1、第六章 生物工艺的控制温度、pH、氧气、二氧化碳泡沫发酵染菌的防治与处理发酵过程参数监测 发酵是一种很发酵是一种很复杂复杂的生产过程，其好坏涉及的生产过程，其好坏涉及诸多诸多因素因素，如菌种的生产性能、培养基的配比、原料质量、，如菌种的生产性能、培养基的配比、原料质量、灭菌条件、种子质量、发酵条件和过程控制等。灭菌条件、种子质量、发酵条件和过程控制等。不论是老或新品种，都必须经过不论是老或新品种，都必须经过发酵研究发酵研究这一阶这一阶段，以考察其代谢规律、影响产物合成的因素，优化段，以考察其代谢规律、影响产物合成的因素，优化发酵工艺条件。发酵工艺条件。高产菌种对工艺条件的波动比低产菌种更敏感，
2、高产菌种对工艺条件的波动比低产菌种更敏感，故掌握生产菌种的代谢规律和发酵调控的基本知识对故掌握生产菌种的代谢规律和发酵调控的基本知识对生产的稳定和提高具有重要的意义。生产的稳定和提高具有重要的意义。6.1 发酵过程的操作类型6.1.1 分批发酵分批发酵 是指在一个是指在一个密闭系统密闭系统内投入有限数量的营养物质后，内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成特定的条件下只完成一个生长周期一个生长周期的微生物培养方法。的微生物培养方法。一次投料，一次接种，一次收获一次投料，一次接种，一次收获
3、间歇培养间歇培养分批发酵过程一般可粗分为四期，即适应（停滞）期、分批发酵过程一般可粗分为四期，即适应（停滞）期、对数生长期、生长稳定期和死亡期；也可细分为六期：对数生长期、生长稳定期和死亡期；也可细分为六期：即停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡期。即停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡期。一、初级代谢的代谢变化：初级代谢的代谢变化：初级代谢是生命细胞在生命活动过程中所进行的代谢初级代谢是生命细胞在生命活动过程中所进行的代谢活动，其产物为初级代谢产物。菌体的生长过程显示生长活动，其产物为初级代谢产物。菌体的生长过程显示生长史的特征。史的特征。但在发酵过程中，即使是同一种菌体，由
4、于菌体的生但在发酵过程中，即使是同一种菌体，由于菌体的生理状态和培养条件的不同，各期的生长长短就有所不同。理状态和培养条件的不同，各期的生长长短就有所不同。生产中要求在对数期接种原因就在此。生产中要求在对数期接种原因就在此。初级代谢没有明显的产物形成期初级代谢没有明显的产物形成期，产物随着菌体，产物随着菌体生长在不断的进行合成，有的与菌体的生长呈平行关生长在不断的进行合成，有的与菌体的生长呈平行关系。如乳酸、醋酸，系。如乳酸、醋酸，与与p顶峰几乎在同一时期出顶峰几乎在同一时期出现，而氨基酸、酶、核酸的发酵过程比前者复杂，它现，而氨基酸、酶、核酸的发酵过程比前者复杂，它的的 与与p的大小则随培养
5、基成分、碳源、温度、菌的大小则随培养基成分、碳源、温度、菌株等不同而变化。株等不同而变化。二、次级代谢产物变化二、次级代谢产物变化次级代谢产物包括大多数的抗生素、生物次级代谢产物包括大多数的抗生素、生物碱和微生物毒素等物质。它们的发酵属于碱和微生物毒素等物质。它们的发酵属于生长生长与产物非偶联与产物非偶联的类型，一般分为的类型，一般分为菌体生长、产菌体生长、产物合成和菌体自溶个阶段。物合成和菌体自溶个阶段。菌体生长阶段菌体生长阶段：接种后，菌体开始生长，直达到菌体的临界浓度。接种后，菌体开始生长，直达到菌体的临界浓度。同时，营养物质进行分解代谢，不断的消耗，浓度明同时，营养物质进行分解代谢，不
6、断的消耗，浓度明显减少，溶氧浓度逐渐降低到一定的水平，其中某一显减少，溶氧浓度逐渐降低到一定的水平，其中某一参数可能成为菌体生长的限制因素，使菌体生长速度参数可能成为菌体生长的限制因素，使菌体生长速度减慢，积累了相当量的某些代谢中间体，原有的酶活减慢，积累了相当量的某些代谢中间体，原有的酶活力下降，出现了与次级代谢有关的酶，其酶解除了控力下降，出现了与次级代谢有关的酶，其酶解除了控制等原因，导致菌体的生理状况发生改变，菌体就从制等原因，导致菌体的生理状况发生改变，菌体就从生长阶段转入产物合成阶段。生长阶段转入产物合成阶段。这一阶段又称为菌体的这一阶段又称为菌体的生长期或发酵前期生长期或发酵前期
7、。产物合成阶段产物合成阶段：产物数量逐渐增多，直至达到高峰，生产速率也达到产物数量逐渐增多，直至达到高峰，生产速率也达到最大，直至产物合成能力衰减。此阶段，营养物质不断被最大，直至产物合成能力衰减。此阶段，营养物质不断被消耗，产物不断被合成。环境因素很重要，发酵条件应严消耗，产物不断被合成。环境因素很重要，发酵条件应严格控制，方有利于产物合成。格控制，方有利于产物合成。营养物质过多，菌体就进行生长繁殖，抑制产物合成营养物质过多，菌体就进行生长繁殖，抑制产物合成，使产物量降低；如果过少，菌体就衰老，产物合成能力，使产物量降低；如果过少，菌体就衰老，产物合成能力就下降，产量减少。就下降，产量减少。
