1、 第三章 参与DNA复制的酶类及DNA复制的调控第一节第一节 参与参与DNADNA复制的酶类复制的酶类 DNADNA复制过程非常复杂，至少有复制过程非常复杂，至少有2020多种酶与蛋白质参与。多种酶与蛋白质参与。一、一、DNADNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase)(DNA polymerase)(一一)作用机理作用机理 DNADNA聚合酶聚合酶催化催化4 4种脱氧核苷酸合成种脱氧核苷酸合成DNADNA，即催化前一个脱氧，即催化前一个脱氧核苷酸核苷酸33OHOH与后一个脱氧核苷酸与后一个脱氧核苷酸55P P之间形成之间形成3,5-3,5-磷磷酸二酯键酸二酯键的反应，从而延长的反应，从
2、而延长DNADNA链，链延伸方向为链，链延伸方向为5533，添，添加脱氧核苷酸的种类按碱基互补原则由模板加脱氧核苷酸的种类按碱基互补原则由模板DNADNA决定。决定。DNADNA聚合酶需要互补于聚合酶需要互补于DNADNA模板上的模板上的一小段一小段RNARNA作引物作引物，由引，由引物提供物提供DNADNA合成时需要的第一个合成时需要的第一个33OHOH。因此因此DNADNA聚合酶需要的聚合酶需要的条件包括条件包括4 4种种dNTPdNTP底物、底物、MgMg2 2、模板、模板DNADNA和引物（图和引物（图3-13-1）。）。图图3-1 DNA3-1 DNA聚合酶的催化作用聚合酶的催化作用
3、 DNADNA聚合酶聚合酶与与33OHOH端周围的端周围的单链单链DNADNA模板模板结合，结合，若进入的脱氧核苷酸的碱基与模板配对，该底物则结合到酶若进入的脱氧核苷酸的碱基与模板配对，该底物则结合到酶的三磷酸结合部位上。的三磷酸结合部位上。在聚合酶催化下，引物链的在聚合酶催化下，引物链的33OHOH对底物的对底物的55P P进行进行亲核攻击亲核攻击，释出焦磷酸根，形成，释出焦磷酸根，形成磷酸二酯键磷酸二酯键，新生链由此延，新生链由此延长长一个核苷酸一个核苷酸，酶沿着模板链向前移动一个核苷酸距离。，酶沿着模板链向前移动一个核苷酸距离。如此重复，直至酶到达模板终点。在体内释放的焦磷酸如此重复，直
4、至酶到达模板终点。在体内释放的焦磷酸被焦磷酸酶水解，使反应平衡趋向被焦磷酸酶水解，使反应平衡趋向DNADNA合成合成.2005年年12月月Science报道了报道了DNA聚合酶高保真机理聚合酶高保真机理的新的新发现。高保真聚合酶除具有广为人知的发现。高保真聚合酶除具有广为人知的校正功能校正功能外外,最近实验进最近实验进一步表明一步表明,由不能及时校正或难于纠正的由不能及时校正或难于纠正的错配碱基引发错配碱基引发“关闭关闭”DNA聚合反应聚合反应的效应的效应,同样保证了同样保证了DNA聚合反应终产物纯度。聚合反应终产物纯度。高保真聚合酶这一高保真聚合酶这一“关闭关闭”DNA聚合反应聚合反应的能力
5、的能力,促成促成其其与与耐外切酶消化耐外切酶消化3末端敏感区碱基特异性末端敏感区碱基特异性引物引物共同构成一个共同构成一个SNP敏感性敏感性纳米级复合分子纳米级复合分子“开开/关关”，高保真聚合酶分子中相高保真聚合酶分子中相距三纳米距三纳米聚合中心聚合中心和和3端敏感区端敏感区 5端敏感区外切酶酶解中心端敏感区外切酶酶解中心则既合作又独立地起到了复合分子开关中则既合作又独立地起到了复合分子开关中“开开”和和“关关”的效的效能能:对配对的引物，则直接在该酶聚合中心进行聚合反应，即对配对的引物，则直接在该酶聚合中心进行聚合反应，即“开开”的效应的效应；而对于而对于3 末端敏感区错配的引物末端敏感区
6、错配的引物，则从该酶聚合中心转，则从该酶聚合中心转移至移至3末端敏感区末端敏感区 5 末端敏感区外切酶酶解中心，由于引物末端敏感区外切酶酶解中心，由于引物修饰了修饰了3 末端敏感区耐外切酶的特点，继而出现了一种长时间末端敏感区耐外切酶的特点，继而出现了一种长时间无酶解产物的酶解过程，最后因酶聚合中心空转而无酶解产物的酶解过程，最后因酶聚合中心空转而“关关”闭闭DNA聚合反应，即聚合反应，即“关关”的效应的效应。这一新的这一新的复合分子复合分子“开开/关关”在很大程度上满足了后基因在很大程度上满足了后基因时代对时代对SNP分析的要求。该分析的要求。该SNP分子开关的应用分子开关的应用,使基因诊断
