1、细细 胞胞 培培 养养 技术技术广东医学院病理学教研室广东医学院病理学教研室 邓惠华邓惠华组织培养的基本概念和发展简史 早期培养 组织培养的建立与发展 现代组织培养 体外培养细胞的分型贴壁型细胞 上皮细胞型 成纤维细胞型 游走细胞型 悬浮型细胞 培养细胞的生命期原代培养期 原代培养与体内原组织很相似，具异质性，相互依存性强，细胞克隆形成率低。此期一般持续14周。传代期 持续时间最长，其特点是细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。衰退期 细胞培养一代的生长过程传代是将细胞从一个培养瓶皿转移到另一培养瓶皿内生长 培养一代单个细胞可倍增36倍游离期 指数增殖期 停止期 细胞分裂数量作为判定细胞生长是否旺
2、盛的一个重要指标，以细胞分裂指数（mitotic index,MI）来表示。MI是指100个培养细胞中的分裂细胞数。一般细胞的MI为0.20.5，无限传代细胞系或肿瘤细胞的MI可高达 35。在传代期培养时应注意的问题为保持二倍体细胞性质，细胞应在传代后早期冻存（10代内冻存）。少数细胞系在此期可能发生自发或诱发转化，获得不死性而成为无限细胞系，此时细胞核型多变成异倍体。建立细胞系（株）的要求建立细胞系（株）的要求 用选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。一般在原代或23代后即大量冻存，作为原种（stock cells），取一支细胞进行传代繁殖，用毕再
3、冻存，这样可保证长期使用和延缓衰老。当连续传10代左右时，可按建系、建株要求进行检测或鉴定。国际上知名的细胞库ATCC（American Type Culture CollectionIMR（Institute for Medical Research）The Human Genetic Mutant Cell Repository，Institute for Medical Research Copewood and Davis Streets，Camden，NJ 08 103 USAJCRB细胞库（Japanese Cancer Research Resources Bank Cell B
4、ank）ECACC（European Collection of Animal Cell Cultures）ATCC入库检测项目入库检测项目 组织来源和已传代数：应说明细胞供体所属物种，来自人或动物，个体性别、年龄、取材的器官和组织。肿瘤组织应说明临床和病理诊断及病历号等。细胞培养传代情况。培养条件及方法：说明使用培养基、血清种类及用量、抗生素、适宜pH等。细胞活力、细胞生长曲线、分裂指数、倍增时间等。冻存液ATCC入库检测项目入库检测项目融解后细胞生长特性。接种存活率细胞生物学检测 细胞形态、特异结构、细胞核型物种检测 检测同工酶谱，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染。ATCC入
5、库检测项目入库检测项目无菌检测 包括细菌、真菌、支原体、病毒等反转录酶检测细胞建立者检测者鉴定组织培养细胞的生存环境、条件无菌环境、温度、气体环境和氢离子浓度基本营养物质细胞量和培养器皿的清洁度组织培养设施和基本条件实验室设计 应保证无微生物污染和不受其他有害因素的影响.具体工作包括无菌操作、无菌处理、洗刷、制备细胞、孵育、传代、细胞冻存与复苏等。准备工作功能区无菌室净化工作台无菌箱设备器材大型工具类无菌室、实验室、超净工作台等；CO2培养箱、恒温箱、培养盘等；显微镜：倒置、普通、照相系统；普通离心机、冷冻离心机冰箱：普通、（超）低温、液氮罐；药品柜、器具柜、实验台等。配液用具蒸馏水制作系统天
6、平称量系统pH仪、pH试纸（广泛、精密）量筒、漏斗、容量瓶等。消毒灭菌类高压蒸气灭菌器;干热灭菌器;滤过器（蔡氏滤器EKS，玻璃滤器）、滤过瓶和抽滤泵、微量超滤膜滤器等;紫外灯，离子发生器;制备细胞用具解剖用具、尼龙或不锈钢网、血球计数器等。培养器皿、培养瓶、细胞培养板等。，刻度吸管、滴管、试管等。溶液瓶（不同规格）恒温磁力搅拌器、恒温震荡水浴箱、涡流混悬器等。细胞冻存管、真空低温干燥器等。实验器材的处理一 器具洗刷玻璃器皿的清洗 要求：干净透明、无油迹、无残留有害物资或化学品。步骤：浸泡刷洗浸酸冲洗浸泡：自来水浸泡过夜，水洗；再用2-5%盐酸浸泡过夜或煮沸30分，水洗；刷洗：用软毛刷、优质洗
