1、 流式细胞仪流式细胞仪(Flow Cytometer)是是现代物理电子技术、激光技现代物理电子技术、激光技术、术、计算机技术以及计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器一体的新型高科技仪器；当细胞；当细胞（或其他粒子）以单个方式（或其他粒子）以单个方式依次通过探测依次通过探测光束时，能够光束时，能够采集采集细胞被光照时产生的各种信细胞被光照时产生的各种信号号，然后，然后对信号进行处理对信号进行处理，并能，并能对多个参数进行关联分析对多个参数进行关联分析的的一种一种仪器仪器 流式细胞术流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)
2、利用利用流式细胞仪流式细胞仪对处于对处于快速直线流动状态快速直线流动状态中的中的单列细胞单列细胞或或生物颗粒生物颗粒进行逐个、多参进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的数、快速的定性、定量分析或分选的技术技术流式细胞术流式细胞术激光激光技术、计算机技术、技术、计算机技术、显微显微荧光荧光技术、光电子技术技术、光电子技术、流体喷射流体喷射技术、技术、单克隆抗体单克隆抗体技术技术、纳米技术、纳米技术以及以及分子生物学分子生物学和免疫学等多和免疫学等多门学科知识门学科知识现代现代科学技术发展的综合交叉的产物，是集多种技术发展于一体科学技术发展的综合交叉的产物，是集多种技术发展于一体的的“大成
3、者大成者”广泛应用在免疫学、细胞遗传学、肿瘤生物学和血液学等多学科广泛应用在免疫学、细胞遗传学、肿瘤生物学和血液学等多学科领域领域20世纪世纪70年代发展至今，仪器设备更趋完善，在应用上也逐渐由年代发展至今，仪器设备更趋完善，在应用上也逐渐由基础研究进入到基础研究进入到临床检验医学临床检验医学领域，为细胞分析提供全新手段领域，为细胞分析提供全新手段1930 Caspersson&Thorell 细胞细胞计数计数1940 Coons结合结合荧光素荧光素的的抗体抗体去标记细去标记细胞胞内特定内特定蛋白蛋白1934 Moldaven细胞细胞检测检测自动化自动化光电光电仪记录流过仪记录流过一根毛细管的
4、一根毛细管的细细胞数胞数 1949 Wallace Coulter悬悬液中计数液中计数粒子粒子的的方法并获专利方法并获专利1950 Caspersson显微分光光度计显微分光光度计UV-VIS光谱区检光谱区检测测细胞细胞1953 Croslannd Taylor根据分层根据分层鞘流鞘流原理成功原理成功设计设计红细胞红细胞光学自动光学自动计计数器数器1969 Van Dilla及同事及同事在在Los Alamos,NM发明发明第一台第一台荧光检测荧光检测细胞计细胞计1972 Herzenberg荧光激活细胞分选仪荧光激活细胞分选仪荧光标记抗体染色的荧光标记抗体染色的细胞的较弱荧光信号细胞的较弱荧
5、光信号1975 Kohler单克隆抗体单克隆抗体为细胞研究提供大为细胞研究提供大量的特异免疫试剂量的特异免疫试剂流式细胞术发展史1973 BD公司与公司与斯坦福大学合作斯坦福大学合作第一台商用第一台商用流式流式细胞仪细胞仪分析型分析型流式细胞仪流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用分选型分选型流式细胞仪流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选胞仪一般只用于分选流式细
6、胞仪的分类计算机与分析系统计算机与分析系统信号收集与信号收集与光电转光电转换系统换系统流动室与液流系统流动室与液流系统光源与光学系统光源与光学系统流式细胞仪构造激发光源激发光源计算机分析计算机分析滤光片滤光片流动流动室、室、鞘鞘液和液和样本流样本流信号检测器信号检测器 激发光源激发光源 光学系统光学系统细胞分选与浓缩系统细胞分选与浓缩系统（一）流动室与液流系统流动室是流式仪核心部件，流动室是流式仪核心部件，被测样品在此与激光相交被测样品在此与激光相交流动室由石英玻璃制成，中流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个央有一长方形小孔，供单个细胞通过细胞通过流动室内充满了鞘液，其作流动室内充
7、满了鞘液，其作用是将样品环形包绕用是将样品环形包绕鞘液流速稳定，样品流在鞘鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息荧光信息（一）流动室与液流系统液流驱动系统液流驱动系统（二）激光光源与光学系统（一）（一）激发光源激发光源：激光器：激光器 气体激光器：氩离子气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖、氦氖(633nm)、氪离子、氪离子 (647nm)、氪氩、氪氩(568nm)；染料激光器：如氩离子激光器的泵浦含有染料激光器：如氩离子激光器的泵浦含有Rhodomin 6G水溶液染料，水溶液染料，发出发出