7、使基因诊断提高到单碱基水平。同时提高到单碱基水平。同时,利用该方法通过利用该方法通过SNP对基因组扫描对基因组扫描,在单基因遗传病病因研究及法医学鉴定上具有很强的理论和实在单基因遗传病病因研究及法医学鉴定上具有很强的理论和实用价值。用价值。2006年年7月月Nature报道报道新发现突变相关的新发现突变相关的DNA聚合聚合酶酶(Pol)可能导致可能导致DNA复制保真度下降而参与突变形成复制保真度下降而参与突变形成。除人细胞中已知的除人细胞中已知的5种种Pol，Pol、，Pol、的复制保真度很低。可能在遗传不稳定形成中有作用。近两的复制保真度很低。可能在遗传不稳定形成中有作用。近两年来，据原核和
8、低等真核细胞年来，据原核和低等真核细胞复制后修复复制后修复(PRR)途径的研究途径的研究成果，在人细胞中克隆了成果，在人细胞中克隆了5个新的个新的Pol:Pol、和和Rev1编码蛋白编码蛋白。大肠杆菌大肠杆菌SOS反应中的非定标性突变的发生与反应中的非定标性突变的发生与dinB基因基因有关。有关。DinB蛋白有蛋白有Pol活性活性(Pol)，无无35校读功能校读功能。高。高表达时可导致非定标性突变明显升高达上千倍。无损伤模板表达时可导致非定标性突变明显升高达上千倍。无损伤模板掺入错误率达掺入错误率达10-310-4；大肠杆菌跨损伤；大肠杆菌跨损伤DNA合成依赖于合成依赖于UmuD2C复合体，其
9、中介导的途径通常是易误性的，它的突复合体，其中介导的途径通常是易误性的，它的突变引起诱发突变频率的抑制。变引起诱发突变频率的抑制。UmuD2C复合体也具有复合体也具有Pol活性活性(称为称为Pol V)。它在损伤或。它在损伤或未损伤未损伤DNA模板皆表现为高度易误性，能有效跨越模板皆表现为高度易误性，能有效跨越DNA上无碱上无碱基部位基部位(abasic site)并优先插入一个腺嘌呤。并优先插入一个腺嘌呤。酿酒酵母酿酒酵母PRR途径有三个独立旁路途径有三个独立旁路(一个易误，两个无误一个易误，两个无误)。基因基因REV1、REV3和和REV7与易误性旁路有关。其中与易误性旁路有关。其中Rev
10、3和和Rev7蛋白构成蛋白构成Pol，Rev1蛋白为有蛋白为有DNA模板指导的模板指导的dCMP转移转移酶活性，因此也是一种酶活性，因此也是一种Pol。在芽生酵母中的在芽生酵母中的两条无误两条无误PRR途径依赖途径依赖RAD5和和RAD30基基因。因。RAD30基因与大肠杆菌的基因与大肠杆菌的DinB和和UmuC和酿酒酵母中的和酿酒酵母中的Rev1基因同源。它可在基因同源。它可在DNA合成时在嘧啶二聚体的对面正确掺合成时在嘧啶二聚体的对面正确掺入两个腺嘌呤。它是一个保真度很低的入两个腺嘌呤。它是一个保真度很低的Pol，其掺入差错率高达，其掺入差错率高达10-2到到10-3。这些与这些与突变形成
11、密切相关的突变形成密切相关的Pol在人细胞中都找到了相在人细胞中都找到了相应的同源物基因，与酵母中的应的同源物基因，与酵母中的REV3同源的同源的hREV3编码的编码的Pol以及与以及与Rev1同源的基因；与大肠杆菌中的同源的基因；与大肠杆菌中的DinB和酵母和酵母RAD30同源的同源的hDinB基因编码基因编码Pol；与大肠杆菌；与大肠杆菌UmuC和酵母和酵母RAD30同源的同源的hRAD30基因编码基因编码Pol、另一与酵母、另一与酵母RAD30同源的同源的hRAD30B编码的编码的Pol。已证明着色性干皮病变型。已证明着色性干皮病变型(XPV)系系Po1的突变所致。的突变所致。这些新发现
12、的这些新发现的Pol，可能与诱发的细胞遗传不稳定的形成，可能与诱发的细胞遗传不稳定的形成有关。我们证明用反义核酸技术阻断有关。我们证明用反义核酸技术阻断Pol表达的细胞系表达的细胞系MNNG诱发的非定标性突变的频率减低。诱发的非定标性突变的频率减低。(二二)原核生物原核生物DNADNA聚合酶聚合酶 在大肠杆菌体内发现了三类在大肠杆菌体内发现了三类DNADNA聚合酶，根据发现时间顺聚合酶，根据发现时间顺序分别命名为序分别命名为DNADNA聚合酶聚合酶、。1.DNA1.DNA聚合酶聚合酶I I 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I是第一个被鉴定的是第一个被鉴定的DNADNA聚合酶，它由聚