7、涤剂刷洗杂质，冲洗晾干；浸酸：4小时以上。（重铬酸钾+浓硫酸）冲洗：自来水10次以上蒸馏水3次以上。塑料器皿的清洗自来水充分浸泡、冲洗2 NaOH浸泡过夜自来水冲洗 25盐酸浸泡30min 自来水冲洗蒸馏水漂洗3次晾干紫外线照射30min(或先用75酒精浸泡、擦拭，再用紫外线照射30min）。凡能耐热的塑料器皿，最好经121.3高压灭菌。胶塞等橡胶类器材的处理新购置者先经自来水冲洗 2 NaOH煮沸15min 自来水冲洗25HCl煮沸15min 自来水冲洗5次以上蒸馏水冲洗5次以上蒸馏水煮沸10min，倒掉沸水让余热烘干瓶塞等。或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放于小型金属盒内经121.3高压灭菌。金属
8、器械的清洗新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械应先以清水煮沸消毒，再擦拭干净。使用前以蒸馏水煮沸10min，或包装好以1213高压15min。除菌滤器的处理蔡（Seit）氏滤器：玻璃滤器：注射器薄膜滤器清洁液配制的使用注意事项选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。先将重铬酸钾溶于水中（用玻棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将产热而发生危险（绝不可将重铬酸钾液倒入浓硫酸中）。清洁液配好呈棕红色，待变绿色时表明失效。由于清洁液的腐蚀性极强，配制与应用时必须小心，并做好防护。包装 小瓶皿、胶塞、刀剪等器
9、械可装入饭盒，再以牛皮纸包好，绳扎好。吸管、滴管口用脱脂棉塞上（不要太紧或太松）装入消毒筒内，滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包好瓶口等，外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。无菌衣、帽、口罩均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。瓶类：硫酸纸罩以瓶口，外罩二层牛皮纸用绳扎紧。消毒灭菌严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的，其方法分为物理法和化学法两类。物理法：干热、湿热、滤过、紫 外线及射线等。化学法：指使用化学消毒剂等。干烤:170 高压蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用115高压灭
10、菌10min；布类、玻璃制品、金属器械等用121.3）高压灭菌1520min。滤过除菌：适于含有不耐热成分的培养基和试剂的除菌，用孔径为2045nm大小的滤板可除去细菌和霉菌等；滤器分为抽滤（负压）和加压式，前者滤器连接抽滤瓶，用真空抽气泵抽气使液体滤过；后者为密闭容器，加入需滤过液体后，给以氮气造成容器内压力，使溶液滤过，氮气压力不能超过20kPa。紫外线：用于消毒实验室内空气及操作台表面，也可用于对不耐热的塑料微孔反应板的处理。照射物距灯约0.5lm，直射30120min。一般进无菌室前或做完试验后，照射30min进行消毒。射线：熏蒸消毒：实验室、无菌室的消毒可用甲醛熏蒸，遇有无菌室出现污
11、染致细胞多次污染时，或实验室两个月一次的常规消毒，均可用高锰酸钾57.5g，加甲醛（40%）1015ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24h，至少要封闭4h以上。化学消毒剂：常用碘酒、酒精擦手及擦拭培养瓶盖和外壁等；来苏、新洁尔灭、过氧乙酸等用于实验室、无菌室的桌面、物体表面的消毒，或放消毒缸内使用。培养用液 培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。主要包括平衡盐溶液、常用试剂及培养基三大类，培养基又分为天然培养基与合成培养基.平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）具有维持渗透压，调控酸、碱平衡的作用
12、，并可供细胞生存所需的能量和无机离子成分，另外尚可用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液。常用试剂是制备细胞、培养细胞及检查细胞所必需的。水水不仅是细胞的主要成分，也是细胞赖以生存的主要环境，营养物质、代谢产物都必须溶解在水中，才能被细胞吸收和排泄。体外培养细胞对水的质量非常敏感，要求很高。水的纯度不够,即使有害元素含量极少对细胞也会产生不利的影响，有时引起细胞中毒死亡。因此配制所有的培养液和各种溶液应使用纯化水。组织培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水。二次蒸馏水或一次蒸馏水可用以清洗器皿或配制一般洗液。离子交换水装置此装置用离子交换树脂可有效地去除离子，所制得的水称为去离子水。
