1、第九章 维生素的测定 第一节第一节 概概 述述第二节第二节 脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的测定第三节第三节 水溶性维生素的测定水溶性维生素的测定 第一节 概 述第九章 维生素的测定 维生素的结构复杂：有的属于：胺类（为有的属于：胺类（为B1）醛类（为醛类（为B6）醇类（为醇类（为A）酚酚 醌类醌类 化合物等化合物等维生素都具有以下共同特点：维生素都具有以下共同特点：1.这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；在；2.它们不能供给机体热能。也不是构成组织的基它们不能供给机体热能。也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代本原料，主要
2、功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；谢过程，需要量极小；3.它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；生理需要，必须经常从食物中摄取；4.长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。v维生素A缺乏时的具体表现为：(1)影响视觉，眼睛的结膜、角膜干燥，暗适应减弱，乃至夜盲。(2)皮肤干燥、脱屑，上皮组织改变，腺体分泌减少。(3)免疫力降低，反复呼吸道感染、腹泻。(4)头发干枯、易断，指甲无光泽。(5)牙质萎缩，骨骼发育不良。(6)味觉、嗅觉不佳、食欲差，生长发育停滞。(7)
3、影响智力发育。v维生素维生素b1又称硫胺素，为水溶性维生素。作用 神经传导、脂肪、碳水化合物和酒精的代谢、能量代谢（作为a酮酸脱羧酶及转酮基酶的辅酶）。v缺乏症：轻度缺乏可引起疲乏、头痛、食欲下降、恶心、便秘、烦躁易怒及注意力下降等症状；而重度缺乏则导致抑郁、记忆力差、肌肉软弱无力、神经麻木及烧灼 感、进行性麻痹等不适。食入过多 无害。v食物来源：奶及奶制品、肉、全麦面包、谷类（粗米）、家禽、坚果类（如栗子）。维生素维生素b2又称核黄素，为水溶性维生素。作用 作为氧化还原酶类的辅酶，参与体内许多代谢和能量产生过程中的氧化还原反应，如参与葡萄糖、某些氨基酸和脂肪的氧化过程，为机体提供热能。缺乏症
4、：早期出现畏光、视物模糊、眼睛烧灼和痒感，口角疮、舌面光滑并呈鲜红色。病势进展，角膜血管充血、角膜溃疡、生长障碍。多与其它b族维生素缺乏同时出现。测定食品中维生素的含量的意义测定食品中维生素的含量的意义 1、评价食品的营养价值，评价食品的营养价值，v2、寻找富含维生素的食品资源，寻找富含维生素的食品资源，v3、指导人们合理调整膳食结构，防止维生指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生素中毒，素缺乏症或维生素中毒，v4、研究维生素在食品加工、贮存等过程中研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的加工工艺及的稳定性，指导人们制定合理的加工工艺及贮存条件，贮存条件，v5、
5、监督维生素强化食品的强化剂量，防止监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引起维生素中毒因摄入过多而引起维生素中毒维生素的分类维生素的分类按维生素溶解性能可将它们分成两大类：按维生素溶解性能可将它们分成两大类：脂溶性维生素（如脂溶性维生素（如A A、D D、E E、K K等）；等）；水溶性维生素（如水溶性维生素（如B B1 1、B B2 2、B B6 6、C C、B B1212等）。等）。v 溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K 各小类，其共同特点共同特点：是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒；由于由于可储藏在脂肪中，故不需每
6、天供给。可储藏在脂肪中，故不需每天供给。v 溶于水，包括B、C 各小类，其共同特共同特点：点：是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都能从机体排出。需要每天供给。需要每天供给。维生素的命名v1、多根据发现的时间顺序以英文字母排序，多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生素如维生素A、维生素、维生素B1、B2，维，维 生生 素素C，维生素维生素E等。等。v 2、也有根据特定生理功能，如抗干眼病也有根据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸、生育酚等，因子、抗坏血酸、生育酚等，v 3、按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、烟酸、叶酸等。烟酸、叶酸等。v二类维生素的分