13、合酶，它由polApolA基因座编码，是一个基因座编码，是一个103kD103kD的单链多肽。每个大肠杆菌细的单链多肽。每个大肠杆菌细胞中约有胞中约有400400个分子个分子DNADNA聚合酶聚合酶I I。当底物和模板存在时，聚合酶当底物和模板存在时，聚合酶I I可使脱氧核糖核苷酸依次可使脱氧核糖核苷酸依次加到具有加到具有3-OH3-OH末端的多核苷酸链上。它的催化需要引物链末端的多核苷酸链上。它的催化需要引物链（DNADNA或或RNARNA链）的存在。在链）的存在。在3737条件下，每分子条件下，每分子DNADNA聚合酶聚合酶I I每分钟中催化约每分钟中催化约10001000个核苷酸个核苷酸
14、的聚合。的聚合。DNA DNA聚合酶聚合酶I I是一个多功能酶，它可以催化以下的反应：是一个多功能酶，它可以催化以下的反应：（1 1）DNADNA链沿链沿5353方向延长（方向延长（DNADNA聚合酶活性）。聚合酶活性）。（2 2）从）从33端水解端水解DNADNA链（链（3535核酸外切酶活性）。核酸外切酶活性）。（3 3）从）从55端水解端水解DNADNA链（链（5353核酸外切酶活性）。核酸外切酶活性）。（4 4）具有很强的校对功能（）具有很强的校对功能（3535核酸外切酶活性）。核酸外切酶活性）。（5 5）有切口平移功能（）有切口平移功能（5353核酸外切酶活性）。核酸外切酶活性）。用
15、蛋白水解酶将用蛋白水解酶将DNADNA聚合酶聚合酶I I作有限水解，可得到分子量作有限水解，可得到分子量68kD68kD和和36kD36kD的两个片段。的两个片段。较大的断裂产物（较大的断裂产物（68kD68kD）叫）叫KlenowKlenow片段片段，在体外它可催化，在体外它可催化DNADNA的合成反应，的合成反应，KlenowKlenow片段有片段有DNADNA聚合酶活性聚合酶活性和和3535核酸核酸外切酶外切酶活性，两种活性分别处于片段的不同区域。活性，两种活性分别处于片段的不同区域。C C端的端的2/32/3片段具有聚合酶活性，片段具有聚合酶活性，N N端的端的1 13 3片段有核酸外
16、片段有核酸外切酶活性，在蛋白质中，两个活性位点的距离为切酶活性，在蛋白质中，两个活性位点的距离为3nm3nm，表明碱，表明碱基的加入和去除功能在空间上是分开的。基的加入和去除功能在空间上是分开的。小片段（小片段（35kD35kD）有）有5353核酸外切酶活性核酸外切酶活性，可以切除少，可以切除少量的核苷酸，一次最多切除量的核苷酸，一次最多切除10 10 个硷基。个硷基。该酶在该酶在切除由紫外线照射而形成嘧啶二聚体切除由紫外线照射而形成嘧啶二聚体中起重要作用，中起重要作用，在在DNADNA的半不连续合成中，的半不连续合成中，冈崎片段冈崎片段5-5-端端RNARNA引物的切除引物的切除可能可能也依
17、赖于该外切酶，小亚基的外切酶活性和大亚基的聚合校对也依赖于该外切酶，小亚基的外切酶活性和大亚基的聚合校对功能协同作用，使功能协同作用，使DNADNA聚合酶聚合酶I I在体外具有从在体外具有从切口处起始复制切口处起始复制的的独特能力，而其他独特能力，而其他DNADNA聚合酶不具备这种能力。聚合酶不具备这种能力。在在双链双链DNADNA的磷酸二酯键断裂的磷酸二酯键断裂处，处，DNADNA聚合酶聚合酶I I可延伸可延伸33末末端，合成新的端，合成新的DNADNA片段后，片段后，DNADNA聚合酶聚合酶I I可置换双螺旋可置换双螺旋中已有的中已有的同源链。同源链。置换出的同源链被置换出的同源链被535
18、3核酸外切酶降解。除部分片段核酸外切酶降解。除部分片段被新合成的材料取代且缺口位置沿双螺旋移动外，被新合成的材料取代且缺口位置沿双螺旋移动外，DNADNA性质没有性质没有任何改变。任何改变。该反应在实践中很有意义，体外的该反应在实践中很有意义，体外的切口移位切口移位是在是在DNADNA分子上分子上引入放射性标记核苷酸的重要技术，在体内，引入放射性标记核苷酸的重要技术，在体内，5353聚合酶聚合酶合成活性和合成活性和3535核酸外切酶活性主要用来填充核酸外切酶活性主要用来填充DNADNA双链中短双链中短的单链区域，复制过程中或从的单链区域，复制过程中或从DNADNA中切除受损的硷基后会产生这中切
19、除受损的硷基后会产生这些单链区域。些单链区域。2.DNA2.DNA聚合酶聚合酶IIII DNA DNA聚合酶聚合酶IIII是一条分子量为是一条分子量为120KD120KD的多肽链。该酶活性很的多肽链。该酶活性很低，只有低，只有DNADNA聚合酶聚合酶I I的的5 5。它也以。它也以4 4种脱氧核苷酸为底物，按种脱氧核苷酸为底物，按5353方向合成方向合成DNADNA。DNADNA聚合酶聚合酶IIII具有具有3535核酸外切酶核酸外切酶活性，但无活性，但无5353外切酶活性。它在外切酶活性。它在DNADNA修复中起一定作用。修复中起一定作用。3.DNA3.DNA聚合酶聚合酶IIIIII 尽管细菌