13、制取去离子水不用燃料、成本低、水质好、操作简便，但不能去除非离子物质或有机物质，因此组织培养中很少使用，仅用于冲洗玻璃器皿等。蒸馏水装置玻璃蒸馏器制取的蒸馏水符合组织培养的要求，因用金属蒸馏器不能完全排除金属离子，故不符合要求。有时为制取大量高质纯化水，可用去离子水经玻璃蒸馏器重蒸,组织培养用液需用三蒸水配制。蒸馏水一般是现用现制，存放时间不宜太长，最好不要超过两周。因空气中的杂质和有毒气体能污染水质，CO2也会溶解于水，故存放时要将蒸馏水装满贮存容器，密封瓶口防止空气混入。细胞培养常用试剂主要包括分离组织和分散细胞用的细胞分离液（消化液）、调整培养液酸碱度的pH调整液、防止培养过程中发生污染
14、的抗生素溶液、指示酸碱度（pH）的酚红溶液、检查细胞和观察研究细胞用的各种染液等。胰蛋白酶主要来自牛或猪的胰脏，淡黄色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存。主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。其活性是用水解酪蛋白的能力表示，常使用1：125和1：250，即1份胰酶分别能解离125份和250份酪蛋白,胰酶的离散作用与细胞的种类和特性密切相关。不同细胞系对胰酶溶液的作用浓度、温度和时间等的要求也不一样。浓度大、温度高、作用时间长对细胞的分离能力也越大，但超过一定限度也会损伤细胞、胰酶在pH80，温度37时，作用力最强。Ca+、Mg+血清、蛋白质的存在会降低其活力，可用无Ca+、M+的溶液配制
15、，需要终止消化作用时，可加入一些血清或含血清的培养液或胰酶抑制剂来终止胰酶对细胞的继续作用。NaHCO3溶液:常用的浓度有 7.4、5.6、3.7。配制时用三蒸水溶解后，滤过除菌，分装小瓶，盖紧瓶塞，于4或室温保存。有的实验室用高压灭菌，虽有部分NaHCO3被破坏，但操作简单方便。调节pH时，NaHCO3要逐滴加入，并不时摇动培养液，以防止加入过量。当pH值过高后，可用灭菌的10醋酸溶液或通入CO2气体调节。pH调整液为了较长时间恒定pH，可使用缓冲能力较强HEPES（N2oxyethylpiperazine N-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基派嗪-N-2-乙磺酸）
16、，使用的终浓度为1050mmol/L，可以根据缓冲能力的要求而定。HEPES抗生素液在离散细胞或培养细胞过程中，试液中加入适量抗生素，可预防操作不慎而产生的污染。常用的有青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、二性霉素等。常配成100 x 或200 x 于使用浓度的盐溶液内，分装小瓶，冷冻保存。使用前加入到培养液内，每小瓶最好一次用完。L-Glutamin溶液 制备：LGlutamin 6g（分子量14615）三蒸水 200ml（1）滤过除菌；（2）分装；（3）一20保存；（4）使用时每100ml培养液加 l ml。培养基可分为天然培养基合成培养基。常用培养液天然培养基天然培养基（natural
17、media）包括：血清、组织提取液等。血清是细胞培养中最常使用的天然培养基。血清中含有许多能维持细胞生长增殖不可缺少的成分，如蛋白质、多肽、激素及各种氨基酸、葡萄糖、酮酸等营养成分。种类：分人血清和动物血清两大类。细胞培养中最常用的是动物血清，来自牛、马、兔等动物，其中牛血清比马血清用得更广泛。牛血清分为胎牛血清（fetal bovineserum，FBS）和小牛血清（calf serum，CS）两种。FBS是经剖腹从母牛子宫中取出的胎牛中分离到的血清，价格贵；CS是从刚出生但尚未哺乳的小牛中分离到的血清。目前市售的牛血清质量不一，购买之前应通过细胞培养进行选择试验，观察细胞生长增殖与否。也可
18、以用克隆形成率和细胞生长曲线作为指标加以鉴定，而且要选择经过支原体试验合格的牛血清。合成培养基合成培养基（Synthetic media）是根据研究和了解细胞所需成分的基础上配制而成的，现已成为普遍应用的商品化的培养基。但合成培养基尚未成为十分完全的培养基，它只能维持细胞不死，而不能促进细胞增殖生长，使用时尚需添加天然培养基，主要是牛血清。目前常用的合成培养基主要是MEM、Eagle、RPMl-l640、199培养液等。MEM 培养液常用的是MEM（Minimum Eagle Medium，低限量培养基），仅含12种必需氨基酸、谷氨酸胺和8种维生素，成分简单，适合各种已建成细胞系的培养，同时宜
