1、第八章第八章 受体的放射配体结合分析法受体的放射配体结合分析法第一节概述第一节概述受体（Receptor）细胞膜上或细胞内的一些与生物活性物质相互作用并引细胞膜上或细胞内的一些与生物活性物质相互作用并引 起特异性生物效应的大分子起特异性生物效应的大分子。一、受体的分类及亚型在细胞内的定位可将受体分为膜受体、核受体（一）膜受体（membrane receptors）由胞膜外、胞膜内及跨膜区三部分组成，配体在细胞外侧同受体的胞外部分或跨膜部分上的特定结合位点结合后，受体的分子构型发生变化，通过膜内部分启动相应的信息传递机制，引起细胞功能变化。根据受体的分子结构和受体后信息传递方式，膜受体又分为四种
2、：图8.1 受体示意图（二）核受体（nucleus receptors）本类受体在细胞核上，与细胞核内特定的DNA结合，通过这种结合影响遗传信息的转录。核受体都是分子量在80100KD的可溶性蛋白，不含糖基，无酶活性，由一条氨基酸组成。分为四个功能区，A/B区、C区、D区和E区。A/B区在不同受体中差异最大，主要功能是选择和激活基因转录。D区主要作用是受体在核内的定位，是与染色体DNA结合区，上面有一定的氨基酸序列，可以和靶基因上一定的核苷酸序列（反应原件，response element）相结合。E区为配体的结合区，并有转录激活作用 通常按C区和染色体DNA结合的结构特征，将核受体分为三类：
3、1、糖皮质激素受体类 包括糖皮质激素受体（GCR）、盐皮质激素受体（MR）、孕激素受体（PR）及雄激素受体（AR）等。2、甲状腺激素受体类 包括甲状腺激素受体（TR）、维生素D3受体（VDR）、维甲酸受体（RAR）及维甲酸X受体（RXR）等。3、雌激素受体类 主要为雌激素（ER）。（三）受体亚型受体亚型是指受体分子结构上既有部分相同，也存在一定差别，它们对同一配体具有不同的亲和力，生物学上具有不同的效应。1、用药理学方法可见到，同一种受体的几种激动剂（拮抗剂）对各亚型都有作用，但作用有相对的选择性。如，对于肾上腺受体，哌唑嗪对血管平滑肌收缩的拮抗作用强（1），对胃肠道平滑肌舒张的拮抗作用较弱（
4、2），而育亨宾则相反。2、用放射配体结合分析法可观察到，同一种受体的某些激动剂（拮抗剂）对各亚型都有特异性结合能力，但是亲和力不同。3、用分子生物学技术可观察到，同一种受体的不同亚型的分子结构类似，但基因的编码和氨基酸序列有一定的差异。受体与配体相互作用的基本特点1、可饱和性（Saturabilty）-有限结合能力。2、特异性（Specificity）受体对配体应具有特异性和立体特异性。配体可分为激动剂与拮抗剂3、适度的亲和力（Affinity）受体对它的配体的亲和力，或配体占据受体的浓度范围，应该相当于体内配体的生理浓度，通常是10-9mol/L。4、可逆性（Reversibility）受体
5、与配体的结合反应是可逆的。可逆性还表现在已经结合的配体可被另一种与受体亲和力更高的配体取代。5、识别能力（Recognition）和生物效应一致性受体与配体的特异性结合保证了受体对机体内成千上万生物活性物质的高度识别能力。这种能力与配体引起的生理（药理）效应相一致。表现在：（1）、在组织分布上的一致。（2）、在浓度上的一致。受体主要存在于相应配体发挥生理或药理效应的器管，称之为靶器管。有的配体生理或药理效应广泛，而另一些配体的作用则有明显的器管专一性。配体和受体结合的有效浓度通常也应该和该配体发挥生理或药理作用的浓度一致。6、需具有内源性配体一般受体都有内源性配体，如果通过外源性配体发现某种蛋
6、白分子具有类似受体的结合特性，但未能找到内源性配体，则称之为孤儿受体（Orphan receptor），还不能看做肯定是真正的受体。RBARBA（RadioligandRadioligand binding assay of receptors binding assay of receptors）用放射性核素标记的配体与相应受体进行特异性用放射性核素标记的配体与相应受体进行特异性结合反应，从而对受体进行定性和定量，即称为结合反应，从而对受体进行定性和定量，即称为受体受体的放射配体结合分析法。的放射配体结合分析法。RBA定量定量RBARBA在已知配体在已知配体受体反应的受体反应的基础之上，通过