7、布见表101。P249v表101 维生素的类别在这二类中与我们最密切，而且了解最多的有：在这二类中与我们最密切，而且了解最多的有：维生素维生素A A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜炎、夜是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜炎、夜盲症等疾病。盲症等疾病。维生素维生素B B1 1：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经炎，也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经炎，帮助消化，促进发育。帮助消化，促进发育。维生素维生素B B2 2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。维生素维生素C C：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗
8、力。防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。维生素维生素D D：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的代谢，调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的代谢，并能防止软骨病。并能防止软骨病。维生素的分析方法：v维生素测定的标准方法及代号v脂溶性维生素：标准测定法v胡萝卜素：HPLC GB/T5009.83-2003(第一国标法)纸层析 法(色谱)GB/T5009.83-2003(第二国标法)v维生素A、维生素E-HPLC GB/T5009.82-2003v维生素A -比色法 GB/T5009.82-2003 v维生素D -比色法 GB/T5413.9-1997 v -HPLC 此两法是
9、AOAC选定的正式方法v水溶性维生素：标准测定法v维生素B1-荧光法 GB/T5009.84-2003v维生素B2-荧光法 GB/T5009.885-2003v总维生素C-荧光法 GB/T5009.86-2003(第一国标法)v总维生素C-2.4-二硝基苯肼法(GB/T5009.86-2003(第二国标法)v保健食品中盐酸硫胺素、吡哆醇、烟酰胺测定-GB/T5009.197-2003 VA、VD、VE、与类脂物一起存于食物中，摄食时与类脂物一起存于食物中，摄食时一道被人体吸收，可在体内积贮。一道被人体吸收，可在体内积贮。一、脂溶性维生素理化性质：一、脂溶性维生素理化性质：1溶解性：溶解性：脂溶
10、性维生素不溶于水，易溶于脂肪、脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。2耐酸碱性：耐酸碱性：维生素维生素A、D对酸不稳定，对酸不稳定，对碱稳定；对碱稳定；维生素维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。体保护下，也能经受碱的煮沸。第二节 脂溶性维生素的测定 3耐热性、耐氧化性：耐热性、耐氧化性：耐热性耐热性 氧化性氧化性VA 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 易被氧化易被氧化（光、热促进其（光、热促进其 氧化）氧化）V D 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 不易被
11、氧化不易被氧化 V E 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 在空气中能慢慢被氧化在空气中能慢慢被氧化 （光、热、碱促进其氧化）（光、热、碱促进其氧化）根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常：根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常：样品样品 皂化皂化 提取脂溶性维生素提取脂溶性维生素(不皂化物不皂化物)浓缩浓缩 溶于适当的溶剂溶于适当的溶剂 测定。测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂化剂(如如焦性没食子酸、维生素焦性没食子酸、维生素C等等)。对于对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂
12、化提取后，还需进行层析分离。提取后，还需进行层析分离。分析操作一般要在避光条件下进行。v二、二、胡萝卜素的测定胡萝卜素的测定 P260v特性：胡萝卜素对酸、碱、热稳定，易光解、氧化，测定时避光防氧化。v胡萝卜素是一种色素，在 =450nm波长处有最大吸收，-比色。v 测定的关键是：分离v分离的方法二种：v 纸层析法-GB123891990 标准分析法v 溶剂萃取法v纸层析法：v原理：v 胡萝卜素为脂溶性维生素易溶于有机溶剂中，以丙酮和石油醚提取食物中的，胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂(流动相)进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素斑点的滤纸，用
13、石油醚溶解而后在450nm比色测定。v操作：v(1)样品提取与洗涤v 粮食：直接磨粉v 蔬菜等植物性食品：打成匀浆v取适量样品用有机溶剂(丙酮、石油醚)反复提取,用100ml 5%的硫酸钠洗涤，弃去水层。v植物油和高脂肪样品：提取色素前需要先经50KOH 脱醛乙醇溶液进行皂化处理，皂化液用石油醚反复提取，最后用水洗涤至中性。v(2)浓缩与定容v 将石油醚提取液经无水硫酸钠滤入旋转蒸发器的球形蒸发瓶内，用约少量石油醚冲洗漏斗及无水硫酸钠3次，洗液并入蒸发瓶内，减压蒸馏，回收石油醚。待瓶中剩下约2ml石油醚时，取下蒸发瓶，用氮气冲干。立即加入2.00ml石油醚定容。v(3)纸层析v 按纸层析要求点
14、样与层析，国标法中推荐层析剂为石油醚，待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，剪下胡萝卜素层析带，用石油醚洗脱后，供比色测定。v操作:v点样：v滤纸及点样规格：18*30cmv在滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点。v采用带状点样：吸取 0.1000.400ml样品浓缩液，在AB两点之间和CD两点之间迅速来回进行带状点样，一次点完。v展开：v 将纸上所点样液自然挥发至干后，将滤纸卷成圆筒状，将两边连接，基线处于纸筒底端，置于预先用石油醚饱和过的层析缸内，上行展开。v洗脱：待胡萝卜素与其他色素分离后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，剪下胡萝卜素(色斑)层析
15、带，快速用石油醚溶解，然后，供比色测定。v(4)比色与含量计算v国标法采用1cm 比色杯，于450nm 波长下测吸光度，从标准曲线上查出 胡萝卜素含量，再计算出样品中胡萝卜素含量（以胡萝卜素计）。v(5)标准曲线的绘制v讨论讨论:v1此法为国家标准方法，方法简便，色带清晰，最小检出限为0.11ug。v2样品的提取和标准液的制备一定要注意避免丢失。v3浓缩提取液时，一定要防止蒸干，胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏，所以定容、点样、层析后剪样点等操作环节一定要迅速。v4纸层析法、柱层析法均不能区分、和胡萝卜素，虽然标准品为胡萝卜素，但实际结果为总胡萝卜素。由于天然食品中大部分为胡萝卜
16、素，故对结果影响不大。补充：溶剂萃取法补充：溶剂萃取法用95%乙醇(液固萃取)萃取所有色素用石油醚萃取用石油醚萃取45次次 胡萝卜素用分液漏斗用分液漏斗+石油醚，石油醚，23ml 23%硫酸钠硫酸钠(增大乙醇极性增大乙醇极性)充分振荡充分振荡 静止分层静止分层 取石油醚萃取液取石油醚萃取液+甲醇萃取甲醇萃取2次次蒸馏水萃取蒸馏水萃取 加无水硫酸钠加无水硫酸钠 石油醚定容石油醚定容 450nm比色测定比色测定注意：容量瓶应为棕色，以防注意：容量瓶应为棕色，以防胡萝卜素的光分解。石油醚易挥发，比色杯应盖盖。缺点：操作麻烦，稳定性不好，但方便。缺点：操作麻烦，稳定性不好，但方便。此时为白色上层：胡萝
17、卜素+石油醚(金黄色)下层：乙醇除叶黄素除残留乙醇脱水作用 三、维生素三、维生素A A的测定的测定 目前维生素目前维生素A A都是合成的，来源：都是合成的，来源：（1 1）从动物肝脏中得到；）从动物肝脏中得到；（2 2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是萝卜素，主要是-胡萝卜素）胡萝卜素）维生素维生素A A的测定常用的方法有的测定常用的方法有:三氯化锑比色法三氯化锑比色法 紫外分光光度法紫外分光光度法 荧光分析法荧光分析法 液相色谱法。液相色谱法。第九章 维生素的测定 1 1、维生素、维生素A A的性质的性质 因有许多不饱和链，
18、故见光易分解；因有许多不饱和链，故见光易分解；在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。对碱稳定。对碱稳定。2 2、测定步骤、测定步骤 样品用有机溶剂萃取脂类样品用有机溶剂萃取脂类 即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。热苯回流方法提取脂类。脂类的皂化脂类的皂化 脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化（50%50%KOHKOH、无水无水C C2 2H H5 5OHOH、热回流）把它们分开，热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。得到一部分皂化物和一部分不