19、于添加或减少某些成分，也特别适于特殊研究的细胞培养工作。在它的基础上改良的 DMEM（Dulbeccos Modified Eagle Medium，Dulbecco改良的 Eagle培养基）应用也十分广泛。RPMl-l640RPMl-l640 是一种常用的培养液，最初是针对淋巴细胞的培养而设计的，问世后发现能广泛适应许多种类的细胞，包括正常细胞和肿瘤细胞的培养，而且成分简单，和MEM一样应用十分广泛。配制方法生长液与维持液血清含有多种促进细胞生长、贴附的活性物质。合成培养基中不加血清或低浓度（如 2）血清，仅能维持细胞生存，细胞不能很好生长，这种培养基称为维持液。加入5的血清，对大多数细胞来
20、说，能维持不死和缓慢生长。一般需加入1020血清，有利于细胞生长，称为生长液。添加血清，虽利于细胞生长，但不明成分也增多了，对分析实验结果增加了困难。附 RPMI1640生长液和维持液配法；生长液：RPMI-1640 87 小牛血清 10 谷氨酸胺（100 X）1 双抗（100 X）1 用5.6NaHCO3调pH至7.0-7.2。维持液：RPMI-1640 95 小牛血清 2 谷氨酸胺（100 X）1 双抗（100 x）1 用56NaHCO3调pH至7.0-7.2。无血清培养基无血清培养基主要由基础培养液和附加成分两部分组成，前者大多数仍采用合成培养基作为基础溶液，常用的是F12和 D M E
21、 M 培 基，二 者 按 1:1 混 合 补 加 15mmol/L HEPES等；后者是根据不同细胞的要求，附加特异性生长因子、激素、细胞附着蛋白、金属离子转移蛋白、细胞结合蛋白、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂和微量元素等。激素类：胰岛素 三碘甲状腺原氨酸 生长激素（G）氢化可的松 维生素A酸 生长因子：上皮生长因子（EGF）成纤维生长因子（FGF）神经生长因子（NGF）金属离子转运蛋白：转铁蛋白 （transferrin）微量元素：硒酸钠（Na2SeO3）酶抑制剂：大豆胰酶抑制剂 （soybeantrypsin inbibitor）抑蛋白酶肽（aprotinin）基 本 技 术培养操作基本要领和要
22、求 无菌操作、前准备、消毒等 基本培养操作技术取 材一般说来，各种动物和人体内的所有组织均可用于培养。但实际上，只有幼年组织尤其是胚胎组织以及肿瘤组织和其他分化程度低的组织比较容易培养。从体内取材时，应严格保持无菌，防止污染。对其他暴露于外界的组织，应将所取的组织放入含二性霉素（2gml），青霉素（500uml），链霉素（500gml）的培养液中浸泡1020min。取材之后，应立即培养，否则应把组织切成1mm3左右的小块，放入培养液内，置4贮存，存放时间不宜超过24小时。细胞分散机械分散法 对某些软组织如脑、胚胎以及某些肿瘤等，可采用机械法进行分散。较为常用的方法是用组织匀浆器研碎组织，然后通
23、过不锈钢纱网获得单细胞悬液。此法简便省时，但对组织有一定损失。胰蛋白酶消化法胰蛋白酶适用于消化间质较少的软组织，对传代细胞的消化也比较好。使用胰蛋白酶的消化程序如下：将组织剪成lmm3的大小，置于三角烧瓶中，加入比细胞多3050倍的025 胰蛋白酶液。置电磁搅拌器上搅拌（30100rmin），消化3060min；或放入37水浴中消化，但中间要不时摇动；消化完毕后，吸取23上清液于离心管中，1000rpm 5min，然后用Hanks液离心漂洗两次；加入一定量的营养液，通过200目的尼龙网或不锈钢网滤过，即可用于培养。上述方法亦称为热消化，有时可将组织加入胰蛋白酶后，置于4，进行缓慢消化，消化时间
24、可延长1224h，此法称冷消化法。胶原酶消化法此法对胶原有较强的消化作用，适用消化纤维组织，上皮组织及瘤组织等。胶原酶常用剂量终浓度200uml或0.l0.3gml。此法消化作用缓和消化过程与胰蛋白消化法基本相同。可联合应用胰蛋白酶和胶原酶消化某些硬组织，其消化效果更佳。实验中常用EDTA作为化学螯合剂，其溶液又称Versen液。使用浓度一般为0.02。螯合剂分散法常用于消化传代细胞，此法作用温和，毒性较小。螯合剂分散法细胞的分装、培养及传代 根据细胞计数，用生长液将细胞悬液稀释成（3-5）x 105个ml，每个培养皿内分装一定量。一般接种细胞数应视细胞种类不同而定，如类上皮细胞应为（13）x