8、这一阶段又称为这一阶段又称为产物分泌期或发酵中期产物分泌期或发酵中期。菌体自溶阶段菌体自溶阶段：菌体衰老，细胞开始自溶，氨氮含量增加，菌体衰老，细胞开始自溶，氨氮含量增加，p上上升，产物合成能力衰退，生产速率下降，此时应必须升，产物合成能力衰退，生产速率下降，此时应必须结束发酵，否则，影响产品的提取。结束发酵，否则，影响产品的提取。这一阶段又称为菌体的这一阶段又称为菌体的自溶期或发酵后期自溶期或发酵后期。分批发酵的优缺点：分批发酵的优缺点：操作简单、周期短操作简单、周期短染菌的机会减少染菌的机会减少生产过程、产品质量易掌握生产过程、产品质量易掌握不适用于测定过程动力学不适用于测定过程动力学对基
9、质浓度敏感的产物，用分批发酵不合适对基质浓度敏感的产物，用分批发酵不合适6.1.2 补料分批发酵补料分批发酵一种一种介于分批培养和连续培养之间介于分批培养和连续培养之间的操作方式。的操作方式。在进行分批培养的过程中，向反应器内加入培在进行分批培养的过程中，向反应器内加入培养基的一种或多种成分，以达到延长生产期和控制养基的一种或多种成分，以达到延长生产期和控制培养过程的目的。培养过程的目的。没有输出或间歇放掉部分发酵液（没有输出或间歇放掉部分发酵液（半连续发酵半连续发酵）补料分批发酵补料分批发酵与传统分批发酵相比与传统分批发酵相比，其优点在于使发，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。酵系统
10、中维持很低的基质浓度。低基质浓度低基质浓度的优点：的优点：1）可解除底物抑制，产物的反馈抑制和快速利用碳）可解除底物抑制，产物的反馈抑制和快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧的矛盾；剧供氧的矛盾；2）可降低培养基的黏度，并尽可能地延长产物的形）可降低培养基的黏度，并尽可能地延长产物的形成时间。成时间。3）避免培养基积累有毒代谢物。）避免培养基积累有毒代谢物。与连续发酵相比与连续发酵相比，补料分批发酵不需要严格的无菌条，补料分批发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题。件，也不会产生菌种老化和变异等问题。半连
11、续发酵的不足：半连续发酵的不足：1）放掉发酵液的同时也丢失了未利用的）放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分养分和和处于生产旺盛期的处于生产旺盛期的菌体菌体；2）定期补充和带放使发酵液稀释，送去）定期补充和带放使发酵液稀释，送去提取提取的的发酵液体积更大；发酵液体积更大；3）发酵液被稀释后可能产生更多的代谢）发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物有害物，最终限制发酵产物的合成；最终限制发酵产物的合成；4）一些经代谢产生的）一些经代谢产生的前体前体可能丢失；可能丢失；5）有利于非产生菌）有利于非产生菌突变株突变株的生长的生长6.1.3 连续发酵连续发酵 连续培养或连续发酵是指以一定的速度向连续培养
12、或连续发酵是指以一定的速度向培养系统内培养系统内添加新鲜的培养基添加新鲜的培养基，同时以相同的，同时以相同的速度速度流出培养液流出培养液，使培养系统内培养液的，使培养系统内培养液的液量液量维持恒定维持恒定的微生物培养方式。的微生物培养方式。连续发酵的优缺点：连续发酵的优缺点：1）可提高设备利用率和单位时间的产量，节省发）可提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间；酵罐的非生产时间；2）便于自动控制；）便于自动控制；3）增加了染菌机会：长时间不断地向发酵系统供）增加了染菌机会：长时间不断地向发酵系统供给无菌空气和培养基；给无菌空气和培养基；4）菌种发生变异的可能性较大。）菌种发生变
13、异的可能性较大。6.2 发酵条件的影响及其控制 微生物发酵的生产水平取决于微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性生产菌种的特性和和发酵条件的控制发酵条件的控制。了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映菌了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映菌的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助人们的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。有效地控制微生物的生长和生产。常规的发酵条件：常规的发酵条件：罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体，通氨速率以及补水等。位、补料、加糖、油或前体，通氨速率以及补水等
