1、第三节第三节 高效液相色谱高效液相色谱(high performance liquid(high performance liquid chromatograpphy,HPLCchromatograpphy,HPLC)液相色谱基础1 1色谱图和峰参数色谱图和峰参数色谱图色谱图(chromatogram)(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时时间曲线，又称色谱流出曲线间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)(elution profile)。基线基线(base line)(base line)-经流动相冲洗，柱
2、与流动相达到平衡后，检测器测出经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音噪音(noise)(noise)-基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移漂移(drift)(drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也流动相及流量
3、的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。会产生漂移。色谱峰色谱峰(peak)(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯GaussGauss曲线）曲线）不对称色谱峰有两种：前延峰不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)(leading peak)和拖尾峰和拖尾峰(tailing peak)(tailing peak)。前者少见。前者少见。色谱图拖尾因子拖尾因子(tailing fa
4、ctor(tailing factor，T)T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子因子(symmetry factor)(symmetry factor)或不对称因子或不对称因子(asymmetry factor)(asymmetry factor)。中国药典中国药典规定规定T T应为应为0.950.951.051.05。T T0.950.95为前延峰，为前延峰，T T1.051.05为拖尾峰。为拖尾峰。峰底峰底-基线上峰的起点至终点的距离。基线上峰的起点至终点的距离。峰高峰高(peak height(peak height，h)-h)-峰的最高点至峰
5、底的距离。峰的最高点至峰底的距离。峰宽（峰宽（peak widthpeak width，W)-W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。的距离。W W44半峰宽（半峰宽（peak width at half-heightpeak width at half-height，Wh/2)-Wh/2)-峰高一半处的峰宽。峰高一半处的峰宽。Wh/2Wh/22.3552.355标准偏差（标准偏差（standard deviationstandard deviation，)-)-正态分布曲线正态分布曲线x x1 1时（拐点）的时（拐点）的峰宽之半。正常
6、峰的拐点在峰高的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.6070.607倍处。标准偏差的大小说明组分倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。在流出色谱柱过程中的分散程度。小，分散程度小、极点浓度高、峰形小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。大，峰形胖、柱效低。峰面积峰面积(peak area(peak area，A)-A)-峰与峰底所包围的面积。峰与峰底所包围的面积。2 2定性参数（保留值）定性参数（保留值）死时间死时间(dead time(dead time，t0)t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）不保留组分的保留时间
7、。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相通过色谱柱的时间。在反相HPLCHPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积死体积(dead volume(dead volume，V0)V0)-由进样器进样口到检测器流动池未被固定由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括相所占据的空间。它包括4 4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，相颗粒间隙（被流动相占据，VmVm）、柱出口管路体积、检测器流动池）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有体积。其中只有VmVm参与色谱平衡过程，其它参与色