20、中存在大量的尽管细菌中存在大量的DNADNA聚合酶聚合酶I I，但它并不是复制的主，但它并不是复制的主要酶。在要酶。在polApolA的突变型中，复制仍可继续进行。的突变型中，复制仍可继续进行。目前，目前，DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII（PolIIIPolIII）被认为是真正负责大肠杆）被认为是真正负责大肠杆菌细胞内菌细胞内DNADNA合成的复制酶。合成的复制酶。DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII是多个亚基组成的蛋白质，细胞中含量很少，是多个亚基组成的蛋白质，细胞中含量很少，在每个细胞中只有在每个细胞中只有10102020个拷贝的全酶。个拷贝的全酶。PolIIIPolIII全酶由全酶由
21、、1010种不同的亚基组成，至少含种不同的亚基组成，至少含3 3种重要的酶活性。种重要的酶活性。核心聚合酶（核心聚合酶（core polymerasecore polymerase）由）由、三种亚基三种亚基组成，组成，其中其中亚基亚基分子量为分子量为130kD130kD，由，由dnaEdnaE编码，具有编码，具有5353的聚合活性，每秒可以合成的聚合活性，每秒可以合成8 8个核苷酸个核苷酸。亚基亚基具有具有3535核酸外切酶的校对功能核酸外切酶的校对功能，由，由dnaQdnaQ编码编码合成。在体内合成。在体内亚基基本功能是保证复制的忠实性，这可由亚基基本功能是保证复制的忠实性，这可由dnaQd
22、naQ突变体的表型所证实，在细菌株中突变发生的概率增加了突变体的表型所证实，在细菌株中突变发生的概率增加了10001000倍。倍。亚基常与亚基常与亚基形成一个紧密的亚基形成一个紧密的1 1：l l复合物，协同复合物，协同发挥功能。发挥功能。细胞中大约有细胞中大约有4040分子核心酶分子核心酶，其中只有一半被组装到全酶，其中只有一半被组装到全酶中中,核心酶活性较低，以大约核心酶活性较低，以大约每秒每秒2020个核苷酸个核苷酸的速度合成的速度合成DNADNA。二聚体：二聚体：亚基是以二聚体的形式存在，在复制过程中亚基是以二聚体的形式存在，在复制过程中二聚体环绕着二聚体环绕着DNADNA，并能在，并
23、能在DNADNA上自由滑动，上自由滑动，构成一个滑动钳。构成一个滑动钳。滑动钳可把全酶束缚在滑动钳可把全酶束缚在DNADNA模板上，从而保证高度的进行性，模板上，从而保证高度的进行性，当当polpol结合结合钳时，全酶的进行性可从每次聚合钳时，全酶的进行性可从每次聚合1010个核苷酸提个核苷酸提高到每次聚合高到每次聚合5000050000个核苷酸，聚合反应速度从每秒个核苷酸，聚合反应速度从每秒2020个核苷酸个核苷酸上升到每秒上升到每秒750750个核苷酸，因此个核苷酸，因此钳的存在对大肠杆菌染色体高钳的存在对大肠杆菌染色体高效复制是十分重要的，效复制是十分重要的，亚基可以很容易从全酶中脱离。
24、亚基可以很容易从全酶中脱离。与核心酶相比，在细胞中与核心酶相比，在细胞中亚基含量很丰富亚基含量很丰富，大约每个细，大约每个细胞中含胞中含300300个二聚体。个二聚体。复合物：复合物：复合物（复合物（complexcomplex）是）是滑动钳的载体滑动钳的载体,可帮助可帮助滑动钳结合到滑动钳结合到DNADNA上。上。复合物含有复合物含有5 5个不同亚基个不同亚基，形成一种化学计量为形成一种化学计量为2111121111的结构。的结构。和和亚基是由不同基因编码产生的不同蛋白质。亚基是由不同基因编码产生的不同蛋白质。复合物有依赖复合物有依赖DNADNA的的ATPATP酶活性。酶活性。二聚体自己并不
25、能组装到二聚体自己并不能组装到DNADNA上上 ，它是，它是通过通过复合物复合物与与ATPATP协同作用协同作用催化催化ATPATP的水解而组装到的水解而组装到DNADNA上。上。DNADNA聚合酶聚合酶、均具有均具有5533聚合酶活性和聚合酶活性和3355核酸外切酶活性核酸外切酶活性，因此在合成，因此在合成DNADNA时，能识别和切时，能识别和切除不配对的引物末端，起着严格校对作用，以保证复制的真除不配对的引物末端，起着严格校对作用，以保证复制的真实性。实性。DNADNA聚合酶聚合酶的特别之处在于它具有的特别之处在于它具有5533外切酶活性。外切酶活性。这种活性只作用于双链这种活性只作用于双