7、结合反应基础之上，通过结合反应得知一定量的组织或细胞得知一定量的组织或细胞能与该放射性配体结合的能与该放射性配体结合的受体数（又叫结合位点数，受体数（又叫结合位点数，Number of binding site）和亲和力（以解离）和亲和力（以解离常数常数KD表示）。表示）。定性定性RBARBA通过反应量效关系，某通过反应量效关系，某些参数的变化等判断受些参数的变化等判断受体的类型，单位点和多体的类型，单位点和多位点系统，受体与配体位点系统，受体与配体相互作用的特点等。相互作用的特点等。第二节、单位点系统第二节、单位点系统RBA RBA 的基本原理的基本原理一、受体与配体相互作用的基本特点一、受
8、体与配体相互作用的基本特点二、简单单位点系统受体配体相互作用的基本规律二、简单单位点系统受体配体相互作用的基本规律二、简单单位点系统受体配体相互作二、简单单位点系统受体配体相互作用的基本规律用的基本规律简单单位点系统简单单位点系统:受体与配体结合的系统只存在一种结合位点受体与配体结合的系统只存在一种结合位点.1.质量作用定律质量作用定律:受体与配体的结合反应最基本的性质是服从可受体与配体的结合反应最基本的性质是服从可逆反应的质量作用定律逆反应的质量作用定律.R+L RLv1 -复合物形成速率 k1_ -复合物形成速率常数v2-复合物解离速率 k2_ -复合物解离速率常数v1=K1RL v2=K
9、2RL反应平衡时v1=v2k1v1k2v2反应平衡时v1=v2平衡解离常数KD=KD=1/KA，单位为：mol/LKD越大，亲和力越低21RLkLRkRLLR12kk设 受体和配体的初始浓度分别 为RT、LT则 R=RT-RL L=LT-RL代入：KD=整理后得：RL2-RLRT+LT+KD+RTLT=0因为 RT、KD 为定值所以RL仅随LT而变化，两者呈双曲线函数关系RLLRLRT RLRLLTRLRT2.饱和曲线:简单单位点系统RBA具有典型的饱和曲线-以RL为纵坐标LT为横坐标,得到的得到一条曲线(Saturation curve).图8-2 KD对饱和曲线的影响 图8-3 RT对饱和
10、曲线影响 3.Scatchard 作图简单单位点系统在Scatchard 作图中呈一直线 整理后得:以RL/L对RL作图-Scatchard 作图斜率斜率=-1/KDRT=直线与横坐标的交点直线与横坐标的交点 RLLRLRTKD1RLxKDKDRTLRL图8.4 简单单位点系统受体结合分析的Scatchard作图KD相同RT不同时RT 相同KD不同时图8.54.Hill作图得到一条斜率为1的直线重排并取对数以 lg(RL/RT-RL)-纵坐标 lgL-横坐标如果一个受体能和两个或更多(n个)分子的配体结合(KD相同)KD=RT-RLLn/RL lg(RL/RT-RL)=-lgKD+nlgL斜率
11、为n,Hill系数.1RLxKDKDRTLRLRLRTRLKDLlglglgLKDRLRTRL-lgKDlgKDLgLlgRLRTRL三、非特异结合放射性配体除与受体特异结合外，与其他的结合统称为NSB特点：1）结合容量大，亲和力小 2）无饱和现象 3）结合量与所用配体量呈 线性关系RBA时，当分离特异结合的复合物测量放射性时，这部分NSB的放射性混在一起，测得的是总放射性（total binding，TB），必需先去减去NSB，才能得到特异结合（specific binding，SB）。最基本的方法是做一系列平行管，所有的条件都与TB管相同，仅是多加了2001000倍量非标记配体，将SB完全
12、取代，这时测得的放射性计数为NSB。因NSB与放射性配体呈线性，多点饱和法实验中常常只做3、4点，再用直线回归法求出其余各点。图8-7 3H-组胺与组胺受体特异结合的饱和曲线（表示NSB,表示TB，x 表示SB=TB-NSB）四、正协同及副协同现象某些情况下，一部分受体与配体结合后可使相临的受体分子亲和力降低-副协同（Negative cooperativity）反之，亲和力逐步增高，斜率加大，曲线向上凸-正协同（positive cooperativity）图图8.8 8.8 ScatchardScatchard作图中的正负协同作用作图中的正负协同作用（1 1）无协同作用；（无协同作用；（2