8、谱平衡过程，其它3 3部分只起峰扩展作用。为部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这防止峰扩展，这3 3部分体积应尽量减小。部分体积应尽量减小。V0V0F Ft0t0（F F为流速）为流速）保留时间保留时间(retention time(retention time，tR)tR)-从进样开始到某个组分在柱后出现从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。浓度极大值的时间。保留体积保留体积(retention volume(retention volume，VR)VR)-从进样开始到某组分在柱后出现从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。浓度极大值时流出溶剂的体积。
9、又称洗脱体积。VRVRF FtRtR3 3柱效参数柱效参数理论塔板数理论塔板数(theoretical plate number(theoretical plate number，N)N)-用于定量表示色谱柱的用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。分离效率（简称柱效）。N N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后
10、洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。N N与与柱长成正比，柱越长，柱长成正比，柱越长，N N越大。用越大。用N N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为则表示柱长为1 1米时的理论塔板数。（一般米时的理论塔板数。（一般HPLCHPLC柱的柱的N N在在10001000以上。）若用以上。）若用调整保留时间调整保留时间(t(tR)R
11、)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N(N有效有效)。理论塔板高度理论塔板高度(theoretical plate height(theoretical plate height，H)H)-每单位柱长的方差。每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长实际应用时往往用柱长L L和理论塔板数计算。和理论塔板数计算。4 4相平衡参数相平衡参数分配系数分配系数(distribution coefficient(distribution coefficient，K)-K)-在一定温度下，化合物在两相间在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相
12、中的浓度之比。达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，在不同的色谱分离机制中，K K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数色谱法为选择性系数(或称交换系数或称交换系数)，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。用分配系数来表示。在条件在条件(流动相、固定相、温度和压力等流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时
13、，一定，样品浓度很低时，K K只取决于只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K K减小，这时色谱峰为减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K K恒定时，才能获得正常峰。恒定时，才能获得
14、正常峰。在同一色谱条件下，样品中在同一色谱条件下，样品中K K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；柱；K K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在在HPLCHPLC中，固定相确定后，中，固定相确定后，K K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及相的组成
15、配比及pHpH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。离的目的。容量因子容量因子(capacity factor(capacity factor，k)k)-化合物在两相间达到分配平衡时，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t tR R）是）是不保留组分保留时间（不保留组分保留时间（t0t0）的几倍。）的
