1、1n教学内容：教学内容：n1、荧光分析法原理、荧光分析法原理n2、荧光分析仪器、荧光分析仪器n3、荧光分析法及其应用、荧光分析法及其应用n4、磷光分析法、磷光分析法n5、化学发光分析法、化学发光分析法n重点：荧光、磷光的产生重点：荧光、磷光的产生n难点：荧光、磷光的产生难点：荧光、磷光的产生2n教学要求教学要求:n1、掌握荧光、磷光的产生过程、掌握荧光、磷光的产生过程n2、掌握荧光、磷光光谱的区别、掌握荧光、磷光光谱的区别n3、掌握荧光、磷光分析法的应用、掌握荧光、磷光分析法的应用n4、理解荧光、磷光光谱仪的结构、理解荧光、磷光光谱仪的结构n5、掌握化学发光的反应类型、掌握化学发光的反应类型n
2、6、掌握化学发光分析法的应用、掌握化学发光分析法的应用3n参考书目：参考书目：n1、仪器分析教程、仪器分析教程 北京大学化学系仪器北京大学化学系仪器分析教学组分析教学组 北京：北京大学出版社，北京：北京大学出版社，1997.n2、仪器分析、仪器分析 （第（第2版）刘密新版）刘密新 罗国安罗国安 张新荣等张新荣等 北京：清华大学出版社，北京：清华大学出版社，2002.n3、仪器分析、仪器分析 （第（第3版）朱明华版）朱明华 北京：北京：高等教育出版社，高等教育出版社，2000.4分子发光分析法分子发光分析法n处于基态的分子吸收能量被激发至激发态，通处于基态的分子吸收能量被激发至激发态，通过测量被
3、激发分子回到基态所发射的光辐射进过测量被激发分子回到基态所发射的光辐射进行定量分析的方法。行定量分析的方法。n荧光分析荧光分析n磷光分析磷光分析n化学发光分析化学发光分析5一、荧光产生的机理一、荧光产生的机理 n光致发光光致发光第一节第一节 荧光分析法原理荧光分析法原理61.1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级分子能级:电子能级、振动能级、转动能级电子能级、振动能级、转动能级 分子轨道：成键轨道、反键轨道分子轨道：成键轨道、反键轨道 基态基态激发态激发态振动能级振动能级电子能级电子能级转动能级转动能级BA72.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度激发单重态激发单重态：电子自旋配对电子
4、自旋配对M=2s+1=1单重态单重态以以S1，S2表示表示基态基态：电子自旋配对电子自旋配对M=2s+1=1单重态单重态以以S0表示表示激发三重态：激发三重态：电子自旋不配对电子自旋不配对M=2s+1=三重态三重态以以T1，T2表示表示8激发单重态与激发三重态激发单重态与激发三重态激发单重态激发单重态激发三重态激发三重态电子自旋电子自旋 自旋配对自旋配对自旋平行自旋平行平均寿命平均寿命10-8-10-6 s10-4-10 s基态到激发态跃迁基态到激发态跃迁允许的跃迁允许的跃迁禁阻的跃迁禁阻的跃迁能量能量高高低低93.分子的去活化过程激发态基态的能量传递途径传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁无辐射
5、跃迁无辐射跃迁 荧光荧光磷光磷光振动振动弛豫弛豫内转换内转换系间系间窜跃窜跃外转换外转换S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃系间窜跃内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l l 1l l 2l l 4 外转换外转换l l 3 3T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫（1 1）非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程振动弛豫振动弛豫同一同一电子能级内电子能级内,由高由高振动能级跃迁至低振振动能级跃迁至低振动能级，以热的形式动能级，以热的形式释放能量。释放能量。10-12 s。通过内转换和振动弛豫，高激发单通过内转换和振动弛豫，高激发单（或三）重态的电子跃回第一激发（或三）重态的电
6、子跃回第一激发单（或三）重态的最低振动能级。单（或三）重态的最低振动能级。内转换内转换在相同多重态内，电子在相同多重态内，电子在不同电子能级间的无在不同电子能级间的无辐射跃迁。辐射跃迁。(S2 S1,T2 T1)10 1 s系间窜跃系间窜跃不同多重态，有重叠不同多重态，有重叠的振动能级间的非辐的振动能级间的非辐射跃迁。射跃迁。(S1 T1)禁阻跃迁禁阻跃迁10 s 外转换外转换 激发分子与溶剂或其激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互他分子之间产生相互作用而转移能量的非作用而转移能量的非辐射跃迁。辐射跃迁。外转换使荧光或磷光外转换使荧光或磷光减弱或减弱或“猝灭猝灭”。13（2 2）辐射能量传递过
7、程辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射电子由电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态各基态各振动能级（振动能级（S1 S0）。）。发射荧光的能量比分子吸收的能量小发射荧光的能量比分子吸收的能量小 波长：波长：l l 3 l l 1 l l 2；10-710-9 s；光照停止，荧光发射停止。光照停止，荧光发射停止。14磷光发射磷光发射电子由电子由第一激发三重态最低振动能级第一激发三重态最低振动能级基态各振动能基态各振动能级（级（T1 S0跃迁）；跃迁）；发射磷光的能量比分子吸收的能量小发射磷光的能量比分子吸收的能量小 波长：波长：l l 4 l l 1 l l 2；禁阻跃