8、550-650nm可变波长激发光；可变波长激发光；半导体激光器半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长；价格低、结构简单、寿命长；BD的的FACS Calibur 已采用已采用635nm半导体激光器半导体激光器激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照（二）激光光源与光学系统（二）光（二）光束成行系统束成行系统（二）激光光源与光学系统透镜透镜（二）光（二）光束成行系统束成行系统滤光片滤光片的组成的组成长通长通(Longpass，LP)滤片：滤片：只允许特定波长以上的光束通过只允许特定波长以上的光束通过短通短通(Shortpass，SP)滤片：
9、滤片：只允许特定波长以下的光束通过只允许特定波长以下的光束通过带通带通(Bandpass，BP)滤片：滤片：只允许一定波长范围内的光束通过只允许一定波长范围内的光束通过（二）激光光源与光学系统（三）光收集系统（三）光收集系统（二）激光光源与光学系统 480 520 460 500 540（三）光收集系统（三）光收集系统 480 520 460 500 540 480 520 460 500 540光信号的类型光信号的类型 散射光信号散射光信号：与标记荧光素无关，与标记荧光素无关，是细胞的固有参数是细胞的固有参数前向散射光前向散射光(forward scatter,FSC)侧向散射光侧向散射光(
10、side scatter,SSC)荧光信号荧光信号自发荧光自发荧光：微弱：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍的荧光，比自发荧光强很多倍（三）信号收集和光电转换系统（一）前向散射光（一）前向散射光FSC FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范围内，度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小体积大小（三）信号收集和光电转换系统（二二）侧向散射光）侧向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称9
11、0度散射度散射光，其信号强度反映光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化细胞内部颗粒度和精细结构的变化。（三）信号收集和光电转换系统 R1:淋巴细胞淋巴细胞 R2:单核细胞单核细胞 R3:中性粒细胞中性粒细胞 R4:裂解碎片裂解碎片（三）信号收集和光电转换系统外周血裂红后外周血裂红后FSC/SSC分布分布（三）荧光信号（三）荧光信号荧光荧光：物质：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光低能状态时释放出的光（三）信号收集和光电转换系统基态基态（三）荧光信号（三）荧光信号细胞细胞经过经过特异荧光素标记
12、后特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的通过对这类荧光信号的检测就检测就能了解所研究细胞参数的存在能了解所研究细胞参数的存在与与定量定量抗原抗原抗体抗体荧光素荧光素激光束激光束（三）信号收集和光电转换系统（三）荧光信号（三）荧光信号常用荧光素常用荧光素（三）信号收集和光电转换系统荧光素分子荧光素分子激发波长激发波长(nm)发射发射光波光波(nm)中文名中文名488525异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素488575藻红蛋白藻红蛋白488677多甲藻黄素多甲藻黄素-叶绿素叶绿素-蛋白质蛋白质 复合物复合物633/635660别藻蓝蛋白别藻蓝蛋白4
13、88670藻红蛋白藻红蛋白-花青素花青素5488755藻红蛋白藻红蛋白-花青素花青素7488710（三）荧光信号（三）荧光信号常用荧光素常用荧光素（三）信号收集和光电转换系统能量传递能量传递染料染料 (PE-Cy5 PE-Cy7 PerCp-Cy5.5)用用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在在488nm488nm波长激发光激波长激发光激发后产生的发射波长激发另一发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生荧光信号荧光染料产生荧光信号，最终检测第二荧，最终检测第二荧光染料发射的特定荧光信号光染料发射的特定荧光信号（三）荧光信号（三）荧光信号（三）信号