16、几倍。k k0 0时，时，化合物全部存在于流动相化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，中，在固定相中不保留，t tR R0 0；k k越大，说明固定相对此组分的容量越越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。大，出柱慢，保留时间越长。容量因子与分配系数的不同点是：容量因子与分配系数的不同点是：K K取决于组分、流动相、固定相的性取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积质及温度，而与体积VsVs、VmVm无关；无关；k k除了与性质及温度有关外，还与除了与性质及温度有关外，还与VsVs、VmVm有关。由于有关。由于t tR R、t0t0较较VsVs、VmVm易于测定
17、，所以容量因子比分配系数应用易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。更广泛。选择性因子选择性因子(selectivity factor(selectivity factor，)-相邻两组分的分配系数或容量相邻两组分的分配系数或容量因子之比。因子之比。又称为相对保留时间（又称为相对保留时间（美国药典美国药典）。）。要使两组分得到分离，必须使要使两组分得到分离，必须使11。与化合物在固定相和流动相中与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性
18、质的差异，即分子间的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。相互作用力的差异。5 5分离参数分离参数分离度分离度(resolution(resolution，R)R)-相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。当也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。当W1W1W2W2时，时，R R1 1。当。当R R1 1时，时，称为称为44分离，两峰基本分离，裸露峰面积为分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%95.4%，内侧峰基重叠约，内侧峰基重叠约2%2%。R R1.51.5时，称为时，称为66
19、分离，裸露峰面积为分离，裸露峰面积为99.7%99.7%。R1.5R1.5称为完全分离。称为完全分离。中国药典规定中国药典规定R R应大于应大于1.51.5。提高分离度有三种途径：提高分离度有三种途径：增加塔板数。增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加选择性。增加选择性。当当1 1时，时，R R0 0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：一般可以采取以下措施来改变选择性：a.
20、a.改变流动相的组成及改变流动相的组成及pHpH值；值；b.b.改变柱温；改变柱温；c.c.改变固定相。改变固定相。改变容量因子。改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。相的组成来实现。k k趋于趋于0 0时，时，R R也趋于也趋于0 0；k k增大，增大，R R也增大。但也增大。但k k不能太大，不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般般k k在在1 11010范围内，最好为范围内，最好为2 25 5，窄径柱
21、可更小些。，窄径柱可更小些。HPLC组成示例17一、液相色谱分离的基本原理一、液相色谱分离的基本原理n液相色谱方法的分类液相色谱方法的分类液相色谱分离方法大致可以分为正相色谱、反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、体积排除色谱、亲和色谱以及手性色谱。在高效液相色谱法中，目前应用得最广泛的是正相色谱和反相色谱，其中反相色谱又是重中之中。n液相色谱分离原理液相色谱分离原理正相色谱的分离原理：根据溶质极性的不同而产生的溶质在吸附剂上吸附性强弱的差异而分离。反相色谱的分离原理：根据因溶质疏水性的不同而产生的溶质在流动相与固定相之间分配系数的差异而分离。n高效液相色谱法是采用高效液相色谱法是采用高效填充
22、剂，利用高高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有填充剂（固定相）的色谱柱进行分离测定的填充剂（固定相）的色谱柱进行分离测定的色谱方法。色谱方法。n经由进样阀注入的供试品，有流动相带入柱经由进样阀注入的供试品，有流动相带入柱内，各成分在柱内被分离后，依次进入检测内，各成分在柱内被分离后，依次进入检测器，有记录仪、积分仪或数据处理系统记录器，有记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。色谱信号。二、高效液相色谱仪的分析原理二、高效液相色谱仪的分析原理1.1.流程流程2.主要部件主要部