14、。表征过程性质的表征过程性质的状态参数状态参数：pH、溶氧（、溶氧（DO）、溶解）、溶解CO2、氧化还原电位、尾气、氧化还原电位、尾气O2和和CO2 含量、基质或产物浓度、代谢中间物或前体含量、基质或产物浓度、代谢中间物或前体浓度、菌浓等。浓度、菌浓等。间接状态参数间接状态参数：比生长速率、摄氧率、释放速率（比生长速率、摄氧率、释放速率（CER）、呼吸商）、呼吸商（RQ）、基质消耗速率和产物合成速率等。）、基质消耗速率和产物合成速率等。基质是产生菌代谢的物质基础，既涉及菌基质是产生菌代谢的物质基础，既涉及菌体的生长繁殖，又涉及代谢产物的形成。体的生长繁殖，又涉及代谢产物的形成。6.2.1 基质
15、浓度对发酵的影响及其补料控制基质浓度对发酵的影响及其补料控制 在分批发酵中，当基质过量时，菌体的生长速率与在分批发酵中，当基质过量时，菌体的生长速率与营养成分的浓度无关。营养成分的浓度无关。：菌体的生长比速：菌体的生长比速Ks：半饱和常数：半饱和常数 S：限制性基质浓度：限制性基质浓度max:最大比生长速度最大比生长速度 在在S ks的情况下，比生长速率与基质浓度呈线性关系。的情况下，比生长速率与基质浓度呈线性关系。maxsSKS在在S 10ks时，比生长速率就接近最大值。时，比生长速率就接近最大值。所以营养物质均存在一个上限浓度，在此所以营养物质均存在一个上限浓度，在此浓度以内，菌体的比生长
16、速率随浓度增加而增浓度以内，菌体的比生长速率随浓度增加而增加，但超过此限，浓度继续增加，反而会引起加，但超过此限，浓度继续增加，反而会引起生长速率下降，这种效应称生长速率下降，这种效应称基质的抑制作用基质的抑制作用。在正常的情况下，可达到最大比生长速率，然而在正常的情况下，可达到最大比生长速率，然而，由于代谢产物及其基质过浓，而导致抑制作用，出，由于代谢产物及其基质过浓，而导致抑制作用，出现比生长速率下降的趋势。现比生长速率下降的趋势。e.g.G 100150g/l，不出现抑制，不出现抑制 G 350500g/l，多数微生物，多数微生物 不能生长，不能生长，细胞脱水。细胞脱水。就产物就产物 的
17、形成来说，的形成来说，培养基过于丰富培养基过于丰富，有时会使菌体生长过旺，黏度增大，传质差，有时会使菌体生长过旺，黏度增大，传质差，菌体不得不花费较多的能量来维持其生存环菌体不得不花费较多的能量来维持其生存环境，即用境，即用 于非生产的能量大大增加，这对于非生产的能量大大增加，这对产产物合成不利物合成不利。（1）碳源的种类和浓度的影响和控制碳源的种类和浓度的影响和控制 碳源分为碳源分为迅速利用迅速利用的碳源和的碳源和缓慢利用缓慢利用的碳源。迅的碳源。迅速利用的碳源能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生速利用的碳源能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量，并分解产物（如丙酮酸），有利于菌体的生长。能量
18、，并分解产物（如丙酮酸），有利于菌体的生长。但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用。但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用。慢速利用的碳源慢速利用的碳源为菌体缓慢利用，有利于延长代为菌体缓慢利用，有利于延长代谢谢 产物的合成（如抗生素），许多药物发酵采用。产物的合成（如抗生素），许多药物发酵采用。例例如乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油分别是青霉素、头孢如乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油分别是青霉素、头孢菌素菌素C、盐霉素、核黄素及生物碱发酵的最适碳源。、盐霉素、核黄素及生物碱发酵的最适碳源。因此选择最适碳源对提高代谢产物产量是很重要的。因此选择最适碳源对提高代谢产物产量是很重要的。在工业上
19、，发酵培养基中常采用迅速和缓慢利用在工业上，发酵培养基中常采用迅速和缓慢利用的混合碳源，来控制菌体的生长和产物的合成的混合碳源，来控制菌体的生长和产物的合成。碳源的浓度碳源的浓度也对发酵有影响。由于过于丰富所引起也对发酵有影响。由于过于丰富所引起的菌体异常繁殖，对菌体的代谢和产物合成和氧的传的菌体异常繁殖，对菌体的代谢和产物合成和氧的传递会产生不良影响。若产生阻遏作用的碳源用量过大，递会产生不良影响。若产生阻遏作用的碳源用量过大，则产物的合成会受到明显的抑制。反之，仅仅供给维则产物的合成会受到明显的抑制。反之，仅仅供给维持量的碳源，菌体生长和产物的合成就都停止。所以持量的碳源，菌体生长和产物的
