adapted from Milstein(1980)Scientific American,Oct.p.581234mmmm12341234MonoclonalantibodiesCell fusionSpleen cells+MyelomaxAntiseumAntigenImmunizationA mixtu
20、re of all Ab1 234BALB/c12341 234B celll用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记 单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。l单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用35l基因工程技术为解决这两个问题提供了可能。l1984年：人-鼠嵌合抗体l1984年至今：单克隆抗体
21、的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。l已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3，而且消除了鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。36第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体 McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细
22、胞系而产化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。称为单克隆抗体。注射抗原注射抗原 B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群 体外培养体外培养（注射到小鼠腹腔）（注射到小鼠腹腔）体内培养体内培养单克隆抗体单克隆抗体传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体
23、混合混合1 234BALB/c12341 234多克隆抗体制备过程多克隆抗体制备过程1234mmmm12341234单单抗抗细细胞融合胞融合取出脾細胞取出脾細胞+癌細胞癌細胞各抗各抗体体分分开开单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 1、抗原与动物免疫、抗原与动物免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫动物：免疫动物：BALB/cBALB/c小鼠或小鼠或LouLou大鼠大鼠免疫方法：体内免疫和体外免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫2 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本方法：取适量脾细胞（基本方法：取适量脾细胞（1*108）与骨髓瘤）
24、与骨髓瘤细胞（细胞（2*1073*107）进行混合，在）进行混合，在PEG作用作用下诱导它们融合，时间控制在下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然以内，然后用培养液将后用培养液将PEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释 用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。能力强且长期稳定等特点。PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常
25、用浓度为度为40%50%，相对分子质量，相对分子质量4000为佳。相对分子为佳。相对分子质量在质量在4006000，浓度在，浓度在10%60%范围内的范围内的PEG都都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG 溶液溶液中加入中加入DMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。合率。但必须严格限制接触时间。（1 1）细胞融合液中的细胞类型：）细胞融合液中的细胞类型：4 4或或5 5种。种。（2 2）如何去除脾）如何去除脾-瘤以外的融和细胞？瘤以外的融和细胞？HAT培养基：培养基：H（Hypoxanthi
26、ne）:次黄嘌呤次黄嘌呤A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断断DNA合成主要途径合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成供细胞通过替代途径合成DNAHATHAT选择作用：选择作用：淋巴细胞：淋巴细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；DNADNA合成合成的主要途径被的主要途径被A A阻断阻断骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；HGPRTHGPRT缺乏，缺乏，DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻杂交瘤细胞：杂交瘤
27、细胞：长期生长繁殖；利用淋巴细胞长期生长繁殖；利用淋巴细胞的的HGPRTHGPRT，将，将H H合成为嘌呤碱并最终与合成为嘌呤碱并最终与T T一起合一起合成成DNADNA3 3、筛选阳性克隆与克隆化、筛选阳性克隆与克隆化 常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到瘤细胞悬液稀释后，加入到9696孔板孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用次克隆化时也要应用HTHT培养液，以后的克隆化可用培养液，以后的克隆化可用不含不含HTHT的的RPMI
28、1640RPMI 1640培养液。培养液。软琼脂法：在培养液中加入软琼脂法：在培养液中加入0.5%0.5%的琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入状态，可用吸管吸出，移入9696孔板培养。孔板培养。培培 养养 板板（1 1）免疫酶技术）免疫酶技术l原理：将原理：将抗原和抗体抗原和抗体的免疫反应和的免疫反应和酶的催化反应酶的催化反应相结合的技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改相结合的技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响
29、酶本身的酶学活性，在相应而合适的作用底物参酶本身的酶学活性，在相应而合适的作用底物参与下，使与下，使基质水解而呈色基质水解而呈色，或使供氢体由，或使供氢体由无色的无色的还原型还原型变为变为有色的氧化型有色的氧化型，从而表明某种抗原或，从而表明某种抗原或抗体的存在。抗体的存在。（2 2）免疫荧光技术）免疫荧光技术 原理：原理：将将抗原抗体抗原抗体反应的特异性和敏感性与反应的特异性和敏感性与显微示踪显微示踪的精确性相结合。以的精确性相结合。以荧光素荧光素作为标记物，与已作为标记物，与已知的抗体（或抗原）结合，然后将荧光素标记知的抗体（或抗原）结合，然后将荧光素标记的抗体或抗原作为标准试剂，用于检测