26、链DNADNA，从，从5-5-端切除寡核苷酸。由于它能端切除寡核苷酸。由于它能跳过几个核苷酸起作用，因此跳过几个核苷酸起作用，因此能切除由紫外线照射形成的胸腺能切除由紫外线照射形成的胸腺嘧啶二聚体，参与嘧啶二聚体，参与DNADNA损伤的修复。损伤的修复。DNADNA聚合酶聚合酶能催化能催化切口平移和链置换切口平移和链置换反应反应,双链双链DNADNA的一的一条链发生断裂，出现切口，条链发生断裂，出现切口，DNADNA聚合酶聚合酶与切口结合，其与切口结合，其5533外切酶活性与聚合作用同时发生。即它一边催化外切酶活性与聚合作用同时发生。即它一边催化3-OH3-OH与三磷与三磷酸核苷酸产生聚合反应
27、，一边在酸核苷酸产生聚合反应，一边在55端逐一水解核苷酸，切口就端逐一水解核苷酸，切口就沿着沿着DNADNA链从链从5533方向移动。这种移动称为方向移动。这种移动称为切口平移切口平移（nick nick translationtranslation）（图）（图3-23-2）。）。图图3-2 DNA3-2 DNA聚合酶聚合酶I I的切口平移的切口平移 如果选择合适的实验条件，使聚合作用发生在单链切如果选择合适的实验条件，使聚合作用发生在单链切口处而不同时出现口处而不同时出现5533外切酶活性，这种延伸中的链外切酶活性，这种延伸中的链就置换了亲链，即所谓就置换了亲链，即所谓链置换反应链置换反应，
28、这被认为是遗传重组，这被认为是遗传重组机制中的一个重复步骤。机制中的一个重复步骤。在迄今所知的大肠杆菌聚合酶中，唯有在迄今所知的大肠杆菌聚合酶中，唯有DNA polDNA pol能独能独立地进行链置换反应。其它链置换反应中，需要辅助蛋白，立地进行链置换反应。其它链置换反应中，需要辅助蛋白，并裂解并裂解ATPATP为解螺旋提供能量。为解螺旋提供能量。利用切口平移反应，可获得标记的利用切口平移反应，可获得标记的DNADNA探针。探针。将将DNADNA聚合酶聚合酶、带有切口的双链、带有切口的双链DNADNA分子以及放射性标记分子以及放射性标记的三磷酸脱氧核糖核苷一起反应，可合成带有放射性标记的的三磷
29、酸脱氧核糖核苷一起反应，可合成带有放射性标记的DNADNA探针，而同时降解未被标记的探针，而同时降解未被标记的DNADNA。DNADNA聚合酶聚合酶在在DNADNA损伤时表达增加，还参与损伤时表达增加，还参与SOSSOS修复反应，修复反应，能以损伤的能以损伤的DNADNA链为模板合成新生链。这种特性易于造成链为模板合成新生链。这种特性易于造成DNADNA的的永久突变。永久突变。表表3-13-1总结了原核生物三种总结了原核生物三种DNADNA聚合酶的特性和功能。聚合酶的特性和功能。D N A 聚 合 酶 特 性 分 子 量（万）1 0.9 9.0-1 2.0 6 0.0 5 3 聚 合 酶 活
30、性 3 5 外 切 酶 活 性 5 3 外 切 酶 活 性 催 化 效 率（b p/分）6 0 0 2 0 0 3 0,0 0 0 每 细 胞 分 子 数 4 0 0?1 0-2 0 致 死 突 变 +-+功 能 切 除R N A 引 物,D N A 修 复，D N A 链 延 伸 反 应 补 平 空 隙D N A 修 复 参 与S O S 修 复 反 应 表表3-1 3-1 原核生物原核生物DNADNA聚合酶性质比较聚合酶性质比较(三三)真核生物真核生物DNADNA聚合酶聚合酶 真核生物中现已发现五种真核生物中现已发现五种DNADNA聚合酶，分别命名为聚合酶，分别命名为.等。等。它们的基本性
31、质与原核生物它们的基本性质与原核生物DNADNA聚合酶相似，其活性依聚合酶相似，其活性依赖于带有赖于带有33OHOH的引物、的引物、DNADNA模板和模板和4 4种种dNTPdNTP。表。表3-23-2列出了列出了真核生物真核生物DNADNA聚合酶的基本特性和功能。聚合酶的基本特性和功能。DNA聚合酶聚合酶 催化亚基分子量催化亚基分子量 103 16.5 4.0 14.0 12.5 25.5相关亚基分子量相关亚基分子量 1037.0(调节亚基调节亚基)未知未知 4.8 未知未知5.84.8(引发酶亚基引发酶亚基)胞内定位胞内定位 胞核胞核 胞核胞核 线粒体线粒体 胞核胞核 胞核胞核内在的聚合酶