20、合成就都停止。所以控制合适的碳源浓度是非常重要的。控制合适的碳源浓度是非常重要的。控制碳源的浓度，可采用控制碳源的浓度，可采用经验法和动力学经验法和动力学法，即法，即在发酵过程中采用在发酵过程中采用中间补科中间补科的方法来控制。这要根据的方法来控制。这要根据不同代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方法。不同代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方法。动力学方法是根根菌体的比生长速率、糖比消耗速率动力学方法是根根菌体的比生长速率、糖比消耗速率及产物的比生成速率等动力学参数来控制。及产物的比生成速率等动力学参数来控制。2）氮源的种类和浓度的影响和控制）氮源的种类和浓度的影响和控制 氮源象碳源一样氮源
21、象碳源一样,也有也有迅速利用的氮源迅速利用的氮源和和缓慢利用缓慢利用的氮源。的氮源。迅速利用的氮源有：氨基态氮的氨基酸、硫酸铵、迅速利用的氮源有：氨基态氮的氨基酸、硫酸铵、玉米浆。玉米浆。慢速利用的氮源有：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽慢速利用的氮源有：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等蛋白质。饼粉等蛋白质。快速利用氮源容易被菌体所利用，促进菌体生长快速利用氮源容易被菌体所利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，特别是某些抗生素的合成但对某些代谢产物的合成，特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。如链霉菌的竹桃霉素发酵产生调节作用，影响产量。如链霉菌的竹桃霉素发酵中，采用促进菌体生长的铵盐，能
22、刺激菌丝生长，但中，采用促进菌体生长的铵盐，能刺激菌丝生长，但抗生素产量下降。抗生素产量下降。缓慢利用的氮源对延长次级代谢产物的分泌期，缓慢利用的氮源对延长次级代谢产物的分泌期，提高产物的产量是有好处的提高产物的产量是有好处的。但一次投入，也容易促。但一次投入，也容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体过早衰老而自进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体过早衰老而自溶，从而缩短产物的分泌期，因而要选择适当的氮源溶，从而缩短产物的分泌期，因而要选择适当的氮源和适当的浓度。和适当的浓度。发酵培养基一般是选用含有发酵培养基一般是选用含有快速和慢速利用的混快速和慢速利用的混合氮源合氮源。如氨基酸发酵用铵盐和
23、麸皮水解液、玉米浆；。如氨基酸发酵用铵盐和麸皮水解液、玉米浆；链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。但也有使用单一链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。但也有使用单一的铵盐或有机氮源的铵盐或有机氮源(如黄豆饼粉如黄豆饼粉)。它们被利用的情况与。它们被利用的情况与快速和慢速利用的碳源情况相同。快速和慢速利用的碳源情况相同。为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶，生产中为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶，生产中也要控制氮源的浓度，除了在基础培养基中控制氮源也要控制氮源的浓度，除了在基础培养基中控制氮源浓度外，在发酵过程中，浓度外，在发酵过程中，补加氮源补加氮源来控制浓度。来控制浓度。（2 2）磷酸盐浓度的影响和控
24、制磷酸盐浓度的影响和控制 磷是微生物生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产磷是微生物生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的。微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为物所必需的。微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32-300 mmol0.32-300 mmol，但，但对次级代谢产物合成良好所允许的最对次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为高平均浓度仅为1.0 mmol1.0 mmol，提高到，提高到10mmol10mmol，就明显影响，就明显影响其合成。其合成。磷酸盐浓度在初级代谢中的要求不如次级代磷酸盐浓度在初级代谢中的要求不如次级代谢严格。谢严格。对抗生素来说，常常是采用生长亚适量