30、和鉴定的抗体或抗原作为标准试剂，用于检测和鉴定抗原或抗体抗原或抗体。免疫荧光技术免疫荧光技术用于细胞抗原的抗体检测用于细胞抗原的抗体检测,特别是特别是检测患者活检组织标本。检测患者活检组织标本。（3 3）放射免疫技术）放射免疫技术l原理：将原理：将同位素同位素分析的高灵敏度与分析的高灵敏度与抗原抗抗原抗体体反应的特异性相结合，以反应的特异性相结合，以放射性同位素放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。作为示踪物的标记免疫测定方法。l放射免疫测定原理示意图放射免疫测定原理示意图4 4、单抗检测、单抗检测RIARIA（放射免疫测定）（放射免疫测定）ELISAELISA（酶联免疫吸附试验）（酶联免
31、疫吸附试验）FACSFACS（流式细胞仪）（流式细胞仪）IFAIFA（间接免疫荧光法）（间接免疫荧光法）酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法(ELISA)l原理：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，原理：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，再将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固再将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度颜色及其吸
32、光度(A)(A)值的大小进行定性或定量分析值的大小进行定性或定量分析的方法。的方法。ELISA配制方案：配制方案：杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（1 15 5）x10 x106 6/ml)+/ml)+细胞冻存液细胞冻存液(30%(30%40%40%牛血清，牛血清，50%50%60%RPMI-164060%RPMI-1640培养液，培养液，10%DMSO)10%DMSO)“慢冻慢冻”：分步冷冻，分步冷冻，30-7030-70液氮液氮“快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中，使其迅速融化、水浴中，使其迅速融化、复苏复苏5 5、杂交瘤细胞的冻存与复苏、杂交瘤细胞的冻存与复苏细胞冷冻的意义
33、：细胞冷冻的意义：防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防止细胞密度过高而死亡 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。交瘤细胞株制备单克隆抗体。6 6、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大
34、量制备可获得可获得10g/ml的抗体。多采用的抗体。多采用RPMI 1640培养液，培养液，添加添加10%20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达血清成分，总蛋白量可达100g/ml以上，给纯化带来以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。悬浮培养法。无血清培养法无血清培养法：利用
35、白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。产量不高。悬浮培养法悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可：连续悬浮培养的细胞密度可2*107/ml,收收集的单克隆抗体可达集的单克隆抗体可达400 g/ml。如在培养液中加入微。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达载体，细胞密度可达108。（1）体外培养法：）体外培养法：基本程序：接种前基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注射周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*
36、106杂杂交瘤细胞，交瘤细胞，712d便有腹水生成，待生成腹水后再提便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。纯化带来难度。（2）动物体内诱生法）动物体内诱生法可获得可获得10m/ml的抗体。常用方法的抗体。常用方法。
37、腹腔注射法腹腔注射法7 7、单克隆抗体的纯化、单克隆抗体的纯化根据根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法：的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法：体外诊断试剂体外诊断试剂IgG类类-沉淀处理沉淀处理+亲和层析亲和层析 IgM类类-沉淀处理沉淀处理+凝胶过滤凝胶过滤体内诊断试剂或治疗用药体内诊断试剂或治疗用药-亲和层析亲和层析+阴离子交换阴离子交换层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。盐析沉淀盐析沉淀亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析 McAbMcAb的纯化的纯化 8 8、单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的性质鉴定IgIg类型、亚类测
38、定：类型、亚类测定：双扩法或双扩法或ELISAELISA法法特异性测定：特异性测定：抗原类似物的交叉反应抗原类似物的交叉反应效价测定：效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的几株单抗是否为不同表位特异的,用竞用竞 争抑制争抑制法，相加指数法及微机集群分析法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：亲和性测定：测定亲和常数测定亲和常数K K杂交瘤细胞染色体：杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠秋水仙素裂解法，小鼠B B细胞染色体细胞染色体4040条，条，SP2/0SP2/0细胞细胞6868条，杂交瘤细胞一般条，杂交瘤细胞一般10
39、0100多条多条McAbMcAb靶抗原分子量：靶抗原分子量：常用常用western blotwestern blot单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性高度特异性高度特异性高度的均一性和可重复性高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性对环境敏感性A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有在人体内的半衰期只有56h，维持有效药物作，维持有效药物作用靶组织时间；用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难、完整的抗体
40、分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：A、降低、降低McAb的免疫源性；的免疫源性；B、降低、降低McAb的相对分子质量的相对分子质量需要解决的问题：需要解决的问题：解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的识别单位等多种类型，基本上消除了