14、收集和光电转换系统（三）荧光信号（三）荧光信号（三）信号收集和光电转换系统目前常用目前常用FCM配置（配置（BD Calibar）488nm激光管常用染料有激光管常用染料有第一通道（第一通道（FL1）：）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate)第二通道（第二通道（FL2）：）：PE (Phycorey-thrin)第三通道（第三通道（FL3）：）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein)PE-Cy7、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5633nm激光管常用染料有激光管常用染料有第四通第四通道（道（FL4）：）：APC多色标记荧光素搭
15、配多色标记荧光素搭配原则原则 每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配 FACSCalibur常用四色搭配：常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APCFL-AFL-HFL-W面积（面积（A）：荧光总量）：荧光总量高度（高度（H）：最大荧光强度）：最大荧光强度宽度（宽度（W）：细胞直径）：细胞直径光信号到电脉冲信号光信号到电脉冲信号FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统流式细胞仪信号检测系统（四）计算机和分析系统FCM数据显示方式数据显示方式单参数直方图单参数直方图(Histogram)双参数数据显示：双
16、参数数据显示：散点图散点图(Dot Plot)伪彩图伪彩图(Pseudo-color Plot)等高线图等高线图(Contour Plot)密度图密度图(Density Plot)假三维图假三维图(Pseudo 3D Plot)三维图三维图(3D Plot)常用分析软件常用分析软件 CellQuest Diva FlowJO WinMDI FCS Express直方图（直方图（Histogram）细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数射光信号相对强度的值，单位是道数，纵
17、坐标一般是细胞数Event#FL1 FITC110270037204150101102103CountsFITC荧光强度荧光强度（四）计算机和分析系统直方图（直方图（Histogram）（四）计算机和分析系统横坐标既可以是线性的，也可以是对数的横坐标既可以是线性的，也可以是对数的DNA倍体分析倍体分析抗原表达分析抗原表达分析Overlay图图散点图散点图(Dot Plot)（四）计算机和分析系统散点图中每个点代表一个细胞，散点图中每个点代表一个细胞，X轴与轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观直方图直观FL1FL2散点图散点图(Dot Plot)（四）计算机和
18、分析系统 散点图散点图 伪彩图伪彩图等高图和等密度图等高图和等密度图（四）计算机和分析系统等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。里面的曲线代表细胞数目越多。密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。（四）计算机和分析系统假三维图和三维图假三维图和三维图SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC CD45 CD14 门门(Gate，简写，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，是流式细胞术中的一个重要
19、术语，FCM数据分析过程数据分析过程实际上就是选门和设门的过程实际上就是选门和设门的过程椭圆形椭圆形圆形圆形设门与数据分析设门与数据分析（四）计算机和分析系统矩形矩形任意形状任意形状R(Region，区域，区域)：门可以是单一区域门可以是单一区域(G=R1)，也可以是几个区域组合，也可以是几个区域组合在一起：在一起：G=R1 and R2;G=R1 or R2;G=R1 not R2（四）计算机和分析系统十字门十字门线性门线性门（四）计算机和分析系统流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的粒的结构