25、（对对抗生素来说，常常是采用生长亚适量（对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量）磷酸菌体生长不是最适合但又不影响生长的量）磷酸盐浓度盐浓度，其最适浓度取决于菌种特征、培养条件、，其最适浓度取决于菌种特征、培养条件、培养基的组成和来源等因素。培养基的组成和来源等因素。6.2.2 灭菌情况灭菌情况 一般随灭菌温度的升高，时间的延长，对养分的一般随灭菌温度的升高，时间的延长，对养分的破坏作用越大，从而影响产物的合成。破坏作用越大，从而影响产物的合成。如葡萄糖氧化酶发酵培养基的灭菌条件对产酶的影响：如葡萄糖氧化酶发酵培养基的灭菌条件对产酶的影响：灭菌蒸汽压力灭菌蒸汽压力/(lb/in2)1015时间时
26、间/min15251525葡萄糖氧化酶酶活葡萄糖氧化酶酶活/(U/mL)48.0843.7235.0427.106.2.3 种子质量种子质量接种菌龄接种菌龄 一般，接种菌龄以一般，接种菌龄以对数生长期的后期对数生长期的后期，即培养，即培养液中菌浓接近高峰时所需的时间较为适宜。液中菌浓接近高峰时所需的时间较为适宜。最适的接种菌龄要经多次试验，根据其最终发最适的接种菌龄要经多次试验，根据其最终发酵结果而定。酵结果而定。接种量接种量 接种量的大小是由发酵罐中菌的接种量的大小是由发酵罐中菌的生长繁殖速生长繁殖速度度决定的。决定的。菌体浓度菌体浓度 菌体浓度简称菌浓（菌体浓度简称菌浓（cell conc
27、entration）是指单位）是指单位体积培养液中菌体的含量。菌浓的大小与菌体生长速体积培养液中菌体的含量。菌浓的大小与菌体生长速率有很大的关系，菌体生长速率与微生物的种类及遗率有很大的关系，菌体生长速率与微生物的种类及遗传特性有关，不同种类的微生物的生长速率是不一样传特性有关，不同种类的微生物的生长速率是不一样的，细胞越复杂，分裂所需的时间越长。的，细胞越复杂，分裂所需的时间越长。菌浓的大小对发酵产物有很重要的影响。菌浓的大小对发酵产物有很重要的影响。在适当的比生长速率的条件下，发酵产物的产率在适当的比生长速率的条件下，发酵产物的产率与与菌浓成正比关系，即菌浓越大，产物的产量越大。与与菌浓成
28、正比关系，即菌浓越大，产物的产量越大。但在好氧发酵中，菌浓太大，影响氧的传递，故但在好氧发酵中，菌浓太大，影响氧的传递，故在发在发酵中应控制适当的菌浓酵中应控制适当的菌浓。6.2.4 温度对发酵的影响和及其控制温度对发酵的影响和及其控制 微生物的生长和产物的合成都是在各种微生物的生长和产物的合成都是在各种酶酶催催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境稳定而合适的温度环境。(1)温度对微生物生长的影响温度对微生物生长的影响 大多数微生物在大多数微生物在20-40的温度范围内生长。嗜冷菌的
29、温度范围内生长。嗜冷菌在温度低于在温度低于20下生长速率最大，嗜中温菌在下生长速率最大，嗜中温菌在30-35左右生长，嗜热菌在左右生长，嗜热菌在50以上生长。以上生长。(2)温度对发酵过程的影响温度对发酵过程的影响 温度对青霉菌生长速率、呼吸强度和青霉素生产速温度对青霉菌生长速率、呼吸强度和青霉素生产速率的影响如上图所示。可以看出，温度对参与率的影响如上图所示。可以看出，温度对参与生长繁殖生长繁殖、呼吸呼吸和和青霉素形成青霉素形成的各种酶的影响是不同的。的各种酶的影响是不同的。青霉菌：青霉菌：生长生长 E=34 kJ/mol 呼吸呼吸 E=71 kJ/mol 产物合成产物合成 E=112 kJ
30、/mol 青霉素形成速率青霉素形成速率对温度最为敏感，偏离最适温度引对温度最为敏感，偏离最适温度引起的生产率下降比其他两个参数的变化更为严重。起的生产率下降比其他两个参数的变化更为严重。活化能活化能E反映温度变化对酶反应速率的影响反映温度变化对酶反应速率的影响(3)温度对发酵液物理性质的影响温度对发酵液物理性质的影响影响氧在发酵液中的溶解度影响氧在发酵液中的溶解度 温度温度 溶氧溶氧影响基质的分解速率影响基质的分解速率 如菌体对硫酸盐吸收在如菌体对硫酸盐吸收在25时最小时最小(4)温度对生物合成方向的影响温度对生物合成方向的影响3035金霉素四环素金色链丝菌金色链丝菌 研究发现，温度与研究发现