32、活性内在的聚合酶活性 中等中等 低低 高高 低低 高高35外切酶活性外切酶活性 -+引发酶活性引发酶活性 +-复制的保真性复制的保真性 高高 低低 高高 高高 高高功能功能起始引发起始引发 DNA碱基碱基 线粒体线粒体 延伸延伸DNA链链 补平引物切除补平引物切除表表3-2 3-2 真核生物真核生物DNADNA聚合酶性质总结聚合酶性质总结二、真核生物二、真核生物DNADNA聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白 利用利用SV40SV40体外复制系统，已相继鉴定出一些真核生物体外复制系统，已相继鉴定出一些真核生物DNADNA聚合酶附属蛋白。主要有增殖细胞核抗原（聚合酶附属蛋白。主要有增殖细胞核抗原（PCN
33、APCNA），复制因），复制因子子C C（RFCRFC）、识别引物的）、识别引物的PRP1PRP1和和PRP2PRP2蛋白以及聚合酶蛋白以及聚合酶 相关因相关因子（子（AAFAAF）等。）等。1.PCNA1.PCNA是是DNApolDNApol 的附属蛋白的附属蛋白 能极大地促进能极大地促进DNApolDNApol 的合成活性。其分子量为的合成活性。其分子量为3636 10103 3。已在人、大鼠、小鼠、果蝇、酵母等生物中克隆了已在人、大鼠、小鼠、果蝇、酵母等生物中克隆了PCNAPCNA的基的基因。它们的氨基酸序列有较高同原性，结构也相当保守。因。它们的氨基酸序列有较高同原性，结构也相当保守。
34、PCNAPCNA可能是通过与可能是通过与RFCRFC和和ATPATP自由结合到引物末端，或通自由结合到引物末端，或通过过ATPATP非依赖方式滑动到引物末端而增强非依赖方式滑动到引物末端而增强DNApolDNApol 的催化效率。的催化效率。最近有研究表明，最近有研究表明，PCNAPCNA在在DNADNA的切除修复中起一定作用。的切除修复中起一定作用。2.RFC2.RFC是一个多亚基复合物是一个多亚基复合物 因细胞类型的不同，因细胞类型的不同，RFCRFC亚基数也从亚基数也从3 3个到个到7 7个不等。个不等。140140 10103 3的大亚基识别的大亚基识别DNADNA模板引物，模板引物，
35、4040 10103 3小亚基结合小亚基结合ATP,RFCATP,RFC在体外在体外能增强能增强DNApolDNApol 和和 的活性。的活性。RFCRFC结合到引物末端并通过结合到引物末端并通过DNADNA刺激的刺激的ATPaseATPase活性与活性与PCNAPCNA结合形成一个引物识别复合物。此复合物对结合形成一个引物识别复合物。此复合物对DNApolDNApol 的亲和力高而与的亲和力高而与DNApolDNApol 的亲和力低。的亲和力低。3.PRP13.PRP1和和PRP2PRP2是两个引物识别蛋白是两个引物识别蛋白 分子量分别为分子量分别为3636 10103 3和和4343 10
36、103 3，它们降低引物末端的，它们降低引物末端的KmKm，使，使DNApolDNApol 与模板引物末端的亲和力增加与模板引物末端的亲和力增加20203030倍，从而促进倍，从而促进DNApolDNApol 的活性。的活性。4.AAF4.AAF是模板亲和蛋白是模板亲和蛋白 AAFAAF由两个亚基组成，分子量分别为由两个亚基组成，分子量分别为132132 10103 3和和4444 10103 3。它是。它是一种模板亲和蛋白，有促进一种模板亲和蛋白，有促进DNApolDNApol 引发酶利用未经引发的模板，引发酶利用未经引发的模板，作为一种作为一种DNApolDNApol 引发酶的活化因子，引
37、发酶的活化因子，AAFAAF辅助它们在后随链上辅助它们在后随链上的催化活性。的催化活性。三、三、DNADNA引物酶引物酶 E-coliE-coli的引物酶由的引物酶由DnaGDnaG基因编码，合成的引物是基因编码，合成的引物是pppACpppAC（N N）7-107-10。真核生物引物酶是由。真核生物引物酶是由48X1048X103 3和和58X1058X103 3二个亚基组二个亚基组成的异源二聚体，与成的异源二聚体，与DNApolDNApol 形成紧密复合物，合成的引物为形成紧密复合物，合成的引物为pppApppA（N N）1010，其特点是缓慢起始，快速聚合及在，其特点是缓慢起始，快速聚合