20、及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分析或纯化析或纯化分选分选细胞细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量定量流式细胞仪特点目前国内主要流式细胞仪厂家目前国内主要流式细胞仪厂家Beckton Dickinson(BD)BACKMAN COULTEREpics XL 单激光四色，分析型CyAn三激光九色，分析型FC 500 单激光或双激光五色，市场覆盖率较高，分析型Gallios 三激光十色，分析型MoFlo XDP 高端分选型Beckman Coulter公司
21、流式细胞仪公司流式细胞仪BD公司分析型流式细胞仪公司分析型流式细胞仪FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高FACS Canto II 双激光六色，三激光八色FACS Verse双激光六色，三激光八色AccuriC6 双激光四色BD公司分析型流式细胞仪公司分析型流式细胞仪LSRFortessa X-20 五激光十八色，分析型最高配LSR II 双激光六色，三激光八色，四激光十色FACSVantage SEFACSAria IIIInfluxBD公司分选型流式细胞仪公司分选型流式细胞仪BD FACS Canto II 双双激光或激光或三三激光激光，8色色分析分析 八角形八角形/三角形
22、光信号接受系统，利用三角形光信号接受系统，利用全反全反射的光路射的光路结构设计，避免透射过程对光信号结构设计，避免透射过程对光信号的损耗的损耗，提高提高荧光灵敏度荧光灵敏度 兼顾兼顾科研需求科研需求和和临床临床检测检测BD FACSTM 7-color setup beads使使体外体外诊诊断断中中所有实验的日常仪器设置在一管所有实验的日常仪器设置在一管中进行中进行专门专门配备有配备有FACSCanto临床软件临床软件，淋巴细，淋巴细胞胞亚群，亚群，HLA-B27等临床自动检测和分析等临床自动检测和分析软件，软件，直接报告检测直接报告检测结果结果独立独立液流车系统液流车系统，保持液流的稳定，保
23、持液流的稳定 最小样本量：最小样本量：30微升微升手动上样手动上样/自动连续上样自动连续上样获得获得SFDA认证认证BD LSRFortessa X-20 提供提供5激光激光，18色分析色分析 18种波长的激光器，横跨从种波长的激光器，横跨从紫紫外到红外全外到红外全光谱范围光谱范围，提供，提供灵灵活的光谱活的光谱选择选择 满足高端满足高端科研需求科研需求 淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群 HLA-B27 CD55、CD59检测检测 CD34造血干细胞计数造血干细胞计数 白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型 TH1/TH2细胞检测细胞检测 血小板活化血小板活化 炎症感染指标炎症感染指标CD64
24、网织红细胞网织红细胞/血小板检测血小板检测 微小残留病灶（微小残留病灶（MRD）肿瘤细胞倍体（肿瘤细胞倍体（DNA）细胞凋亡细胞凋亡 流式细胞术的临床应用 标本的种类标本的种类：血液血液、骨髓穿刺液、各种体液（胸水、骨髓穿刺液、各种体液（胸水、腹水腹水、脑脊液）、组织（如、脑脊液）、组织（如淋巴淋巴 结结、肝、脾）及肺泡灌洗液、肝、脾）及肺泡灌洗液等等 抗凝剂：抗凝剂：外外周血周血：EDTA、肝素肝素和和枸橼酸枸橼酸均均可可 骨髓骨髓：肝素肝素（推荐）、（推荐）、EDTA 血小板血小板：枸橼酸枸橼酸 储存时间：储存时间：EDTA：2448h 肝素肝素：4872h 枸橼枸橼酸酸：72h 严重严重
25、溶血、凝血或坏死溶血、凝血或坏死的样本的样本应弃用应弃用单细胞悬液单细胞悬液标本要求试剂试剂：BD Multitest IMK Kit标本标本：外周血（常用：外周血（常用）配色配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC CD3-FITC/CD19-PE/CD45-PerCP/CD16CD56-APC检测检测指标指标：T细胞（细胞（CD3+CD4+、CD3+CD8-）B细胞（细胞（CD19）NK细胞（细胞（CD3-CD1656）临床临床意义意义反应体内反应体内免疫状态免疫状态 CD4+T降低：病毒感染、恶性肿瘤、免疫缺陷病、免疫抑制剂使用降低：病毒感染、恶性肿瘤、
26、免疫缺陷病、免疫抑制剂使用 CD8+T增高：病毒及增高：病毒及结核杆菌结核杆菌感染，自身免疫性疾病活动期、肿瘤、感染，自身免疫性疾病活动期、肿瘤、慢性活动性肝炎慢性活动性肝炎 CD4/CD8降低：降低：处于免疫抑制状态处于免疫抑制状态免疫缺陷病：如免疫缺陷病：如艾滋病时的比值常显著小于艾滋病时的比值常显著小于0.5某些恶性肿瘤：如肝癌、食道癌、肺癌、膀胱癌等某些恶性肿瘤：如肝癌、食道癌、肺癌、膀胱癌等某些病毒某些病毒感染：感染：HBV、EB、CMV等等 NK细胞（细胞（CD3CD16+和和/或或CD56+）能够介导对某些肿瘤细胞和病毒）能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性感染细胞的细