23、件(1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（5 mn柱床稳定性差柱床稳定性差n比表面积较小比表面积较小n价格便宜价格便宜球形硅胶球形硅胶:现代现代 HPLC 填料填料粒径小粒径小(5 m,3 m,2 m)重现性好重现性好 稳定性好稳定性好分离效率高分离效率高44硅胶纯度的影响n硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。n以前的纯度较低的硅胶（称为以前的纯度较低的硅胶（称为 A 型硅胶）型硅胶）,A 型硅胶是以金属硅型硅胶是以金属硅酸盐制备而来
24、，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非酸盐制备而来，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非离子化合物的分离。离子化合物的分离。n纯度高、酸性较弱的硅胶纯度高、酸性较弱的硅胶(称为称为 B 型硅胶型硅胶)，这种硅胶是以无金这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分离离子化合属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分离离子化合物和可电离的化合物物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。特别是碱性化合物。n金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾峰。峰。45硅胶纯度的影响硅胶纯度的影响M+表面金属能
25、与螯合化合物络合 M Si OH 内部的金属对表面硅羟基具有活化作用强酸性A 型硅胶 C18B 型硅胶C1846硅胶孔径的影响硅胶孔径的影响孔径作用和效能 60 nm对 HPLC 分析没有用，会引起峰形拖尾和较低的分离效率60 150 nm对小分子的分离效果理想(MW 1,000 nm对聚合物的分离效果理想，如DNA和生物大分子47硅胶粒径的影响粒 径作 用 和 效 能5 m目前应用最广泛，可以满足从分析到半制备的分离3 3.5 m常用于分析柱上的快速分离，色谱柱短，节省溶剂 2 m常应用于超快速分离，high throughput,分离度高7 10 m常用于半制备色谱柱10 20 m常用于制
26、备色谱柱48HPLC 色谱柱的构成类 型内径D(cm)柱长(cm)粒径(m)分 析 柱0.3 0.463-253-10微 孔 柱0.1,0.2115,253 -8半制备柱0.8 1.010-255-20制 备 柱2.0 5.010-255-2049评价色谱柱好坏的标准评价色谱柱好坏的标准 1）理论塔板数）理论塔板数N 2）拖尾因子拖尾因子Tf 3）色谱柱背压色谱柱背压 4)色谱柱批与批之间的重现性色谱柱批与批之间的重现性 5）pH值的适用范围值的适用范围 6）使用寿命）使用寿命50理论塔板数 N粒径(m)柱长(cm)塔 板 数 N10156,000-7,00010258,000-10,0005
27、107,000-9,00051510,000-12,00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00031012,000-14,00031517,000-20,00051拖尾因子TfAs=1.0-1.05 很 好As=1.2 一 般As=2 差As=4 很差不对称因子和拖尾因子的关系As(at 10%)Tf(at 5%)1.01.01.31.21.61.41.91.62.21.82.52.0不对称因子(As)=BA A拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高52色 谱 柱 背 压1.粒径均一会使色谱柱的背压相对较低。2.色谱柱两端的压力降不应
28、超过公式计算所得的30。3.硅胶粒径对色谱柱的压力具有很大的影响；硅胶粒子越小，色谱柱的背压越大。4.色谱柱的背压还与流动相的粘度有关。P=3000Lt0dp2P 是色谱柱背压(psi)，L 是色谱柱的长度(cm),流动相的粘度(cP)，t0 是色谱柱死时间,dp 是粒子的直径(m)53为什么色谱柱会失去分离能力为什么色谱柱会失去分离能力?n部分原因是色谱柱塞板或柱床被堵塞部分原因是色谱柱塞板或柱床被堵塞 导致色谱导致色谱柱背压上升、峰形拖尾和柱效下降。柱背压上升、峰形拖尾和柱效下降。n吸附了样品杂质吸附了样品杂质 导致柱效下降、选择性和保留导致柱效下降、选择性和保留时间改变。时间改变。n色谱
29、柱没装填好色谱柱没装填好 导致柱效下降和峰形拖尾。导致柱效下降和峰形拖尾。n物理损伤或受热引起的缺口物理损伤或受热引起的缺口 导致柱效下降和峰导致柱效下降和峰形拖尾。形拖尾。n对硅胶基质或键合相的化学腐蚀对硅胶基质或键合相的化学腐蚀 导致选择性变导致选择性变弱、峰形拖尾、保留能力下降（或对碱性化合物的弱、峰形拖尾、保留能力下降（或对碱性化合物的保留能力增强）。保留能力增强）。54现代高效液相色谱柱的要求n超纯超纯 B 型球形硅胶型球形硅胶 峰形好、柱效高。峰形好、柱效高。n不能有使色谱性能降低的直径小于不能有使色谱性能降低的直径小于50 的微孔。的微孔。n粒径尺寸从粒径尺寸从 3 m 到到 1
