1、第五章细胞生物学研究方法及其在中医研究中的应用 一些基本的问题，请大家思考：1人、动物、细胞作为实验对象的异同？2动物实验研究中医的利弊？有没有有利的地方，优越于人的？3细胞可不可以用来研究中医？似乎还不如动物，连整体都没有了，如何用药、如何辨证、如何整体观？有没有有利的地方，优越于动物的？4如何选择细胞生物学来研究中医？能不能举一些例子？比如你们开展的探索性实验。通常中药复方面临的系列学术问题：1）有无作用；2）哪些组合、配伍、药物有效；3）药物的有效部位、成分、及其组合；4）被调控的组织、系统、器官；5）被调控的基因、基因组；6）整个调节链、网；7）如何提高疗效对此，细胞生物学能做什么？教
2、材引言部分1介绍细胞生物学细胞生物学研究内容广泛，主要包括以下几个方面：1）细胞的结构和化学组成。2）细胞及细胞器的功能。3）细胞的增殖与分化。4）细胞的衰老与死亡。2若干定义细胞培养是指细胞的体外培养。具体地说，是在无菌条件下，把动物或植物的细胞从有机体分离出来，置于培养器皿中，在一个合适的环境中给以营养物质，使细胞能继续生存和生长的一种方法。组织培养、器官培养，如果体外培养的是组织、器官或器官原基，则称为组织培养或器官培养。3细胞生物学的优点（1）因素单纯：培养细胞不受体内各种复杂因素的影响。（2）实验条件易控：人为改变培养条件，即可观察细胞在单因素或多因素影响下的生理改变。（3）重复性好
3、：可避免种属及个体之间的差异。（4）方法简便：便于使用各种技术方法观察研究活细胞的形态结构和生命活动。（5）经济、快速：节约动物及药物，可在较短时间内获得较多的实验样品和研究结果。（6）便于应用人体组织。（7）结果易于分析。以上（5）实质是两个部分：经济（实验成本低）：节约动物、药物；快速（实验周期较短）：可在较短时间内获得较多的实验样品和研究结果。比较：离体和在体研究的利弊。解释“离体”和“在体”。那么“在体”的优点有没有，是什么？实验动物整体实验的优点1）保持了机体的完整性，神经、体液、脏腑、组织、药物代谢，等。2）符合临床用药。3）取材不受限制，创伤实验不受限制（不伤害人，或人不可以的实
4、验）。4）数量满足方便。实验动物其他优点与细胞培养类似，即相对于人而言：5）实验条件易控：人为改变培养条件，即可观察细胞在单因素或多因素影响下的生理改变。6）重复性好：可避免种属及个体之间的差异（纯系动物）。7）方法简便：便于使用各种技术方法观察研究活细胞的形态结构和生命活动。8）结果易于分析。9）经济：节约药物和其他费用。10）实验周期较短。4细胞生物学的用途（1）观测不同组织细胞的生物特性及其中医药调整作用。（2）观测不同肿瘤细胞，了解中医药对生物学特征，包括转移、分化、凋亡等影响。（3）细胞系，目的同上，而细胞稳定，而以上原代细胞的部分生物特性，可能会逐渐消失。（4）工具，主要为细胞系，
5、作为一种载体使用。比如研究基因的表达与调控，经常使用报道基因技术、哺乳类载体技术、基因转移技术，等（简单介绍）。第一节 细胞生物学研究的主要技术一、细胞培养技术主要包括：细胞体外培养的一般条件、细胞培养的基本步骤、培养细胞的生长与观察。（一）细胞体外培养的一般条件1培养基细胞需要生长在具有充分营养物质的培养基中，培养基含有的成分：（1）含氮化合物：是蛋白质和核酸的基本构筑材料，动物细胞至少需要12-13种氨基酸。（2）维生素和某些金属离子：可维持酶的正常功能，一般需要八种水溶性维生素和铁、铜、锌等金属离子。（3）无机盐离子：调节离子强度和渗透压、维持酸碱度。（4）碳水化合物：是体外细胞的主要能