27、胞毒性作用作用 HIV感染者感染者试剂试剂：BD HLA-B27 Kit 标本标本：外周血：外周血检测指标检测指标：T(CD3+)淋巴细胞上淋巴细胞上HLA-B27定性定性检测检测临床意义临床意义：强直性脊柱炎强直性脊柱炎（高度高度相关，相关，90%）Reiters 综合征（综合征（70-90%）银屑病关节炎银屑病关节炎（50-60%）急性前急性前葡萄膜炎（葡萄膜炎（40-50%）试剂试剂：CD59-FITC、CD55-PE 标本标本：外周：外周血血检测检测指标指标：CD55、CD59百分比百分比 CD55、CD59荧光强度荧光强度阵发性睡眠性血红蛋白尿症（阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的
28、发病机制为）的发病机制为X染色体上的染色体上的PIG-A基因发生突基因发生突变，引起糖化肌醇脂（变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成障碍，使）锚合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的锚连蛋白缺乏，已证实的GPI锚锚连蛋白有连蛋白有10余种，用于余种，用于PNH诊断的主要为诊断的主要为CD55和和CD59两种，如果在红细胞上出两种，如果在红细胞上出现现CD55或或/和和CD59的减少的减少，可诊断为，可诊断为PNHNormalPNH试剂试剂：BD Procount Progenitor Cell Enumeration Kit标本标本：骨髓、动员后的外周：骨髓、动员后的外周血血配色配色：CD34
29、-PE、CD45-PerCP、nucleic acid dye检测指标检测指标：CD34及浓度及浓度蓝色蓝色荧光微球（数量已知）；荧光微球（数量已知）；红色红色CD34细胞细胞干细胞特征：干细胞特征：CD45表达弱表达弱阴性阴性(R2)CD34表达弱表达弱强强(R4)DNA/RNA含量多，染色性较强含量多，染色性较强(R1)大小（大小（FSC）和颗粒度（）和颗粒度（SSC）淋巴细胞相似）淋巴细胞相似临床意义临床意义：血液血液系统疾病的造血干细胞移植系统疾病的造血干细胞移植 数量数量的检测的检测 采集采集时机的确定时机的确定 试剂试剂：各种单克隆荧光抗体：各种单克隆荧光抗体标本标本：骨髓、外周血
30、、胸腹水、脑脊液、：骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、淋巴组织淋巴组织分型方案分型方案：CD45设门，四色标记，设门，四色标记，临床意义临床意义：客观、快速地分析客观、快速地分析 确定确定异常细胞系来源及分化阶段异常细胞系来源及分化阶段 判断判断预后预后正常骨髓细胞正常骨髓细胞CD45/SSCR1:淋巴细胞淋巴细胞R2:幼稚细胞幼稚细胞R3:单核细胞单核细胞R4:中性粒细胞中性粒细胞R5:有核红细胞有核红细胞R2占占94，表达表达CD33,CD34,CD117,CD71,CD13,CD64,MPOR2占占65，表达表达CD79a,CD19,CD34,CD22,CD10,CD38,HLA-DR临床意
31、义临床意义：CD4/CD8 结节病结节病 特发性肺间质纤维化特发性肺间质纤维化 肺部肿瘤疾病肺部肿瘤疾病CD4/CD85.04Th1，抗胞内病原体，抗胞内病原体 迟发型超敏反应、炎症迟发型超敏反应、炎症 IL-2、IFN-、TNF-介导介导细胞免疫细胞免疫 CD4+TTh1/Th2Th2，蠕虫感染，蠕虫感染 环境变应原的应答环境变应原的应答 IL-4、IL-5、IL-10等等 介导介导体液免疫体液免疫细胞细胞内细胞因子表达内细胞因子表达 IFN-（Th1）和）和IL-4（Th2）检测检测前需要刺激活化（前需要刺激活化（PMA+ionomycin）46h Golgistop，含有莫能霉素（，含有
32、莫能霉素（Monensin）设设门策略：门策略：CD3+CD8-CD64：FC受体受体 单核细胞单核细胞（）（）中性粒细胞中性粒细胞（dim）淋巴细胞淋巴细胞（）（）检测指标检测指标：中性粒细胞：中性粒细胞CD64表达强度表达强度 CD64指数指数CD64中性粒中性粒/CD64淋巴淋巴临床意义临床意义：细菌感染、脓毒血症、败血症：细菌感染、脓毒血症、败血症CD45CD64CD64CD64CD64CBA：可溶性蛋白可溶性蛋白：血清血清中细胞因子中细胞因子 荧光微球连结特异抗体荧光微球连结特异抗体 不同荧光强度不同荧光强度 多个检测指标多个检测指标标本标本：血清、血浆、培养液、各种体液：血清、血浆、培养液、各种体液思考题1、FSC和和SSC分别分别反应了细胞的什么特点？分别分别反应了细胞的什么特点？2、外周血淋巴细胞亚群分析的临床意义？、外周血淋巴细胞亚群分析的临床意义？