19、皂化物。提取：提取：不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。可得到不皂化物。柱层析分离干扰物质柱层析分离干扰物质 采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把把-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A A与与-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。如果样品中只有维生素们分离开。如果样品中只有维生素A A而不含而不含-胡萝卜素时，这时可直接定容。胡萝卜素时，这时可直接定容。维生素维生素A A与与-胡萝卜素分离：胡萝卜素分离：吸附剂：吸附剂：8 8分中性分中性A
20、lAl2 2O O3 3和和2 2分碱性分碱性AlAl2 2O O3 3混合，混合，装柱装柱 分离方法：分离方法：a.a.用用2%2%丙酮石油醚洗丙酮石油醚洗-胡萝胡萝卜素；卜素；b.b.用乙醚洗用乙醚洗V VA A。3 3、测定方法、测定方法 S Sb bClCl3 3比色法比色法 维生素维生素A ACHClCHCl3 3 S Sb bClCl3 3CHClCHCl3 3形成兰色形成兰色物质物质在在620620nmnm有最大吸收峰有最大吸收峰 这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准质，所以在分析时最好在暗室
21、中进行，并且做标准曲线。曲线。计算：计算：每百克样品含每百克样品含V VA A的量的量=C C（V1/V2V1/V2）（100/W100/W）C C：从标准曲线上查得从标准曲线上查得V VA A的量的量 V V1 1 ：CHCl CHCl3 3定容的量定容的量 V V2 2：测定所取样液体积测定所取样液体积 紫外分光光度法紫外分光光度法 a.a.原理：原理：V VA A为脂溶性的，测定为脂溶性的，测定V VA A时必须先将时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在紫部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在紫外外
22、328328nmnm下测定，求出含量。下测定，求出含量。b.b.测定方法测定方法 1 1）提取及皂化提取及皂化:称样称样10.0010.00g g 于烧杯中于烧杯中 加加4040mlml水搅匀水搅匀 移移250250mlml分液漏斗中分液漏斗中 加氨水加氨水5 5ml ml 加乙醇加乙醇3535ml ml 摇匀摇匀 用乙醚抽提（每次用乙醚抽提（每次4040mlml抽提三次）抽提三次）收集乙醚层收集乙醚层 用用1010mlml水洗乙醚层水洗乙醚层三次三次 水层再用水层再用3030mlml乙醚抽提一次乙醚抽提一次 合并所用乙合并所用乙醚醚 用索氏法除乙醚用索氏法除乙醚 待瓶中乙醚除尽后待瓶中乙醚除
23、尽后 加加3030ml80%ml80%的的KOH 40mlCKOH 40mlC2 2H H5 5OH OH 加加0.80.8g g焦性没食子焦性没食子酸酸 83 83水浴水浴3030分钟（皂化脂肪）分钟（皂化脂肪）冷却后移入冷却后移入250250mlml分液漏斗中分液漏斗中 加加6060mlml水水 用用4040mlml乙醚抽提乙醚抽提三次三次 合并乙醚抽提液合并乙醚抽提液 用水洗至中性用水洗至中性 用索用索氏法除乙醚氏法除乙醚 除去后用除去后用5 5mlml石油醚溶解瓶中内容物石油醚溶解瓶中内容物 然后移入刻度试管中然后移入刻度试管中 2 2）层析）层析 在层析柱内装在层析柱内装8 8cmc
24、m高度中性氧化铝高度中性氧化铝 2 2cmcm高度碱性高度碱性氧化铝及氧化铝及1 1cmcm无水硫酸钠无水硫酸钠 以石油醚浸透以石油醚浸透 装皂化装皂化后的样液慢慢于柱内后的样液慢慢于柱内 用用1 12 2mlml石油醚洗试管石油醚洗试管 洗洗液倒入柱内，活塞打开以每分钟为液倒入柱内，活塞打开以每分钟为3535滴左右的速度打开，滴左右的速度打开，当液面降到接近硫酸钠时当液面降到接近硫酸钠时 加加5 5mlml石油醚石油醚 随后用随后用5 5mlml洗脱液逐次洗涤。洗脱液逐次洗涤。层析柱上第一个黄色层析层，一般是层析柱上第一个黄色层析层，一般是-胡萝卜素，胡萝卜素，此带在此带在12%12%洗脱液
25、前后洗去，收集于洗脱液前后洗去，收集于1010mlml容量瓶中直到容量瓶中直到流出物不呈黄色为止，此层可测流出物不呈黄色为止，此层可测-胡萝卜素用，而胡萝卜素用，而V VA A一般在一般在50%50%洗脱液洗出，用洗脱液洗出，用2 2mlml刻度吸管收集刻度吸管收集1 1mlml。吸约吸约0.20.2mlml于小试管中于小试管中加加0.30.3ml25%ml25%三氯化锑三氯化锑溶液如呈兰溶液如呈兰色色表明有表明有V VA A存在，故存在，故0.50.5mlml用石油醚定容用石油醚定容1010mlml。水溶性维生素包括：维生素B1(硫胺素)维生素B2（核黄素）维生素B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺
26、）维生素PP（烟酸）叶酸、泛酸（维生素B3）生物素（维生素B7）维生素C 等，广泛存在于动植物组织中，在食物中常以辅酶的多种形式存在，满足组织需要后，多余的量都能从机体排出。v 水溶性维生素都易溶于水,v 不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。v 在酸性介质中很稳定，即使加热也不破坏；v 但在碱性介质中不稳定，如果同时加热，更易于破坏或分解。v 它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响。v维生素B2 对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；v维生素C 对氧、铜离子敏感，易被氧化。v测定水溶性维生素时，一般多在酸性溶液中进行前处理。v维生素B1、B2 通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等
27、酶解作用，使结合态维生素游离出来，再进行提取。v 维生素C 通常用：草酸、草酸-醋酸、偏磷酸-醋酸溶液直接提取。v 维生素C 既具有有机酸的性质，也具有还原剂的性质。v 草酸价廉，使用方便，对维生素C 有很好的稳定作用；v 偏磷酸：不稳定，只能保存710 天，价格较贵，溶解费时，但它能沉淀蛋白质，澄清提取液，适合于蛋白质含量高的样品。第三节第三节 水溶性维生素的测定水溶性维生素的测定 一、维生素一、维生素B B1 1的测定的测定 V VB1B1又叫硫胺素、抗神经炎素。又叫硫胺素、抗神经炎素。1 1、食品中、食品中V VB1B1的存在形式的存在形式 常以游离态存在；常以游离态存在；复合脂形式存在
28、（磷蛋白）；复合脂形式存在（磷蛋白）；辅羧酶形式存在。辅羧酶形式存在。第九章 维生素的测定 2 2、V VB1B1的性质的性质 V VB1B1在中性、碱性下不稳定，易分解；在中性、碱性下不稳定，易分解；V VB1B1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；V VB1B1为白色结晶，微溶于为白色结晶，微溶于C C2 2H H5 5OHOH，不溶于乙醚或不溶于乙醚或CHClCHCl3 3，易溶于水。易溶于水。3 3、V VB1B1的测定的测定 -荧光法测定荧光法测定 原理：原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种兰色荧光物质，
29、即为硫色素，在紫外氧化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在紫外光下，硫色素发出荧光。光下，硫色素发出荧光。测定方法测定方法 萃取萃取 100 100g g样品于干燥烧杯中，加入样品于干燥烧杯中，加入100100ml0.1N ml0.1N H H2 2SOSO4 4，打成匀浆，煮沸打成匀浆，煮沸3030分钟，称取一定的样分钟，称取一定的样品经高压锅品经高压锅121121、2020分钟高压酸解分钟高压酸解 水解水解 在酸解的样品中冷却后加入含有在酸解的样品中冷却后加入含有10%10%糖化酶糖化酶的的1010ml2.5MNaAml2.5MNaAC C溶液，摇匀，用溶液，摇匀，用15%15%NaOHNa
30、OH调调PH=4.5PH=4.5，用淀粉酶使淀粉水解，也可用磷酸酶用淀粉酶使淀粉水解，也可用磷酸酶使淀粉水解，于使淀粉水解，于5050恒温箱中恒温箱中1212小时小时 纯化（采用柱层析提纯）纯化（采用柱层析提纯）吸附剂采用的是人造浮石。人造浮石用吸附剂采用的是人造浮石。人造浮石用25%25%KClKCl溶液分数次洗涤，主要是把溶液分数次洗涤，主要是把V VB1B1吸附上去，吸附上去，吸附上去后，再用热水淋洗，最后用吸附上去后，再用热水淋洗，最后用25%25%KCl-HAKCl-HAC C把把V VB1B1洗脱下来，这样就得到纯洗脱下来，这样就得到纯V VB1B1，再根据上面的原再根据上面的原理
31、在碱性下分析。理在碱性下分析。分析分析装填柱子（离子交换柱）装填柱子（离子交换柱）提纯提纯 氧化氧化 测定测定 二、维生素二、维生素C C的测定的测定 维生素维生素C C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸。用，所以被人们称做抗坏血酸。VcVc广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。等食品中含量较多。VcVc具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为称为脱氢抗