38、及在DNApolDNApol 起起始合成前准确终止。始合成前准确终止。四、四、DNADNA连接酶连接酶 DNADNA连接酶催化冈崎片段间磷酸二酯键的形成连接酶催化冈崎片段间磷酸二酯键的形成,不同于聚不同于聚合酶的催化反应。当合酶的催化反应。当DNADNA双链中的一条单链是完整的，双链中的一条单链是完整的，DNADNA连连接酶能催化另一条链的相邻接酶能催化另一条链的相邻55P P与与33OHOH之间形成之间形成3,5-3,5-磷酸二酯键，且偶联磷酸二酯键，且偶联NADNAD（原核生物）或（原核生物）或ATPATP（真（真核生物）的水解（图核生物）的水解（图 3-33-3）。）。图图3-3 3-3
39、 连接酶连接模板链上相邻两个片段的切口连接酶连接模板链上相邻两个片段的切口 DNADNA连接酶除了可以闭合双链连接酶除了可以闭合双链DNADNA中的单链切口，还可闭中的单链切口，还可闭合合RNARNADNADNA杂交体双链中的单链切口，但不能闭合双链杂交体双链中的单链切口，但不能闭合双链RNARNA中中的单链切口。在有过量的单链切口。在有过量ATPATP存在时，存在时，T4T4噬菌体连接酶可连接平噬菌体连接酶可连接平头双链头双链DNADNA，但大肠杆菌连接酶不能催化这种连接反应。，但大肠杆菌连接酶不能催化这种连接反应。原核生物大多只有原核生物大多只有一种形式连接酶一种形式连接酶，真核生物则有，
40、真核生物则有多种多种形式连接酶形式连接酶。不同形式连接酶的催化特性，对底物及。不同形式连接酶的催化特性，对底物及ATPATP亲和亲和力以及对细胞增殖的作用均有所不同。力以及对细胞增殖的作用均有所不同。DNADNA连接酶的催化性质，决定了该酶在连接酶的催化性质，决定了该酶在DNADNA复制中的重要地复制中的重要地位，它的作用还涉及到位，它的作用还涉及到DNADNA修复和重组以及修复和重组以及DNADNA重组技术。重组技术。五、与五、与DNADNA解旋和解链有关的酶解旋和解链有关的酶 在双链在双链DNADNA复制过程中，由于复制叉的移动速度快（原核复制过程中，由于复制叉的移动速度快（原核生物为生物
41、为1000bp/s,1000bp/s,真核生物为真核生物为100bp/s100bp/s），），DNADNA双螺旋不断解开，双螺旋不断解开，在复制叉前方的在复制叉前方的DNADNA双链会出现过度的正超螺旋甚至打结现象，双链会出现过度的正超螺旋甚至打结现象，阻碍阻碍DNADNA的继续复制，生物体依靠一系列的继续复制，生物体依靠一系列DNADNA解旋解链酶，不解旋解链酶，不断消除产生的正超螺旋，保证复制的进行。断消除产生的正超螺旋，保证复制的进行。(一一)DNA)DNA螺旋酶（螺旋酶（DNA helicaseDNA helicase）也称也称DNADNA解旋蛋白（解旋蛋白（DNA unwinding
42、 proteinDNA unwinding protein）。它的作）。它的作用是催化双螺旋用是催化双螺旋DNADNA的解旋和解链。该过程需水解的解旋和解链。该过程需水解ATPATP提供能提供能量（打开一个量（打开一个ATAT对约需对约需5KJ.mol-15KJ.mol-1，打开一个，打开一个GCGC对约需对约需21KJ.mol-121KJ.mol-1）。）。从大肠杆菌分离得到从大肠杆菌分离得到数种数种DNADNA螺旋酶螺旋酶，分别称为螺旋酶，分别称为螺旋酶、和和reprep蛋白等蛋白等,后三者与大肠杆菌后三者与大肠杆菌DNADNA复制有关。复制有关。在复制过程中，螺旋酶在复制过程中，螺旋酶、
43、沿着后随链模板，从沿着后随链模板，从5533方向移动，促使复制叉向前延伸，而方向移动，促使复制叉向前延伸，而reprep蛋白蛋白是沿着前导链模是沿着前导链模板，以板，以3355方向向前移动，促进双链不断解开。方向向前移动，促进双链不断解开。在真核生物中也发现在真核生物中也发现多种螺旋酶多种螺旋酶，如从小牛胸腺中分离到，如从小牛胸腺中分离到8 8种螺旋酶，但有关其作用机制及其在种螺旋酶，但有关其作用机制及其在DNADNA复制中所起的确切作复制中所起的确切作用仍不清楚。用仍不清楚。现在正试图克隆和表达螺旋酶的基因，分析它的结构并研现在正试图克隆和表达螺旋酶的基因，分析它的结构并研究其是否细胞存活所
44、必需，研究其是否受细胞周期调控以及在究其是否细胞存活所必需，研究其是否受细胞周期调控以及在复制叉模型中的作用。复制叉模型中的作用。(二二)拓扑异构酶（拓扑异构酶（Topo meraseTopo merase）在原核和真核生物中都发现二类拓扑异构酶（在原核和真核生物中都发现二类拓扑异构酶（和和）。）。原核生物中与复制有关的主要是原核生物中与复制有关的主要是TopoTopo，又称，又称DNADNA回旋酶回旋酶（DNA DNA gyrasegyrase），原核生物），原核生物TopoTopo可能与转录有关可能与转录有关。DNADNA回旋酶的作用回旋酶的作用是在水解是在水解ATPATP的同时使松驰态环