30、0 m 能满足从分析到制备能满足从分析到制备色谱规模的需求。色谱规模的需求。n色谱柱柱床装填好色谱柱柱床装填好 使用寿命长、柱效高。使用寿命长、柱效高。n封尾彻底封尾彻底 峰形好、使用寿命长。峰形好、使用寿命长。n批与批之间得重现性好。批与批之间得重现性好。n不同的相具有不同的选择性不同的相具有不同的选择性 能更好的实现分离。能更好的实现分离。n键合相化学稳定好键合相化学稳定好 适用的适用的 pH 范围广范围广,使用寿命使用寿命长。长。nRPC是以表面非极性载体为固定相，以比固定相是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的极性强的溶剂为流动相的种液相色谱分离模式。种液相色谱分
31、离模式。反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离的不同而分离反相色谱反相色谱reversed phase chromatography,RPC固定相：固定相：非极性的反相介质，即为疏水性介质(R1,R2多为甲基，R为C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制备的试剂最多，统称为ODS Octadecyl silica)。烷基化密度：烷基化密度：45%，55%的羟基用的羟基用三甲基氯硅烷覆盖，使表面完全非极性化。溶质在介质上的分配系数处决于溶质的疏水性
32、，疏水性大，溶质在介质上的分配系数处决于溶质的疏水性，疏水性大，m高。高。流动相：流动相：极性有机溶剂的水溶液(甲醇,乙晴,异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等)洗脱：洗脱：有机溶剂增加。30m15m5mInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffectSourceRPC应用：应用：主要应用于5000KD以下，特别是1000以下的非极性小分子物质的分离蛋白质：可以应用，但存在变性的危险。有机溶剂60为什么反相色谱应用如此广泛为什么反相色谱应用如此广泛?n它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。n适用于多
33、种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。n保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。n所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。n选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。六、六、HPLC法的应用法的应用采用峰面积法或峰高法采用峰面积法或峰高法(1)内标法内标法(2)外标法外标法v1 1 定性分析定性
34、分析v2 2 定量分析定量分析 HPLC分离速度快、效率高、试样分析重现性好，而且试样不分离速度快、效率高、试样分析重现性好，而且试样不需气化，只需制成溶液，即可在室温下进样分析，所以此法需气化，只需制成溶液，即可在室温下进样分析，所以此法应用范围极广，对挥发性差或遇热不稳定的成分及某些高分应用范围极广，对挥发性差或遇热不稳定的成分及某些高分子化合物的分离极为有利。子化合物的分离极为有利。外标法外标法标准曲线法标准曲线法用待测组分的纯样制标准曲线优点：快速简单。只要待测组分出峰且完全分离即可缺点：绝对法,进样量,操作条件要不变 外标法外标法外标一点法外标一点法 当外标试样中各组分浓度变化范围不
35、大时，可不必绘制标准曲线，而用单点校正法，即配制一个和被测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样，由被测组分和外标组分的峰面积或峰高比来定量WiWiWsWs=AiAiAsAs内标法内标法将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据被测物和内标物的质量以及相应的峰面积比，求出含量m mi i=f=fi iA Ai im ms s=f=fs sA As sm mi im ms s=f fi iA Ai if fs sA As s内标校正曲线法和内标对比法内标校正曲线法和内标对比法配制一系列不同浓度的对照液，并加入相同量的内标物，进样分析，测得Ai和As，以Ai/As对对照溶液浓度作图。（
36、Ai/AsAi/As）样样=C Ci i 样样（Ai/AsAi/As）标标C Ci i 标标取咖啡因试样取咖啡因试样25.0mg，加入，加入10.0mg非那西丁，溶于氯仿，非那西丁，溶于氯仿，定容定容25.00ml。进样得色谱图。进样得色谱图1，记录峰面积。，记录峰面积。取咖啡因标准品取咖啡因标准品25.0mg，加入，加入10.0mg非那西丁，溶于氯仿，非那西丁，溶于氯仿，定容定容25.00ml。进样得色谱图。进样得色谱图2，记录峰面积。，记录峰面积。用纯物质的氯仿溶液进样，以确定各组分的峰位。由色谱用纯物质的氯仿溶液进样，以确定各组分的峰位。由色谱图图2计算咖啡因相对于非那西丁的相对校正因子