6、源，动物细胞通常利用葡萄糖等单糖物质。（5）促生长因子：激素、生长因子等可促进细胞增殖生长，维持某些细胞的特殊功能。（6）血清：大多数培养液中需加入血清，常用经56、30min灭活的胎牛血清、小牛血清，血清中含有多种细胞生长因子、促贴附因子以及其它活性物质。培养液中血清的含量一般为10-20%，才可维持细胞的正常生长。2培养环境 培养细胞一般接种于盛有pH 7.2-7.4的培养液的器皿中，放置在36-37、5%CO2加95%空气混合气体、95-100%湿度的培养箱中。这种环境适合多种细菌、支原体、真菌的生长。因此，在培养液中应加入适量的抗生素（如青霉素、链霉素），并在细胞培养的全过程保持无菌操
7、作。（二）细胞培养的基本步骤体外培养的细胞可分为原代细胞与传代细胞：1定义（1）原代细胞：是指从机体取出后直接培养的细胞。（2）传代细胞：是指适合在体外培养条件下继续培养的细胞。（3）细胞系：原代细胞一旦传代培养即称为细胞系。（4）细胞株：若细胞系用单细胞分离培养，由单细胞增殖形成细胞群，则称为细胞株。2细胞体外培养的一些基本理论和知识（1）细胞周期（增殖态）G1+S+G2+MG1：细胞分裂后期，DNA合成前。S：DNA合成期，DNA增加一倍（拷贝）G2：介于S与 M之间，时间短。M：细胞有丝分裂期。（2）不同的称谓和意义名称原代培养细胞系阶段首次转化（指数生长期）连续细胞系（不死）有限细胞系
8、（死亡）时间02周212周12周以上*50代，大约2550周（612月）。原代细胞培养步骤一般如下：从动物或人体取出组织块，剪碎，用浓度与活性适中的胰蛋白酶或胶原酶与乙二胺四乙酸（EDTA）等将细胞消化分散（不破坏细胞结构），细胞计数后接种于培养器皿内，给予合适的培养液及其它培养条件，进行静置或旋转培养。大鼠超排卵卵巢组织形态与正常组织 卵泡颗粒细胞培养72小时1-PMSG刺激后的大鼠双侧卵巢；2-正常大鼠双侧卵巢。引自董冰峰硕士毕业论文 超净工作台原理及其使用：常见的问题：污染。主要原因：操作不当。其余如实验室环境、超净台污染和过滤材料陈旧、试剂污染、材料污染。H22细胞培养污染 污染常见原
9、因的分析（三）培养细胞的生长与观察不同来源的细胞在体外的生长方式不同，根据是否贴附于支持物上生长，可分为贴附型与悬浮型。细胞贴壁：贴附型细胞而言，刚接种入培养液的细胞多呈圆球形，几十分钟至数小时后，细胞即贴附在瓶壁上，此称为细胞贴壁。细胞一经贴壁就迅速铺展呈多形态，经过一段潜伏期后细胞即开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般在数天内就铺满瓶壁，形成致密的细胞单层。对数生长期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的、最主要的阶段。垂体细胞前叶细胞培养24小时 垂体细胞前叶细胞培养72小时 肝癌QGY-7703细胞40 肺癌细胞传代后贴壁不好200细胞培养中的一个非常有趣的现象是细胞
10、的接触抑制，当贴壁生长的细胞分裂生长到表面相互接触时，就停止分裂增殖，相互紧密接触的细胞不再进入S期。肝癌QGY-7703细胞400 肺癌细胞100肝癌细胞有接触抑制现象。肺癌细胞则没有接触抑制现象。细胞传代：长成单层的细胞经过一段时间，一定要重新分散后分瓶继续培养，使其继续分裂增殖，否则就要衰退死亡，不能维持其生命活动。这一分瓶再重新培养的过程，称作细胞的传代。传代后的细胞在新的培养瓶中约经6-24h开始贴壁，再次进入新的生长周期。细胞系在体外的可传代数与细胞种类及原供体的年龄等有关。人胚肺二倍体成纤维细胞在不冻存和反复传代条件下，可传30-50代，相当于150-300个细胞增殖周期，能维持
11、一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）；肝细胞及肾细胞仅能传几代或十几代，而神经元一般不能传代。已建立的细胞系种类很多，如Hela、3T3、BHK-21、CHO等。体外培养的细胞形态，与体内原有细胞不同，按形态大致可分为成纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。传代细胞经培养后，可以用液氮冷冻的方式加以保存。一旦实验需要，可以复苏后再继续培养。二、形态学观察技术包括各种光学显微镜和电子显微镜技术的应用。肝癌QGY-7703细胞的细胞计数 肝癌SMMC7721细胞正常大鼠血清 肝癌SMMC7721细胞清热解毒血清肝癌SMMC7721细胞5-FU血清 肝癌SMMC7721细