45、状的同时使松驰态环状DNADNA转变转变为负超螺旋为负超螺旋DNADNA。这种作用很复杂，涉及三个步骤：。这种作用很复杂，涉及三个步骤：（1 1）DNADNA回旋酶首先与回旋酶首先与DNADNA结合，结合，并使环状并使环状DNADNA扭曲而形成一扭曲而形成一“右手结右手结”结构。这个作用是形成一个稳定的正超螺旋（以结构。这个作用是形成一个稳定的正超螺旋（以“”表示），同时又引入一个负超螺旋（以表示），同时又引入一个负超螺旋（以“”表示）。表示）。（2 2）然后）然后DNADNA回旋酶在右手结的背后打断双链回旋酶在右手结的背后打断双链DNADNA，并穿到另，并穿到另一条链前面，这样就将右手性正超
46、螺旋变为左手性负超螺旋。一条链前面，这样就将右手性正超螺旋变为左手性负超螺旋。（3 3）最后断点再连接起来。最后断点再连接起来。这个过程需这个过程需ATPATP水解供能；引入的水解供能；引入的负超螺旋能使打开碱基对所需的能量降低约负超螺旋能使打开碱基对所需的能量降低约4.1KJ.mol-1,4.1KJ.mol-1,利于利于DNADNA解链复制（图解链复制（图3-43-4）。图图3-4 3-4 拓扑异构酶的催化作用拓扑异构酶的催化作用 真核生物中真核生物中TopoTopo和和均与复制有关均与复制有关。TopoTopo不需消耗不需消耗ATPATP，其酪氨酸残基能与其酪氨酸残基能与DNA 3DNA
47、3P P基团形成共价结合的中间产物，基团形成共价结合的中间产物，它能使负或正超螺旋变为松驰态。它能使负或正超螺旋变为松驰态。TopoTopo需要需要ATPATP供能供能，它不仅参与，它不仅参与DNADNA复制，还促进两个子复制，还促进两个子代分子分离。代分子分离。真核生物真核生物TopoTopo无论在细胞增殖期还是在静止期，都维持无论在细胞增殖期还是在静止期，都维持在在较高较高水平，与细胞生长速率无关。而水平，与细胞生长速率无关。而TopoTopo水平在细胞增殖水平在细胞增殖期比在细胞静止期期比在细胞静止期高高100100倍以上。倍以上。令人感兴趣的是令人感兴趣的是TopoTopo在肿瘤细胞水
48、平很高，与其增在肿瘤细胞水平很高，与其增殖潜能相平行。殖潜能相平行。有人从中得到启发，正在有人从中得到启发，正在研究研究TopoTopo的抑制剂，观察的抑制剂，观察它在肿瘤治疗中的效果。它在肿瘤治疗中的效果。TopoTopo与与TopoTopo的另一不同之处在于的另一不同之处在于它独特地沿着染色它独特地沿着染色体分布，与染色体结构、压缩及核基质组成有关。体分布，与染色体结构、压缩及核基质组成有关。(三三)单链结合蛋白单链结合蛋白(Single-strand Binding protein,SSB）SSBSSB对单链对单链DNADNA的亲和力极高，但几乎没有序列特异性。它的亲和力极高，但几乎没有
49、序列特异性。它们的基本特征是结合单链们的基本特征是结合单链DNADNA，刺激，刺激DNADNA聚合酶的活化并与其他聚合酶的活化并与其他复制蛋白作用形成复合物等。复制蛋白作用形成复合物等。SSBSSB常组成同亚基多聚体，它与常组成同亚基多聚体，它与DNADNA的结合呈现协同效应。的结合呈现协同效应。最早研究得较为清楚的是最早研究得较为清楚的是E-coli SSBE-coli SSB蛋白以及蛋白以及T4T4噬菌体基因噬菌体基因3232产物。产物。在哺乳动物细胞中分离的单链结合蛋白，命名为复制因在哺乳动物细胞中分离的单链结合蛋白，命名为复制因子子A A（RFARFA）。）。RFARFA由分子量分别为
50、由分子量分别为70KD70KD、32-34KD32-34KD和和11-14KD11-14KD的三个不的三个不同亚基组成。其中同亚基组成。其中76KD76KD的大亚基具有单链的大亚基具有单链DNADNA结合活性，还结合活性，还能促进能促进DNApolDNApol 和和 的聚合作用，的聚合作用，32KD32KD的亚基可被的亚基可被CDK2CDK2激酶磷激酶磷酸化，与细胞周期有关。酸化，与细胞周期有关。RFARFA不仅在不仅在DNADNA复制时，起始解链中起作用，还促进复制时，起始解链中起作用，还促进DNADNA链的延长。图链的延长。图3-53-5总结了与总结了与DNADNA复制有关的酶在大肠杆菌复