37、。由色谱计算咖啡因相对于非那西丁的相对校正因子。由色谱图图1按内标法求算咖啡因试样百分含量。按内标法求算咖啡因试样百分含量。咖啡因含量测定咖啡因含量测定七、在生化药物分析中的七、在生化药物分析中的应用应用 n氨基酸的分析：组成分析，含量。氨基酸的分析：组成分析，含量。n蛋白质、多肽的分析：蛋白质、多肽的分析：序列分析，含量，纯度，肽图。序列分析，含量，纯度，肽图。n糖类的分析：糖类的分析：n核酸的分析：核酸的分析：n其他其他:抗生素、维生素等抗生素、维生素等重组人胰岛素重组人胰岛素【鉴别鉴别】（l l）在效价测定项下记录的色谱图中，供试品溶液）在效价测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留
38、时间应与对照品溶液主峰的保留时间一主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。致。(2)(2)取本品适量，用取本品适量，用0.1%0.1%三氟醋酸溶液制成每三氟醋酸溶液制成每1ml1ml中含中含10mg10mg的的溶液，取溶液，取20ul20ul，加，加0.2rnol/L0.2rnol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液冲液(pH7.3)20ul(pH7.3)20ul、0.1%V80.1%V8酶溶液酶溶液20ul20ul与水与水140ul140ul，混匀，混匀，置置3737水浴中水浴中2 2小时后，加磷酸小时后，加磷酸3ul3ul，作为供试品溶液，另，作为供试品溶液，另
39、取重组人胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。取重组人胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照效价测定项下的方法，以照效价测定项下的方法，以0.2mol/L0.2mol/L硫酸盐缓冲液硫酸盐缓冲液pH,2.3pH,2.3一乙腈一乙腈(90:10)(90:10)为流动相为流动相A A，乙腈一水，乙腈一水50:5050:50为流动相为流动相B B，进行梯度洗脱。，进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各取对照品溶液和供试品溶液各25ul25ul，分别注人液相色，分别注人液相色谱仪。记录色谱图谱仪。记录色谱图,供试品的肽图谱应与对照品的肽图谱供试品的肽图谱应与对照品的肽图谱一致一致相关蛋
40、白质相关蛋白质 取本品适量，取本品适量，0.01mol/L盐酸溶液制成每盐酸溶液制成每1ml中含中含3.5mg的溶液，作为供试品溶液。照效价测定项下的方法，的溶液，作为供试品溶液。照效价测定项下的方法，以以0.2mol/L硫酸盐缓冲液硫酸盐缓冲液(pH2.3)一乙腈一乙腈(82:18)为流动相为流动相A，乙腈一水，乙腈一水(50：50)为流动相为流动相B，进行梯度洗脱。，进行梯度洗脱。调节流动相比例使重组人胰岛素主峰的保留时间约为调节流动相比例使重组人胰岛素主峰的保留时间约为25分钟，系统适用性试验应符合效价测定项下的规定。取供分钟，系统适用性试验应符合效价测定项下的规定。取供试品溶液试品溶液
41、20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，总相关蛋白质不得过法计算，总相关蛋白质不得过3.0%。【检查检查】高分子蛋白质高分子蛋白质 取本品适量，用取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每盐酸溶液制成每1ml中含中含4mg的溶液，作为供试品溶液。照分子排阻色谱法的溶液，作为供试品溶液。照分子排阻色谱法附录附录V H)试验。以色谱用亲水硅胶为填充剂试验。以色谱用亲水硅胶为填充剂(310urn;冰醋酸一冰醋酸一乙腈一乙腈一0.1%精氨酸溶液精氨酸溶液(15:20:65)为流动相，流速为每分为流动相，流速为每分钟钟0.5ml,检测波长为检测
42、波长为276nm。取重组人胰岛素单体一二聚。取重组人胰岛素单体一二聚体对照品用体对照品用0.01mol/L盐酸溶液制成每盐酸溶液制成每1ml中含中含4mg的溶液的溶液;取取100ul注人液相色谱仪，重组人胰岛素单体与二聚体的分注人液相色谱仪，重组人胰岛素单体与二聚体的分离度应符合要求。取供试品溶液离度应符合要求。取供试品溶液100ul，注人液相色谱仪，注人液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算，高分子蛋白质总量不记录色谱图，按峰面积归一化法计算，高分子蛋白质总量不得过得过1.0%。照高效液相色谱法照高效液相色谱法(附录附录V D)测定。测定。色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试
43、验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（充剂（510um）;0.2rnol/L硫酸盐缓冲液硫酸盐缓冲液(取无水硫酸钠取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸，加水溶解后，加磷酸2.7rnl、水、水800ml，用乙醇胺调，用乙醇胺调节节pH值至值至2.3,加水至加水至1000ml-乙腈乙腈(74：26，或适宜比例，或适宜比例)为为流动相流动相;柱温为柱温为40，检侧波长为，检侧波长为214nm,取重组人胰岛素对照取重组人胰岛素对照品，用品，用0.0lmol/L盐酸溶液制成每盐酸溶液制成每1rnl中含中含lmg的溶液，室温的溶液，室温放置至少放置至少24小时后，取小时后，取