8、迁；禁阻跃迁；10-410 s；光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。15S0 T1：（：（禁阻跃迁）禁阻跃迁）S0 激发激发 S 系间窜跃系间窜跃 T1（高（高振动能层振动能层)振动弛豫振动弛豫 T1（低振动低振动能层）能层）16二、激发光谱与荧光二、激发光谱与荧光(磷光磷光)光谱光谱荧光荧光(磷光磷光)：光致发光：光致发光v任何荧（磷）光物质都具有两种特征光谱：任何荧（磷）光物质都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱v它们是荧（磷）光定性定量分析的基础。它们是荧（磷）光定性定量分析的基础。171.1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的激发光谱曲线固定测
9、量固定测量荧光荧光波长波长(最大发射最大发射波长波长)改变激发光波长，测量荧（改变激发光波长，测量荧（磷）光的强度变化。磷）光的强度变化。应用：选择最适宜的激发光波应用：选择最适宜的激发光波长，用于定量分析。长，用于定量分析。l lex18n形状相同形状相同n性质不同：性质不同：激发光谱曲线：激发光谱曲线：荧光强度与波长的关系曲线荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线：吸收曲线：吸光度与波长的关系曲线吸光度与波长的关系曲线。激发光谱曲线与吸收曲线激发光谱曲线与吸收曲线192.2.发射光谱发射光谱荧光光谱荧光光谱(或磷光光谱或磷光光谱)固定激发光波长固定激发光波长(最大激发波长最大激发波长)测定不同
10、波长处的荧光强度测定不同波长处的荧光强度应用应用:定性分析定性分析200260320380440500560620激发光谱激发光谱荧光光谱荧光光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱3.荧光光谱的特性a.Stokesa.Stokes位移位移 荧光荧光波长波长 激发光激发光波波长长 (无辐射跃迁无辐射跃迁)b.荧光荧光光谱的形状与激发光谱的形状与激发光光波长无关波长无关 分子吸收能量分子吸收能量跃迁到不同激发态产生不同吸收带跃迁到不同激发态产生不同吸收带(l l 2,l l 1)第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级跃迁回跃迁回基态基
11、态产生产生荧光荧光(l l 3)。c.镜像规则镜像规则 通常荧光光谱与吸收光谱成镜像对称关系。通常荧光光谱与吸收光谱成镜像对称关系。22200250300350400450500吸收光谱吸收光谱荧光光谱荧光光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱 例：基态零振动能级与第一激发态的第例：基态零振动能级与第一激发态的第二振动能级之间的能量差最大，吸收峰二振动能级之间的能量差最大，吸收峰波长最短，相反波长最短，相反,第一激发态的零振动第一激发态的零振动能级与基态的第二振动能级之间的能量能级与基态的第二振动能级之间的能量差最小，荧光峰波长最长。差最小，荧光峰波长最长。S1S0荧光光谱：荧光
12、光谱：基态各振动能层分布基态各振动能层分布吸收光谱：吸收光谱：第一激发态各振动能层分布第一激发态各振动能层分布21021024三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）能吸收紫外）能吸收紫外-可见光；可见光；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（f）：）：激发分子总数发射荧光的分子数f252.2.荧光与荧光与分子分子结构结构的关系的关系（1）跃迁类型：）跃迁类型：不含杂原子的芳香族化合物和共轭烯烃：不含杂原子的芳香族化合物和共轭烯烃：*含杂原子的烯烃：含杂原子的烯
13、烃：n *（2）共轭效应：共轭体系增加，荧光效率增加）共轭效应：共轭体系增加，荧光效率增加,红移。红移。（3）刚性平面结构：降低分子振动，减少碰撞去活化的）刚性平面结构：降低分子振动，减少碰撞去活化的可能性可能性,荧光增强。荧光增强。（4）取代基效应：）取代基效应：v芳环上有供电基：芳环上有供电基：p-共轭，荧光增强共轭，荧光增强,红移。红移。吸电基：吸电基：S1T1增强增强,荧光减弱，磷光增强。荧光减弱，磷光增强。v重原子效应：荧光减弱，磷光增强。重原子效应：荧光减弱，磷光增强。26四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素1.荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系w If =I
14、aw 根据朗伯根据朗伯-比尔定律比尔定律 Ia=I0-It=I0(1-e-l C)w 极稀的溶液中，极稀的溶液中，If =K c272.影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；形成都将使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活化的几率增加。化的几率增加。3.溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH影响较大，需严格控制；影响较大，需严格控制