12、胞活血化瘀血清引自许海达硕士学位论文三、细胞化学技术细胞化学技术的任务：细胞化学技术的任务是研究细胞内各种成分的含量及分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞结构与功能的关系以及细胞的各种生理和病理现象。（一）酶细胞化学技术细胞中有很多酶，它们的分布不是杂乱的，在细胞内都有特定的位置，这种酶存在的特定部位称为酶的定位。早期的细胞化学工作主要在光学显微镜水平上进行，又称为组织化学。近年来，这一技术在生物学和医学研究中已受到越来越多的重视。首先，酶的细胞化学定位对研究细胞的生理功能和病理过程有重要意义；其次，很多酶可以作为细胞膜和各种细胞器的标记酶，而且有些细胞还有其特有的标记酶
13、，这就为研究细胞器的结构与功能、细胞器的相互关系以及细胞的鉴别等提供了新的手段。（二）免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术是利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。早期的免疫细胞化学工作是在光学显微镜水平上进行的，又称免疫组织化学。目前，光镜和电镜水平的免疫细胞化学技术在细胞生物学、组织学和病理学等方面的应用已相当普遍。（三）放射自显影技术放射自显影是利用放射性核素所放射出来的射线作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，并通过显影过程把“像”显示出来，以研究用放射性核素标记的物质在生物体内的定位和定量的一种技术。四、细胞结构成分的离心分离技术在显微和超微结构水平上的形态观察和细胞化学
14、方法为了解细胞和细胞器的结构与功能提供了不少资料，但是，要深入了解细胞和细胞器的功能活动，还必须分离各种细胞结构成分，研究它们的化学组成、酶活性和代谢特点。五、分析细胞学技术 （一）流式细胞计（FCM）FCM（flow cytometer），又称荧光激活细胞分类仪（Fluorescence activated cell sortor，FACS），流体喷射+激光+空气计数+射线能谱术+计算机+显微荧光光度计。方法：细胞分离、固定、染色、通过、检测、分析。可以分析单细胞和群体细胞。速度：5000个细胞/秒！FCM可用于测量细胞的多种参数，其中有些细胞参数不经染色处理就能直接测量，如细胞大小、形状、
15、胞浆颗粒、色素含量、蛋白荧光及氧化还原状态等；一些参数必须经染色（荧光标记）后才能测量，如DNA 含量与碱基比、染色质结构、RNA含量、总蛋白、碱性蛋白、巯基、表面抗原、细胞骨架组成、膜完整性与通透性、酶活性、内吞作用、表面电荷、细胞内受体、DNA合成、凋亡、膜流动性与微粘度、表面受体、胞浆与线粒体膜电位、膜结合Ca+、胞浆Ca+、细胞内pH等。流式免疫荧光技术进行免疫细胞标记：以明确淋巴瘤的起源细胞类型。Thy1（CD3抗体）：T细胞特异性抗体B220（CD45R）：B细胞特异性抗体J：wild-tpye淋巴结K：Mus81+/-T系淋巴瘤L：Mus81+/-B系淋巴瘤流式细胞计数（二）显微