32、坏血酸脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性，仍然具有生理活性，进一步进一步水解水解则生成则生成2，3二酮古乐糖酸，失去生理作用。二酮古乐糖酸，失去生理作用。食品分析中的所谓总抗坏血酸是指：抗坏血酸和食品分析中的所谓总抗坏血酸是指：抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量。脱氢抗坏血酸二者的总量。不包括二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。不包括二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。OOOHOHHOCHCH2OHOOOHOCHOCH2OHOHOOOHHOHCH2OHOH氧氧化化氧氧化化还原型抗坏血酸还原型抗坏血酸 脱氢抗坏血酸脱氢抗坏血酸 2，3二酮古乐糖酸二酮古乐糖酸 维生素维生素C C（还原型）纯品为白色无臭结晶，还
33、原型）纯品为白色无臭结晶，熔点熔点190190192192，溶于水或乙醇中溶于水或乙醇中，不溶于油剂。，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，解，在弱酸条件中较稳定在弱酸条件中较稳定，维生素维生素C C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成理作用）。如果进一步水解则生成2 2，3-3-二酮二酮古乐糖酸，失去生理作用。古乐糖酸，失去生理作用。根据它具有的还原性质可以测定维生素根据它具有的还原性质可以测定维生素C C的含量。的含量。常用的测定方法有：常用的测定方法有：（1 1）荧光分光光度法）荧光
34、分光光度法(第一法第一法)（2 2）2 2，4-4-二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法 （总（总V VC C）(第二法第二法)碘量法碘量法 （3 3）2 2，6-6-二氯靛酚法二氯靛酚法 （还原型（还原型V VC C）（4 4）电位法）电位法 （5 5）高效液相色谱法）高效液相色谱法 HPLCHPLC v(一一)荧光法荧光法v一、原理v 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化生成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成具有荧光的喹喔啉。在一定条件下，喹喔啉的荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。v一定条件：激发光：338nmv 发射光：420nm（二）（二）2 2
35、，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 GB/T 5009.862003 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法第二蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法第二法法 可测总抗坏血酸。可测总抗坏血酸。总抗坏血酸包括：总抗坏血酸包括：还原型还原型 脱氢型脱氢型 二酮古乐糖酸型。二酮古乐糖酸型。此法是将样品的此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸坏血酸，然后与，然后与2 2，4-4-二硝基苯肼作用，生成红色的二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中
36、总硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总VcVc。1 1、原理：、原理：用酸处理过的活性碳把还原型的抗坏血用酸处理过的活性碳把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，酸氧化为脱氢型抗坏血酸，再与再与2，4二硝基苯肼二硝基苯肼作用，生成红色的脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量作用，生成红色的脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。成正比，进行比色测定。在硫酸溶液中显色稳定，在硫酸溶液中显色稳定，520nm波长处有最大吸波长处有最大吸收。收。2 2、测定步骤、测定步骤 样品提取样品提取 同同2，6-二氯靛酚滴定法 (2)(2)氧化处理氧化处理：取取25ml25ml样品滤液样品滤液 +2g+2