31、，温度与微生物的调节机制微生物的调节机制关系密切。关系密切。例如，在例如，在20时，氨基酸末端产物对其合成途径的时，氨基酸末端产物对其合成途径的第一个酶的反馈抑制作用，比在其正常生长温度第一个酶的反馈抑制作用，比在其正常生长温度37时更大。因此，考虑时更大。因此，考虑在抗生素发酵的后期降低在抗生素发酵的后期降低温度温度，加强氨基酸的反馈抑制作用，使蛋白质和核，加强氨基酸的反馈抑制作用，使蛋白质和核酸的正常合成途径关闭得早些，从而使发酵代谢转酸的正常合成途径关闭得早些，从而使发酵代谢转向抗生素的合成。向抗生素的合成。（5）影响发酵温度的因素）影响发酵温度的因素发酵热发酵热 发酵热指的是发酵过程中
32、释放出来的净热发酵热指的是发酵过程中释放出来的净热量，以量，以J/(m3h)为单位表示。为单位表示。辐射显蒸发搅拌生物发酵QQQQQQ 生物热生物热：生产菌在生长繁殖过程中产生的热叫生物热。：生产菌在生长繁殖过程中产生的热叫生物热。营养基质被菌体分解产生大量的热能，部分用于合成营养基质被菌体分解产生大量的热能，部分用于合成高能化合物高能化合物ATP，供给合成代谢所需要的能量，多余的热，供给合成代谢所需要的能量，多余的热量则以热能的形式释放出来，形成生物热。量则以热能的形式释放出来，形成生物热。搅拌热搅拌热：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所
33、产生的热能。间的摩擦所产生的热能。Q搅拌搅拌 P 蒸发热蒸发热：空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后，进行空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后，进行热交换，必然引起水分的蒸发，被空气和蒸发水分带走热交换，必然引起水分的蒸发，被空气和蒸发水分带走的热量。的热量。Q蒸发蒸发 =G（I出出-I进）进）辐射热辐射热：由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中：由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热能通过罐体向大气辐射的热量。的部分热能通过罐体向大气辐射的热量。显热显热：废气因温度差异所带走的热量。：废气因温度差异所带走的热量。发酵热在整个发酵过程中是发酵热在整个发酵过程中是随时间变化随时间变化的。所以
34、，的。所以，为使发酵在一定温度下进行，必须采取措施为使发酵在一定温度下进行，必须采取措施在夹套在夹套或蛇管内通入冷水或蛇管内通入冷水加以控制（小型的发酵罐，在冬季和加以控制（小型的发酵罐，在冬季和发酵初期，散热量大于产热量则需用热水保温。）发酵初期，散热量大于产热量则需用热水保温。）（6）最适温度的选择最适温度的选择 所谓最适温度是指在该温度下最适于所谓最适温度是指在该温度下最适于菌的菌的生长生长或或产物的合成产物的合成。对不同的。对不同的菌种菌种、不同的、不同的培养培养条件条件、不同的、不同的酶反应酶反应以及不同的以及不同的生长阶段生长阶段，最适，最适温度有所不同。温度有所不同。最适生长温度
35、与最适生产温度往往是不一致的最适生长温度与最适生产温度往往是不一致的。如乳酸发。如乳酸发酵，乳链球菌最适生长温度是酵，乳链球菌最适生长温度是34 C，而产酸最多的温度是，而产酸最多的温度是30 C，但发酵速度最高的温度达但发酵速度最高的温度达40 C。青霉素产生菌的最适生长温度。青霉素产生菌的最适生长温度为为30，但产生青霉素的最适温度是，但产生青霉素的最适温度是24.7。发酵温度的确定，在理论上，整个发酵过程中不应只选一发酵温度的确定，在理论上，整个发酵过程中不应只选一个培养温度，应根据发酵的不同时期，选择不同的培养温度。个培养温度，应根据发酵的不同时期，选择不同的培养温度。生长阶段，选最适
36、生长温度，在产物分泌阶段，选最适生产生生长阶段，选最适生长温度，在产物分泌阶段，选最适生产生产温度。即产温度。即变温控制变温控制。e.g 青霉素变温发酵青霉素变温发酵 起初起初5小时，维持在小时，维持在30 C，以后降到，以后降到25 C培养培养5小时，再小时，再降到到降到到20 C培养培养28小时，最后又提高到小时，最后又提高到25 C，培养，培养40小时，放小时，放罐。青霉素的产量比在罐。青霉素的产量比在25 C恒温发酵条件下提高恒温发酵条件下提高14.7%。在不同的发酵阶段选择不同的温度在不同的发酵阶段选择不同的温度考虑培养基成分和浓度考虑培养基成分和浓度 例如，在使用较稀薄或较易利用的
37、培养基时，例如，在使用较稀薄或较易利用的培养基时，提高温度则养分往往过早耗竭，导致菌丝过早自溶，提高温度则养分往往过早耗竭，导致菌丝过早自溶，产量降低。产量降低。参考其它发酵条件参考其它发酵条件 例如，通气条件较差的情况下，可以适当降低温例如，通气条件较差的情况下，可以适当降低温度，一方面增加溶解氧浓度，另一方面降低菌体的生度，一方面增加溶解氧浓度，另一方面降低菌体的生长速率，以弥补因通气不足而造成的代谢异常。长速率，以弥补因通气不足而造成的代谢异常。发酵过程中培养液的发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项境条件下代谢活动的综合指标，是一项