25、 105ml，成纤维细胞应加倍（2-6）x 105ml。若为胚胎组织细胞，细胞数量可低些，而成体组织细胞数量则应高些；细胞活力好的接种数可少些，年老组织接种的量就应多些。已铺满瓶底面的单层细胞，如继续培养则易老化，甚至脱落。感染病毒等影响特异性CPE的判断，因此成片细胞不能当天使用，应换成维持液（含2以下血清的培养基），以后每隔57天换维持液一次，一般可维持13周。单层的原代细胞可进行传代培养用细胞分散剂（胰酶、EDTA或胰酶+EDTA等）处理，使细胞从培养皿底脱离，加生长液充分吹打，制成单个细胞悬液分装。加入生长液的量可按原量的2倍，即一瓶传成二瓶，置37培养35天可形成单层，成片后换维持液
26、即可进行试验。细胞的冻存、复苏与运输细胞的冻存培养细胞维持传代以供实验用常遇到某些困难。细胞株在传代中性质易发生改变;在传代中有支原体污染的危险;对有限增殖细胞株，传代应维持在限内期间传代，解决这些困难的办法就是将细胞冻存。细胞冻存在液氮中，贮存时间几乎是无限的。冻存细胞的原理与要求原理：在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。如向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。贮存在-13
27、0以下低温中能减少冰晶的形成。融解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-50后，细胞仍能生长，活力不受任何损害。当前使用的保护剂为DMSO和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，使用浓度范围在515之间，常用10。要求：为保持细胞最大存活率，一般采用慢冻快融的方法。标准的冷冻速度为l-2min，当温度达-25时，下降率可增至510min,到一100时则可迅速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。但各种细胞对冻结速度要求不一样，上皮细胞和成纤维细胞的耐受性能大些，骨髓干细胞1-3min合适，胚胎细胞耐性较小。开始时下降速度不能超1
28、0min。另外用什么保护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养用DMSO较好，一般细胞可用甘油。用量以较小为好，有人认为人皮肤上皮细胞贮存在2030甘油中很好。原则上细胞在液氮中可贮存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。选用对数生长期细胞，在收集细胞24小时前换液一次。常规方法消化细胞，按l5 x l06ml细胞浓度，悬浮于含 10二甲基亚砜（DMSO）的小牛血清或生长液中。冻存的细胞数量要充分，因复苏时接种的细胞数量应比平常多一些。用吸管吸取细胞悬液，分装于无菌冻存管（每冻存管lml），严密封口，放入三层纱布小袋（内放铅块以防止漂浮）中，并系以线绳，末端扎有小
29、牌，注明细胞名称和冻存日期，便于以后查找。冻存细胞的方法冻存当前已有专用细胞冻存器，能精确地控制冷冻速度。在无冻存器的情况下，可用手工方法。从把冻存管悬在液氮容器口开始，在3040min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。或先将冻存管移入液氮罐口颈部气相中过夜，次日将纱布袋缓慢下降至液氮中，历时3 min。在液氮中可长期保存。【附】冻存保护液（10ml）生长液 6.8 ml 小牛血清 2.0 ml二甲基亚砜 1.0 ml 双 抗 0.l ml56NaHCO3 0.l ml 细胞的复苏将冻存于液氮中的冻存管取出（取出时应戴好手套和防护眼镜），迅速放入37-40水浴中使其在l
30、 min内融化。或取出细胞悬液至离心管中，补加 10ml培养液，5001000 rpm 5 min，去上清，用培养液适当稀释后装入培养瓶中，置37培养，次日后更换一次培养液。无菌操作下打开冻存管，将细胞悬液吸取到培养瓶中，补足生长液后，置37培养。待细胞贴壁（约4h）后，换生长液一次。待细胞长成单层后即可传代。细胞的运输 当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和购买，也在国际交流，为此要有装运细胞的方法。装运方法有两种，一种是用液氮或干冰贮存运输，需要用特殊容器，保存效果较好，但较麻烦，且液氮和干冰蒸发都较快，不适于长时间运行，需要空运。另一种充液法，比较简便易行。选生长状态良好的细胞，待接近或刚