37、g活性炭活性炭 振摇振摇1min1min 过滤过滤收集滤液收集滤液 +2%+2%硫脲硫脲10ml(10ml(目的：防止目的：防止VcVc继续氧化继续氧化)(3)(3)显色反应显色反应:取三支试管，每支试管都加入上述氧化稀释液4mL。其中一支试管作空白，另两只试管各加入1.0mL22，4二硝基苯肼溶液，将三支试管放入（370.5）恒温箱或水浴中准确保温3h。取出试管放入冰水中。v空白管冷至室温后加入0.1mL22，4二硝基苯肼溶液，1015min 后也放入冰水中。v向每支试管滴加 5mL85硫酸，边加边摇动，滴加时间至少需要1min。加完硫酸后将试管从冰水中取出，室温下准确放置30min 后立即
38、比色。v v(4)(4)比色比色:用1cm 比色杯以空白液调零点，于500nm 波长下测吸光值。(5)(5)标准曲线的绘制标准曲线的绘制 取取5个个50ml容量瓶编号容量瓶编号 1 2 3 4 5 加加VC标准液标准液 10 20 30 40 50ml 取取5个比色管取相应个比色管取相应 2 2 2 2 2 加硫脲溶液（滴）加硫脲溶液（滴）1 1 1 1 1 2，4-二硝基苯肼（二硝基苯肼（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 于于3737保温箱保温箱3 3小时，取出于冰浴中，然后滴加小时，取出于冰浴中，然后滴加85%85%硫酸硫酸5 5mlml取出放取出放3030分钟分钟在在5405
39、40nmnm下下,测各消光值绘标准曲线，同测各消光值绘标准曲线，同时做空白。时做空白。计算：计算：每百克食品中抗坏血酸的毫克数每百克食品中抗坏血酸的毫克数=C/W C/W*100100（三）（三）2 2，6-6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法1 1、原理：、原理：v1，还原型还原型Vc能定量地还原能定量地还原2、6-二氯靛酚（染料）二氯靛酚（染料）v2，2、6-二氯靛酚在中性或碱性溶液中显蓝色，在酸性溶液二氯靛酚在中性或碱性溶液中显蓝色，在酸性溶液中显粉红色；被还原后不显色。中显粉红色；被还原后不显色。OOHOHHOHHCH2OHO+ONClClOHOOOHOHOHCH2OH+OClClNOHH
40、还原型还原型Vc 染料（显色）染料（显色）氧化型氧化型Vc 被还原的染料（不显色）被还原的染料（不显色）2 2、试剂、试剂 1%1%草酸溶液：称取草酸溶液：称取1010g g草酸，加水至草酸，加水至10001000mlml；2%2%草酸溶液：称草酸溶液：称2020g g草酸，加水至草酸，加水至10001000mlml；维生素维生素C C标准液：准确称标准液：准确称2020mgVmgVC C溶于溶于1%1%草草酸中，并稀释至酸中，并稀释至100100mlml，吸吸5 5mlml于于5050mlml容量容量瓶中，加入瓶中，加入1%1%草酸至刻度，此溶液每毫升草酸至刻度，此溶液每毫升含有含有0.02
41、0.02mgVmgVC C；0.02%2 0.02%2，6-6-二氯靛酚溶液：称取二氯靛酚溶液：称取2 2，6-6-二二氯靛酚氯靛酚5050mgmg，溶于溶于200200mlml含有含有5252mgmg碳酸氢钠的碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至热水中，冷却后，稀释至250250mlml，过滤于棕色过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。定一次。二、维生素C的测定标定一：标定一：吸标液（吸标液（V VC C）5ml5ml于三角瓶于三角瓶加加6%6%KIKI溶液溶液0.50.5mlml加加1%1%淀粉淀粉3 3滴滴用用0.0010.001N K
42、ION KIO3 3标液滴定标液滴定到淡兰色。到淡兰色。计算：计算：抗坏血酸浓度（抗坏血酸浓度（mg/mlmg/ml）=（V V1 1 0.0880.088）/V/V2 2V V1 1-滴定时消耗滴定时消耗0.0010.001N KION KIO3 3标液的体积（标液的体积（mlml）V V2 2-维生素维生素C C重量（重量（g g）0.088-1ml0.001N KIO0.088-1ml0.001N KIO3 3标液标液维生素维生素C C的量的量（mg/mlmg/ml）二、维生素C的测定标定二：标定二：吸吸5 5mlml已知浓度已知浓度V V C C标液标液 加加5 5ml1%ml1%草酸
43、草酸 用染料用染料2 2，6-6-二氯靛酚滴定至溶液二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在呈粉红色，在1515秒不褪色为终点秒不褪色为终点计算：计算：每毫升每毫升2 2，6-6-二氯靛酚相当于维生素二氯靛酚相当于维生素C C的毫克数等于滴定度（的毫克数等于滴定度（T T）T=T=（C C V V1 1）/V/V2 2C-C-维生素维生素C C的浓度（的浓度（mg/mlmg/ml）V V1 1-维生素维生素C C的体积（的体积（mlml）V V2 2-消耗消耗2 2，6-6-二氯靛酚的体积（二氯靛酚的体积（mlml）二、维生素C的测定 0.001 0.001N KION KIO3 3标液：吸标液：吸0.