38、重要的发重要的发酵参数酵参数，它对菌体的生长和产品的积累有很大的它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。影响。6.2.5 pH对发酵的影响和及其控制对发酵的影响和及其控制（1）pH对发酵过程的影响对发酵过程的影响pH影响菌体的生长和产物的合成：影响菌体的生长和产物的合成：（1）影响影响酶的活性酶的活性，当当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；碍菌体的新陈代谢；（2）菌体的形态菌体的形态：pH值还会影响某些霉菌的形态，如值还会影响某些霉菌的形态，如细胞壁厚细胞壁厚度、菌丝直径。度、菌丝直径。（3）细胞膜的电荷状态细胞膜的电荷状态：引起膜渗透性的变
39、化，从而影响菌对引起膜渗透性的变化，从而影响菌对养分的吸收和代谢产物的分泌养分的吸收和代谢产物的分泌（4）产物的稳定性产物的稳定性（5）对）对某些生物合成途径某些生物合成途径有显著影响：有显著影响：pH值往往引起菌体值往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的产量和比例发生改变。代谢过程的不同，使代谢产物的产量和比例发生改变。微生物生长和生物合成的最适微生物生长和生物合成的最适pH微生物生长：微生物生长：细菌（细菌（6.37.5),霉菌和酵母菌（霉菌和酵母菌（36),放线菌（放线菌（78)微生物生长阶段和产物合成阶段的最适微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH往往往不一样往不一样，这不仅与菌种的
40、特性有关，也取决于产，这不仅与菌种的特性有关，也取决于产物的化学性质。物的化学性质。e.g.Clostridium acetobutylicum fenmentation:pH在中在中性时，菌种生长良好，但产物产量很低性时，菌种生长良好，但产物产量很低，实际发酵合适实际发酵合适的的pH值。值。Streptomyces grisus fermentation 生产链霉素生产链霉素（streptomycin）:菌体生长的合适菌体生长的合适pH 值为值为6.36.9，而合成，而合成链霉素的链霉素的pH 值为值为6.77.3。因此，应根据发酵过程的不同。因此，应根据发酵过程的不同阶段分别控制不同的阶段
41、分别控制不同的pH 值。在生产过程中，及时进行调值。在生产过程中，及时进行调节和控制合适的节和控制合适的pH值，以满足不同阶段的需要。值，以满足不同阶段的需要。但同一产品的合适但同一产品的合适pH 值，还因菌种、培养基组值，还因菌种、培养基组成和培养条件有关。成和培养条件有关。在确定合适的在确定合适的pH 值时，还要考虑培养温度的影响，值时，还要考虑培养温度的影响，若温度不同合适的若温度不同合适的pH 值也可能发生变动。值也可能发生变动。产品菌生长最适pH范围 产物合成最适pH范围青霉素6.57.26.26.8链霉素6.36.96.77.3四环素6.16.65.96.3土霉素6.06.65.8
42、6.1红霉素6.67.06.87.3灰黄霉素 6.47.06.26.5几种抗生素发酵的最适pH范围（2）发酵过程中发酵过程中pH的变化的变化 发酵过程中，由于菌种在一定温度及通气条件发酵过程中，由于菌种在一定温度及通气条件下对培养基中碳、氮源等的利用，随着下对培养基中碳、氮源等的利用，随着有机酸有机酸或或氨氨基氮基氮的积累，会使的积累，会使pH产生一定的变化。这种变化的产生一定的变化。这种变化的根源是根源是培养基的成分和微生物的代谢特性。培养基的成分和微生物的代谢特性。引起培养液的引起培养液的pH发生波动的因素发生波动的因素引起引起pH下降的因素下降的因素：1）培养基中碳、氮比例不当，碳源过多
43、，特别是）培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累致使有机酸大量积累2）消沫油加得过多）消沫油加得过多3）生理酸性物质的存在）生理酸性物质的存在引起引起pH上升的因素上升的因素：1）氮源过多）氮源过多2）生理碱性物质存在）生理碱性物质存在3）中间补料中氨水或尿素等的碱性物质加入过多）中间补料中氨水或尿素等的碱性物质加入过多（3）最适最适pH的选择和调节的选择和调节选择最适选择最适pH的原则：既有利于的原则：既有利于菌体的生长繁殖菌体的生长繁殖，又要最大限度地使产物合成获得又要最大限度地使产