41、抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的整抗体分子的1/801/3。优点优点 ：在体外在体外“永久永久”地存活并传代地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗单克隆抗体的优点与局限性单克隆抗体的优点与局限性局限性局限性 ：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不
42、如多克隆抗体反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高制备技术复杂、费时费工、价格较高中国人源基因工程抗体研究获重大成果 中国预防医科院病毒所青年科学家中国预防医科院病毒所青年科学家梁米芳梁米芳研究研究员率领的课题组，在员率领的课题组，在“治疗用人源基因工程抗体基治疗用人源基因工程抗体基础与应用研究础与应用研究”中取得多项重要成果。在中取得多项重要成果。在世界上首世界上首先研制成功抗坦病毒、抗甲肝病毒、抗狂犬病毒先研制成功抗坦病毒、抗甲肝病毒、抗狂犬病毒人人源基因工程抗体源基因工程抗体，并获得拥有自主知识产权的全抗，并获得拥有自主知识产权的全抗体表达载体系统。体表达载体系统。与血源
43、制品比较，此抗体具有抗体含量高、无与血源制品比较，此抗体具有抗体含量高、无免疫源性、无污染源、可连续规模生产等优势，免疫源性、无污染源、可连续规模生产等优势，是是一类新兴的特异性抗病毒感染的生物工程药物一类新兴的特异性抗病毒感染的生物工程药物。此。此成果为我国防治病毒性疾病探索出一条新的途经，成果为我国防治病毒性疾病探索出一条新的途经，具有良好的应用开发前景。具有良好的应用开发前景。-2004原液保存原液保存 细菌疫苗细菌疫苗工艺流程示意图工艺流程示意图菌种筛选菌种筛选种子批的种子批的建立及检定建立及检定菌种接种菌种接种原液合并原液合并半成品半成品 配置配置杀菌杀菌原液收获原液收获扩大培养扩大
44、培养分装分装包装包装检定检定中国疫苗研究：中国疫苗研究：病毒原病毒原液保存液保存 病毒疫苗病毒疫苗工艺流程工艺流程毒种筛选毒种筛选种子批的种子批的建立及检定建立及检定 毒种接种毒种接种#培养细胞培养细胞原液合并原液合并 半成品半成品 配置配置病毒灭活病毒灭活病毒的收病毒的收获过滤获过滤扩大细扩大细胞培养胞培养分装分装包装包装检定检定 原代细胞的原代细胞的 制备或传代制备或传代细胞复苏细胞复苏减毒活疫苗减毒活疫苗第三节第三节 基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体(Genetic engineering antibody)指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、指用基因工程方法，对抗体
45、的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表达，获得抗体。达，获得抗体。将小鼠将小鼠IgIg基因敲除，转染人基因敲除，转染人IgIg基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人AbAb，再经杂交瘤技术，产生，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体大量完全人源化抗体一、人源化抗体一、人源化抗体鼠源性单克隆抗体的改造目的和原理鼠源性单克隆抗体的改造目的和原理目的：一是降低免疫源性；目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，增加组织通透性二是降低相对分子量，增加组织通透性 原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子原理：抗体同抗原结合的功能决定
46、于抗体分子的可变区（的可变区（V V），同种性免疫源性则决定于抗体），同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区（分子的稳定区（C C）。在基因水平上把鼠源性单）。在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的克隆抗体的H H和和L L链的链的V V区基因分离出来，分别与区基因分离出来，分别与人人IgIg的的H H链和链和L L链的链的C C区基因连接，即成为人区基因连接，即成为人鼠鼠嵌合抗体的嵌合抗体的H H和和L L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的嵌合抗体就能表达出完整的嵌合抗体.人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的
47、恒定区融合而得到的抗体。恒定区融合而得到的抗体。方法：方法：将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增如启动子、增强子、选择标记等强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、如骨髓瘤细胞、CHOCHO细胞细胞)中表达。中表达。特点：特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力（一）嵌合抗体（一）嵌合抗体 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但
48、有时尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出体的鼠源成分，发展出CDRCDR移植技术。移植技术。CDRCDR移植即把鼠抗体的移植即把鼠抗体的CDRCDR序列移植到人抗体的序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称可变区内，所得到的抗体称CDRCDR移植抗体或改型抗移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。体，也就是人源化抗体。（二）改型抗体（二）改型抗体 经过经过CDRCDR移植，抗移植，抗体的免疫原性极低，而体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不其抗原结合能力保持不变变 结合半抗原及全抗
49、原结合半抗原及全抗原(如如细胞表面受体、病毒等细胞表面受体、病毒等)的的改形抗体都已有报道，到改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改种治疗性单抗中多数是改型抗体）型抗体）FabFab：抗原结合片断抗原结合片断FvFv：可变区片段可变区片段ScFvScFv：单链可变区片段单链可变区片段单域抗体单域抗体最小识别单位最小识别单位 二、小分子抗体二、小分子抗体分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。基基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的因工程小分子抗体仅表达鼠源性
50、单克隆抗体的V V区片段，其相对分子质量仅为原抗体区片段，其相对分子质量仅为原抗体1/801/31/801/3。(3)(3)单域抗体单域抗体(4)(4)最小识别单位最小识别单位可以用细菌发酵生产，成本低可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强分子小，穿透力强;不含不含Fc，没有，没有Fc带来的效应带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等素或酶标抗体等。小分子抗体的优点及应用小分子抗体的优点及应用应用：应用：用于肿瘤的导向治疗用于肿瘤的导