31、刚连接成片后，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。妥善包装、运输。一般在四五天内到达目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长，则细胞活力下降。到达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液量，置37培养，次日传代。组织培养污染的检测与排除 组织培养细胞被有害物污染是组织培养工作的大敌。应用组织培养进行研究工作，除需完善的实验设计和技术方法外，成败的关键还在于能否避免污染。细菌与霉菌的污染常见污染的细菌有大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等;常可发生真菌污染，尤其炎热、潮湿的季节十分常
32、见，如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌等。霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长，或产生有毒物质导致细胞死亡。镜下可见大量颗粒，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。霉菌污染容易发现，大多形成肉眼可见的白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，镜下可见丝状菌丝，纵横交错于细胞之间。细菌污染如较严重培养基上清混浊，较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养，加以确定。抗生素及抗霉菌制剂对预防或排除细菌、霉菌污染有效。工作中要特别注意和防止所用培养液和血清的污染，用前应仔细检查有无混浊和菌丝存在，以防止在培养细胞时造成污染。支原体污染和检测 支原体是细胞培养中最常见的，又是干扰实验结果的一
33、种污染。但由于不易被察觉，这些污染的细胞仍在继续使用。据查目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11的细胞受到支原体污染。因此，对支原体的污染必须严加防范，并应熟悉支原体基本特性。支原体是一种介于细菌和病毒之间，并能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈多形性，最小的直径0.2um，可通过滤菌器。常在购进的各种血清中就有支原体存在。细胞污染后，因支原体无细胞致死毒性并可与细胞长期共存，培养基一般不发生混浊，细胞无明显变化，外观上往往给人以“正常”的感觉，实则细胞能受到多方面的潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA的合成，以致抑制细胞的生长。支原体检测的方法培养法荧光法电子显微镜法聚合酶链
34、反应（PCR）法微生物污染的排除 培养的细胞一旦被微生物污染，应及时处理，防止造成本实验室中其他细胞的污染。一般细胞被污染最好高压灭菌后弃掉。如果是有价值的细胞被污染，并且污染的程度比较轻，可及时排除污染物，细胞可能恢复正常。抗生素排除法用抗生素是杀灭微生物的主要手段。各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防应用比污染后使用好；当已发生微生物污染后再使用抗生素，常难以根除。有的抗生素对细菌仅有抑制作用，而无杀菌效应。反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，有人主张尽量不用抗生素处理，当然在一些有价值的细胞被污染仍需用抗生素挽救，在这种情况
35、下，可采用510倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用2448小时，再换入常规培养液中，有时可能奏效。加温除菌根据支原体对热耐受性差的特点。可将受支原体污染的细胞置于 41中作用 510h，最长可达18h，以杀灭支原体。但41对培养细胞本身也有较大影响，放在处理前，应先进行预试验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的最佳处理时间。动物体内接种受微生物污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭污染的微生物，肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出再进行培养繁殖。各种消除污染细胞的微生物方法都比较麻烦，仅对重要的有保存价值的细胞有用。很易重新培养的细胞受污染后，最好弃之。