44、20ul注人液相色谱仪，胰岛素峰与注人液相色谱仪，胰岛素峰与A21脱氨胰岛素峰的分离度不小于脱氨胰岛素峰的分离度不小于1.8，拖尾因子不大于，拖尾因子不大于1.8。测定法测定法 取本品适量，精密称定，用取本品适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶液盐酸溶液定量稀释制成每定量稀释制成每1rnl中含中含10单位的溶液单位的溶液(临用新配临用新配)。精密量取。精密量取20ul注人液相色谱仪，记录色谱图。另取重组人胰岛素对照品注人液相色谱仪，记录色谱图。另取重组人胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积什算，即得。适量，同法测定。按外标法以峰面积什算，即得。【效价测定效价测定】分析时的要点：分
45、析时的要点：1反相反相HPLC(RPC)n孔径孔径30nm的的C3-C8或氰基键合硅胶固定相应用较多。或氰基键合硅胶固定相应用较多。n采用中等极性的反相色谱固定相、以异丙醇采用中等极性的反相色谱固定相、以异丙醇磷酸盐缓冲溶磷酸盐缓冲溶液作流动相，在液作流动相，在pH37范围分离能够保持其生物活性。范围分离能够保持其生物活性。n保留值较小的小肽通过与自由氨基端和碱性氨基酸保留值较小的小肽通过与自由氨基端和碱性氨基酸(当以当以TFA作缓冲剂时作缓冲剂时)结合成离子对，从而使保留值增大。结合成离子对，从而使保留值增大。n大多数肽与蛋白质用浓度小于大多数肽与蛋白质用浓度小于60的的ACN即可洗脱，一般
46、初即可洗脱，一般初始试验选择始试验选择0-60的的ACN，肽，肽30min、蛋白质、蛋白质60min。n高温使谱峰变窄，压力降低，低高温使谱峰变窄，压力降低，低PH、高温条件下分离对于蛋、高温条件下分离对于蛋白质分离。白质分离。n波长下检测波长下检测(210nm)，分离中用磷酸代替，分离中用磷酸代替TFA，可以增强，可以增强在在200nm处的检测灵敏度处的检测灵敏度2 2 离子交换色谱适宜于分离相对分子质量大于离子交换色谱适宜于分离相对分子质量大于2000020000的蛋白质。的蛋白质。这种分离模式能够保持蛋白质等生物大分子的天然构象和生这种分离模式能够保持蛋白质等生物大分子的天然构象和生物活
47、性。物活性。3 3 体积排除色谱法的柱效相对较低，不太适合用于分析复杂的体积排除色谱法的柱效相对较低，不太适合用于分析复杂的生物样品。与生物分子的相对分子质量和形态有很大关系。生物样品。与生物分子的相对分子质量和形态有很大关系。4 4 硅胶填料粒径较小，柱效比聚合物基质填料与琼脂糖基质填硅胶填料粒径较小，柱效比聚合物基质填料与琼脂糖基质填料高料高多糖的分析多糖的分析多糖的性质：多糖的性质：分子量大，极性强，结构的微观不均一性。分子量大，极性强，结构的微观不均一性。多糖多糖n柱型：凝胶过滤，离子交换柱型：凝胶过滤，离子交换,正相色谱，反相正相色谱，反相色谱等色谱等n检测检测：示差折光检测器、蒸发
48、光散射检测器示差折光检测器、蒸发光散射检测器芦荟多糖的组成研究芦荟多糖的组成研究n重要试剂：重要试剂：苯基甲基吡唑啉酮（苯基甲基吡唑啉酮（PMP）、鼠李）、鼠李糖（糖（Rha）、木糖（）、木糖（Xyl）、甘露糖（）、甘露糖（Man）、葡）、葡萄糖（萄糖（Glc）、半乳糖（）、半乳糖（Gal）n衍生物的制备衍生物的制备n分别称取分别称取Gal、Rha、Glc和和Man各各0.018g，Xyl0.015g，溶，溶于于7.5ml0.3mol/lNaOH溶液中。取该溶液溶液中。取该溶液75l与与5010.5mol/lPMP甲醇溶液混合，在甲醇溶液混合，在70下反应下反应30min，冷却至，冷却至室温，
49、加入室温，加入75l0.3mol/lHCl进行中和，中和后的溶液放入真进行中和，中和后的溶液放入真空干燥箱中，于空干燥箱中，于100下烘干。烘干后的物质用下烘干。烘干后的物质用ml的去离子的去离子水及水及1ml的氯仿溶解，充分振荡后除去有机相。重复次。的氯仿溶解，充分振荡后除去有机相。重复次。水相溶液经水相溶液经0.45m滤膜过滤后，用水稀释至滤膜过滤后，用水稀释至ml，置于冰箱，置于冰箱中保存备用。中保存备用。糖链与衍生化试剂糖链与衍生化试剂PMP的反应机理的反应机理流动相：流动相：100mmol醋酸胺缓冲溶液（醋酸胺缓冲溶液（pH5.5）/乙腈乙腈（体积比为（体积比为:），等度洗脱，），等度洗脱，流速：流速：1ml/min；紫外检测波长：紫外检测波长：245nm；进样量：进样量：10；柱温：室温。柱温：室温。nHPLC 条件条件核酸分析核酸分析n性质：碱基对、磷酸、戊糖。性质：碱基对、磷酸、戊糖。n分离常用反相色谱或离子交换分离常用反相色谱或离子交换n检测波长：检测波长：260260n通常使用的缓冲液为通常使用的缓冲液为pH 7pH 7的的10-20mmol/L10-20mmol/L的磷酸盐的磷酸盐或或TrisTris缓冲液，缓冲液，含含0.1mol0.1molL L三乙胺三乙胺(TEA)(TEA)乙酸盐乙酸盐