44、物合成获得高的产量。高的产量。在各种类型的发酵过程中，实验所得的最适在各种类型的发酵过程中，实验所得的最适pH值值与微生物的生长和产物的形成中与微生物的生长和产物的形成中3个参数的相互关系有个参数的相互关系有四种情况：四种情况：第一种情况是菌体的比生长速率（第一种情况是菌体的比生长速率（）和产物比生产和产物比生产速率（速率（Qp）的最适）的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范值都在一个相似的较宽的适宜范围内（围内（a），这种发酵过程易于控制；），这种发酵过程易于控制；第二种情况是第二种情况是（或（或Qp ）的最适的最适pH值范围很窄，而值范围很窄，而Qp（或（或）的范围）的范围较宽（较宽（b）
45、；）；第三种情况是第三种情况是和和Qp对对pH值都很敏感，它们的最适值都很敏感，它们的最适pH值又是相同的（值又是相同的（c），第二和第三模式的发酵），第二和第三模式的发酵pH值值应严格控制；应严格控制；第四第四种情况更复杂，种情况更复杂，和和Qp有各自的最适有各自的最适 pH值值(d),应应分别严格控制各自的最适分别严格控制各自的最适pH值，才能优化发酵过程。值，才能优化发酵过程。合适的合适的p值是根据实验结果来确定。值是根据实验结果来确定。将发酵培养基调节成不同的出发将发酵培养基调节成不同的出发pH值，进行发酵，在发值，进行发酵，在发酵过程中，定时测定和调节酵过程中，定时测定和调节pH，以
46、分别维持出发，以分别维持出发pH 值，或值，或者利用缓冲液配制培养基以维持之。到时观察菌体生长的情者利用缓冲液配制培养基以维持之。到时观察菌体生长的情况，以菌体生长达到最高值的况，以菌体生长达到最高值的pH 值为菌体生长的最适值为菌体生长的最适pH 值。值。以同样的方法，可测得产物合成的合适以同样的方法，可测得产物合成的合适PH值。值。考虑发酵培养基的基础配方，使之有适当的比例，考虑发酵培养基的基础配方，使之有适当的比例，使发酵过程使发酵过程pH 的变化在适合的范围内。的变化在适合的范围内。因为培养基中含有代谢产酸因为培养基中含有代谢产酸如葡萄糖产生酮酸、如葡萄糖产生酮酸、(NH4)2 SO4
47、 和产碱和产碱 如NaNO3、尿素、尿素的物质以及缓冲剂的物质以及缓冲剂如如CaCO3 等成分，它们在发酵过程中要影响等成分，它们在发酵过程中要影响pH的变化，特的变化，特别是别是CaCO3能与酮酸等反应，而起到缓冲作用，所以它能与酮酸等反应，而起到缓冲作用，所以它的用量比较重要。在分批发酵中，常采用这种方法来控的用量比较重要。在分批发酵中，常采用这种方法来控制制pH的变化。的变化。控制控制pH的方法的方法 利用上述方法调节利用上述方法调节pH值的能力是有限的，如果达值的能力是有限的，如果达不到要求，可以用不到要求，可以用在发酵过程直接补加酸或碱和补枓在发酵过程直接补加酸或碱和补枓的方式来控制
48、的方式来控制，特别是补料的方式，效果比较明显。，特别是补料的方式，效果比较明显。过去是直接加入酸或碱来控制，但现在常用的是过去是直接加入酸或碱来控制，但现在常用的是以以生理酸性物质生理酸性物质(硫酸铵硫酸铵)和碱性物质和碱性物质(氨水氨水)来控制来控制。它。它们不仅可以凋节们不仅可以凋节pH值，还可以补充氮源。当发酵的值，还可以补充氮源。当发酵的pH值和氨氮含量都低时，补加氨水，就可以达到调节值和氨氮含量都低时，补加氨水，就可以达到调节pH 和补充氨氮的目的。反之，和补充氨氮的目的。反之，pH值较高，氨氮含量又低值较高，氨氮含量又低时，就补加硫酸铵。时，就补加硫酸铵。目前，已比较成功地采用补枓
49、的方法来调节目前，已比较成功地采用补枓的方法来调节pH值，值，如氨基酸发酵采用流加尿素的方法，特别是次级代谢如氨基酸发酵采用流加尿素的方法，特别是次级代谢产物抗生素发酵，更常用此法。这种方法，既可以达产物抗生素发酵，更常用此法。这种方法，既可以达到稳定到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。也就是说，产物合成的阻遏作用，提高产物产量。也就是说，采采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周用补料的方法，可以同时实现补充营
50、养、延长发酵周期、调节期、调节pH值和培养液的特性（如菌浓等）等几个目值和培养液的特性（如菌浓等）等几个目的。的。最成功的例子就是青霉素的补枓工艺，利用控制最成功的例子就是青霉素的补枓工艺，利用控制葡萄糖的补加速率来控制葡萄糖的补加速率来控制pH值的变化范围（现已实现值的变化范围（现已实现自动化），其青霉素产量比用恒定的加糖速率和加酸自动化），其青霉素产量比用恒定的加糖速率和加酸或碱来控制或碱来控制pH值的产量高值的产量高25%。氧是一种氧是一种难溶于水难溶于水的气体。在的气体。在25，1105Pa条件下，条件下，纯纯氧在水中的溶解度为氧在水中的溶解度为1.26mmol/L，空气中的氧在纯水中