16、分光光度计（MSP）MSP（microspectrophotometer，细胞光度计），光学显微镜+荧光显微镜+分光光度计。对细胞内的某些重要的生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）的含量进行定量测试。（三）图像分析系统（IAS）IAS是分析细胞学中的主要测量手段之一，常用于细胞形态分析、白细胞和红细胞分类、肿瘤细胞分析、染色体核型分类、微血管系统分析等方面。（四）激光共聚焦仪（interactive laser cytometer）建立于显微分光光度计与流式细胞计基础之上，研究单细胞水平的结构、功能、应答反应。第二节 细胞生物学在中医药研究中的现状细胞培养技术在中医药研究中的应用，现有文献主
17、要涉及药用植物组织（细胞）培养，有效中药的筛选，中药药理及毒理研究等方面。一、药用植物与动物细胞培养二、细胞生物学在中药药理研究中的应用中药及复方的细胞药理学给药方式主要有两种。其一，将中药及复方的粗制剂直接加入细胞培养体系中。由于粗制剂存在不少杂质成分，它们未经过肠道选择性吸收及体内的代谢过程，从而影响到实验结果。其二，血清药理学给药。1984年日本学者提出了给动物灌服中药一定时间后采血，分离血清，用此含药物成分的血清进行体外实验，1988年命名此新的药理学实验方法为中药“血清药理学”。近年来国内外应用血清药理学方法研究中药及复方积累了一定的经验。从目前已有的工作来看，中药血清药理学方法可能
18、具有以下优点：1）中药粗制剂经口服吸收后，用含药血清进行体外实验，可排除中药粗制剂中杂质成分、各种电解质或鞣质成分、不同酸碱度等各种干扰因素的影响，比较接近药物体内环境中产生药理效应的真实过程。2）对体外实验有效的中药复方，如果其有效成分不能从胃肠道吸收或经体内吸收代谢后失活，则血清药理学方法可避免体外实验得出的错误结论。3）对某些本身无直接作用，但经体内代谢后产生作用的药物，血清药理学可分辨出来。如何应用？以二仙汤研究为例。引自董冰峰硕士论文背景介绍：1二仙汤的由来和构成。2治疗更年期综合征的国内外现状。3动物实验的验证和机理研究。问题：1作用部位，直接的还是间接的？2有效组分，拆方、单味中
19、药、有效成分？3血清药理学与直接给药的异同？1二仙汤及其拆方对大鼠垂体细胞LH表达的作用 （1）二仙汤及拆中，滋阴（ZY）组含药血清有显著的促进作用。（2）二仙汤全方及滋阴、当归直接给药，均能明显促进垂体前叶细胞LH水平的提高。温肾组有一定升高的趋势。二仙汤及拆方血清对垂体LH表达的作用 二仙汤及拆方直接给药对垂体LH表达的作用NS-正常大鼠血清对照，Control-空白对照；QF-全方，WS-温肾，ZY-滋阴，DG-当归 以上的差别说明什么问题？1）给药方式差异及可能的机理。2）实验要求重复。3）筛选成分及成分组合的增加。（3）淫羊藿苷和仙茅苷两种有效成分与DMSO溶剂组比较，均有提高培养液
20、中LH水平的趋势。中药有效成分对垂体前叶细胞分泌LH的作用Control对照；DMSO对照；YYH-DMSO+淫羊藿苷；XM-DMSO+仙茅苷 2二仙汤及其拆方对大鼠垂体FSH表达的作用 （1）二仙汤及拆方药物血清对垂体细胞FSH表达均有一定的降低趋势。二仙汤全方及拆方血清对垂体前叶细胞FSH的作用NS-正常大鼠血清对照组，QF-全方，WS-温肾，ZY-滋阴，DG-当归 （2）二仙汤及拆方直接给药可以明显增强垂体前叶细胞FSH的水平（P0.01）。温肾组浓度低作用反而增强；全方浓度低，作用弱（P0.01）；而滋阴方浓度变化区别不明显。二仙汤及拆方直接给药对垂体细胞FSH表达的作用Control
21、-空白对照；QF1-10-3全方；QF2-1/610-3全方；WS1-10-3温肾；WS2-1/310-3温肾；ZY1-10-3滋阴；ZY2-1/210-3滋阴；DG-10-3当归 （3）仙茅苷和淫羊藿苷直接加入对FSH表达的作用 结果：DMSO对垂体前叶细胞FSH水平有明显促进作用（与Control组比较，P0.05）。而中药有效成分则对DMSO这一作用有对抗作用，其中淫羊藿苷组与DMSO溶剂对照组比较显著性降低（P0.05）。二仙汤有效成分对垂体前叶细胞FSH水平的作用Control-对照；DMSO-对照；XM-DMSO+仙茅苷；YYH-DMSO+淫羊藿苷 3二仙汤及拆方对垂体前叶细胞LH