15、；4.4.荧光的猝灭荧光的猝灭28第二节第二节 荧光分析荧光分析仪器仪器四个部分：激发光源、四个部分：激发光源、试试样池、双单色器系样池、双单色器系统、检测器统、检测器特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。成直角。光源：光源：氙氙灯和高压汞灯，激光灯和高压汞灯，激光单色器：单色器：激发激发单色器单色器：选择激发光波长选择激发光波长发射发射单色器单色器：选择选择荧荧光波长光波长试样池：试样池：石英石英检测器：检测器：光电倍增管光电倍增管29第三节第三节 荧光分析方法与应用荧光分析方法与应用1.1.定量定量分析分析(1)(1)定量依据定量依据 If=K
16、c（2 2）定量方法）定量方法 校校准曲线法准曲线法 标准对照法标准对照法 302.2.特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级；个数量级；I If f=Kc=Kc A=lg(I A=lg(I0 0/I)=/I)=bcbc（2 2）选择性强）选择性强 既可依据发射光谱，又可根据既可依据发射光谱，又可根据激发激发光谱；光谱；（3 3）试样量少）试样量少缺点：应用范围小缺点：应用范围小。313.荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素
17、。多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 323334第四节第四节 磷光分析磷光分析一、磷光分析法原理一、磷光分析法原理 T1S0S2S1S0T1吸吸收收发发射
18、射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜系间窜跃跃内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l l 1l l 2l l 4 外转换外转换l l 3 3T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫351.磷光的特点磷光的特点n波长：磷光波长：磷光荧光荧光n寿命：磷光荧光（寿命：磷光荧光（S1T1S0)n磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子敏感。子敏感。362.低温磷光低温磷光3.重原子效应重原子效应4.室温磷光室温磷光200260320380440500560620激发光谱激发光谱荧光光谱荧光光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
19、38二、二、磷光磷光的的检测检测荧光计上配上荧光计上配上磷光测量附件磷光测量附件即可对磷光进行测量。即可对磷光进行测量。测量方法：测量方法：（1 1）通常借助于荧光和）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。光镜的装置将荧光隔开。（2 2）采用脉冲光源和可）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。控检测及时间分辨技术。39三三、磷光分析法的应用、磷光分析法的应用1.1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）杂环化合物（致癌物质）2.2.农药、生物碱、
20、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱烟碱、降烟碱、新烟碱3.3.药物分析和临床分析药物分析和临床分析 404142第五节第五节 化学发光分析法化学发光分析法n某些物质在进行化学反应时，由于某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应吸收了反应时产生的时产生的化学能化学能，而使，而使反应产物分子激发至激反应产物分子激发至激发态发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光过程称为化学发光。n利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为利用化学发
21、光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法。化学发光分析法。43一、化学发光分析的基本原理一、化学发光分析的基本原理 AP*P+hv化学激活化学激活v发光发光441.1.直接化学发光和间接化学发光直接化学发光和间接化学发光（1 1）直接化学发光）直接化学发光 A+B C*+D C*C+h（2 2）间接化学发光）间接化学发光 A+B C*+D C*+F F*+E F*F+h 二、化学发光反应类型二、化学发光反应类型45（1）气相化学发光）气相化学发光 主要有主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于的化学发光反应，可用于监测空气中的监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。等。（2）液相化学发光）液相化学发光2.气相化学发光和液相化学发光气相化学发光和液相化学发光46试样室试样室光检测器光检测器放大器放大器信号显示记录系统信号显示记录系统 三、化学发光的测量装置三、化学发光的测量装置47四、化学发光分析的特点四、化学发光分析的特点n灵敏度高，检出限低灵敏度高，检出限低n线性范围宽线性范围宽n操作简便，易于实现自动化操作简便，易于实现自动化