44、10.1N KION KIO3 3溶液溶液5 5mlml于于500500mlml容量瓶内容量瓶内加水至刻度，加水至刻度，每毫升相当于每毫升相当于V VC C0.008mg0.008mg；0.5%0.5%淀粉溶液；淀粉溶液；6%6%KIKI溶液。溶液。二、维生素C的测定3 3、操作方法、操作方法 提取：提取：植物性样品：植物性样品：鲜果蔬鲜果蔬+加等量的加等量的2%2%草酸溶液草酸溶液 倒入组织捣碎机中倒入组织捣碎机中打成匀浆。打成匀浆。动物性样品：动物性样品：用用10%10%三氯醋酸三氯醋酸2 2代替代替%草酸溶液提取。草酸溶液提取。对于有色样品不能用活性炭脱色，因活性炭吸附很多对于有色样品不
45、能用活性炭脱色，因活性炭吸附很多氧，氧化氧，氧化VcVc，使回收率仅有，使回收率仅有30%(30%(草莓、山楂草莓、山楂)色深采用色深采用Al(OH)Al(OH)3 3 白陶土处理。白陶土处理。-用前应测定回收用前应测定回收率。率。P317(6)Al(OH)P317(6)Al(OH)3 3的制备的制备二、维生素C的测定 滴定：滴定：吸吸5 5mlml样液样液于三角瓶于三角瓶用染料滴定至粉红色用染料滴定至粉红色1515秒内不褪色秒内不褪色计算：计算：vVcVc（mg/100gmg/100g)=(VV0)T/m100v式中：x样品中还原型抗坏血酸含量，mg/100g；vV滴定时样液消耗染料的体积，
46、mL；vV0空白滴定时消耗染料的体积，mL；vT用标准还原型抗坏血酸溶液标定染料溶液所得出1mL 染料溶液相当于抗坏血酸的量，mg/mL；vm滴定时所取滤液中含有样品的质量，g4 4、注意事项、注意事项 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；另一个作为观察颜色变化的参考；样品进入实验室后，应浸泡在已知量的样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%2%草酸液中，以防氧化，损失维生素草酸液中，以防氧化，损失维生素C C；贮存过久的罐头食品，可能含有大量的贮存过久的罐头食品，可
47、能含有大量的低铁离子（低铁离子（FeFe2+2+），），要用要用8%8%的醋酸代替的醋酸代替2%2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2 2，6-6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；醋酸可以避免这种情况的发生；整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；被氧化；在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除；数滴辛醇消除；测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。
48、除空白体积。(四四)电位法：电位法：原理与2，6-二氯靛酚滴定法相同，以化学电池电动势判断终点。v测草莓的、山楂中等有色水果的Vc方法：先用Al(OH)Al(OH)3 3乳液乳液脱色，再用电位法滴定。v(五)高效液相色谱法v用6%磷酸提取VcVc，定容，定容过滤过滤粗粗微孔膜过微孔膜过滤滤0.45um 0.45um 进样检测。进样检测。v此法可将还原态、氧化态此法可将还原态、氧化态VcVc分开，分别定量。分开，分别定量。v特点：灵敏度高、重现性好、速度快、分离度高、特点：灵敏度高、重现性好、速度快、分离度高、操作简单。操作简单。二、维生素C的测定思考题：思考题：1.1.大多数维生素定量方法中，维生素必须先从食品中提大多数维生素定量方法中，维生素必须先从食品中提取出来，通常使用哪些方法提取维生素？对于一水溶取出来，通常使用哪些方法提取维生素？对于一水溶性维生素和一脂溶性维生素，分别给出一个适当的提性维生素和一脂溶性维生素，分别给出一个适当的提取方法。取方法。第九章 维生素的测定