22、、FSH转录的作用 二仙汤及其各拆方直接给药能促进LH mRNA、FSH mRNA转录，且以全方组作用最强，其中对LH mRNA转录的作用，滋阴组作用明显强于温肾组。RT-PCR凝胶电泳示意图DNA marker，大鼠-actin，大鼠LH和FSH。（1）无血清Control组；（2）仙茅苷；（3）DMSO 结果：（1）促进LH转录水平：二仙汤、滋阴方大剂量优于小剂量；温肾方小剂量弱，大剂量更弱。（2）促进FSH转录水平：二仙汤大剂量优于小剂量；温肾方、滋阴方大、小剂量区别不大，当归组无明显作用。二仙汤全方及拆方对垂体前叶细胞两种激素mRNA水平的作用Control-空白对照；QF1-1/61
23、0-3全方；QF2-10-3全方；WS1-1/310-3温肾；WS2-10-3温肾；ZY1-1/210-3滋阴；ZY2-10-3滋阴；DG-10-3当归 4淫羊藿苷、仙茅苷对垂体细胞LH、FSH转录作用 结果：（1）LH：DMSO有一定下调趋势。仙茅苷有下降趋势，淫羊藿苷明显升高。（2）FSH：DMSO有较明显的下调趋势。仙茅苷有下降趋势，淫羊藿苷明显升高。二仙汤有效成分对垂体前叶细胞两种激素mRNA水平的作用Control-空白对照，DMSO对照，XM-DMSO+仙茅苷；YYH-DMSO+淫羊藿苷 5二仙汤药物血清对卵泡颗粒细胞E2的作用 （1）大鼠血清与二仙汤血清有促进卵泡颗粒细胞合成和分
24、泌E2的作用。二仙汤药物血清对卵泡颗粒细胞合成和分泌E2的作用 （2）二仙汤及拆方不同浓度直接给药对颗粒细胞E2的作用 结果：温肾组大剂量好，有显著性差异。二仙汤全方及拆方不同浓度直接加入对颗粒细胞E2水平的作用 （3）温肾方、滋阴方直接给药量效观察 结果：温肾方促进卵泡颗粒细胞E2分泌，有量效关系；滋阴方作用相反。温肾方、滋阴方直接给药量效观察 （4）各单味药直接给药对卵泡颗粒细胞E2的作用 结果：仙茅、当归、巴戟天、淫羊藿作用突出。中药直接加入对卵泡颗粒细胞分泌E2的作用Control-空白对照；YYH-淫羊藿；XM-仙茅；BJT-巴戟天；DG-当归；ZM-知母；HB-黄柏。（5）淫羊藿苷
25、、仙茅苷对卵泡颗粒细胞E2作用 结果：DMSO溶剂能明显促进卵泡颗粒细胞分泌雌二醇，与空白对照组比有明显差异（P0.01）。仙茅苷各浓度及30、100g/L淫羊藿苷能明显对抗这种作用（P0.01）；300、1000g/L淫羊藿苷作用不明显（P0.05）。中药有效成分直接加入对分泌E2的作用NS1-无血清细胞培养液对照；NS2-含DMSO（溶剂）细胞培养液对照；XM 1-4：仙茅苷30、100、300、1000g/L；YYH 1-4：淫羊藿苷30、100、300、1000g/L.三、细胞生物学在中医基础理论研究中的应用（一）中医基础理论研究中培养细胞的选择（二）寻找诊断中医病、证的特异性指标（三
26、）研究中医病、证的产生机制第三节 中医的细胞培养研究范例一、用血清药理学方法观察血府逐瘀浓缩丸对实验性动脉粥样硬化家兔主动脉平滑肌细胞增殖的影响（P120-121）请仔细阅读“实验方法”和“实验结果”。方法：含药血清的制备：灌胃血府逐瘀浓缩丸6g/kg、3g/kg、1g/kg。直接给药：血府逐瘀煎剂浓缩液60mg/ml,30mg/ml,10mg/ml。结果：含药血清抑制率分别为7.0%、5.3%、3.9%。直接给药抑制率分别为11.2%、10.6%、10.3%。结论：可能与某些有效成分未能从消化道吸收或与体内代谢失活有关。实验结论的解释是否合理、全面？结果的处理如下：我们的一些考虑：（1）如书上。（2）可能与浓缩丸的剂量不足有关，如何鉴定？培养液有效成分检测。（3）可能与兔血清有关，如何确定？方法：增加一组空白兔血清。（4）是否可以用动脉粥样硬化动物血清？其余内容请自修。