13、 2）负协同作用；（）负协同作用；（3 3）正协同作用）正协同作用第三节 离体RBA的条件和基本方法条件：1.适用的标记配体 2.待测受体标本 3.适合的缓冲液 4.较好的F与B的分离方法RBA的基本方法的基本方法 制备待测受体的离体标本制备待测受体的离体标本加放射性配体加放射性配体 温育一定时间温育一定时间终止反应、分离结合与游离部分终止反应、分离结合与游离部分测定结合部分的放射性测定结合部分的放射性数据处理、求有关参数数据处理、求有关参数一、标记配体要求：高度亲和力，特异标记配体的浓度受体-配体KD常用的放射性配体：3H-标记物：稳定、生物活性不变、T1/2长、高放射性比活度、专门合成 1
14、25I-标记物：易标记、高放射性比活度、T1/2短、结构可能变化、比活度不易确定 标记配体的基本要求：1.高比活度 RBA中受体数目一般很低（0.011pmol/mg蛋白），必须用高比活度的标记配体才能得到理想的实验结果。而且比活度高，可减少标记配体的用量。一般要求在3.71011Bq（10Ci）/mmol以上。2.亲和力高 高亲和力的配体可减少用量，从而降低NSB；且可使标记配体与受体的复合物解离变慢，便于结合与游离配体的分离，易获得准确的实验数据。3.特异性强 标记配体应与其他受体的交叉反应少，与研究的受体有选择性结合。理想的标记配体应只与一种受体或受体的一种亚型结合。因此应选择对某一受体
15、或其中一种亚型高亲和力的标记配体。4.放射化学纯度高 RBA的计算是以标记配体的用量及比活度为依据，放射性杂质多进可导致计算不准确，一般要求放射化学纯度在95%以上 （一）标记配体的用量标记配体的用量要根据实验方案通过预实验进行确定。（1）单点法。通常选一个使受体基本饱和的标记配体量。该方法操作简便，标本量少，标记配体用量少，但只能给出受体的最大结合容量Bmax，且略小于饱和曲线法。（2）多点饱和曲线。每一受体标本做68个点（双位点需要更多），标记配体的用量应覆盖受体的不饱和区和饱和区，以得到典型的饱和曲线。此方法能得到RT、KD、反映实验误差大小的平均误差等，可信度高，但工作量也大。二、非标
16、记配体的选择非标记配体 -与放射性配体竞争结合同一受体 -特异性、亲和力要高 -用量=100-10000倍标记配体使绝大部分受体都被非标记配体所占据而不再与标记配体结合 三、待测受体标本的制备用于离体RBA的标本大体可分为：组织切片、完整细胞悬液，经初步分离的细胞组分以及经增溶或进一步纯化的受体蛋白等。1.完整细胞悬液的制备2.细胞组成的分离 细胞核、浆、膜3.受体的增溶和进一步纯化图图8.10 8.10 分离细胞组分的一般方法分离细胞组分的一般方法沉淀：完整细胞、核受体四、温育 条件缓冲液通过多次预实验确定某个受体的最适离子强度和pH时间与温度最适的时间为完全平衡时间温度根据目的不同而不同（
17、037OC）结合配体和游离配体的分离平衡透析法KD1000nmol/L半透膜的使用游离配体可自由透国离心法适用于多数B/F的分离KD=10-1000nmol/L过滤法玻璃纤维膜、醋酸纤维膜负压抽滤、洗涤KD10nmol/L目的：B/F的分离，一般RIA的分离方法可用于RBA注意配体与受体的解离速度 第四节 定量RBA的数据处理目的：求受体的RT和KD及其他参数通过测得的样品数据+放射性配体的量、放射性比活度+数学模型的运算一、单位点实验的数据处理TB-NSB=RL（特异结合的CPM）CPM/仪器效率=DPM（RL）DPM/S（比活度）=浓度（mol/L）R：L=1：1-RL的mol数=结合位点
18、数定量蛋白、细胞-RT mol数1mol=6.02 1023分子数的受体通常是计算饱和区RT，即最大结合容量Rmax（maximum binding capacity）。单位换算公式为：)%fmolCPMRLRT标本蛋白量（配基比活度）测量效率（的二、单位点系统多点法的数据处理一系列的不同浓度的LT与R结合后得到 TBn-NSB=RLn（CPM）以RLn对LT作图=饱和曲线-不同的模型得到RT和KD1.目测渐进线法2.直线化方法3.直接曲线拟合直线化方法Scatchard ModelR/L的浓度比值=B/F放射性比值B/F=RT/KD-RL/KD以B/F-纵坐标 RL-横坐标斜率=-1/KD与
19、横坐标的交点=RT与纵坐标的交点=RT/KDWoolf ModelF/B=KD/RT+L/RTF/B-纵坐标L-横坐标斜率=-1/RT与横坐标的交点=-KD与纵坐标的交点=KD/RTLinewear Burk Model1/RL=1/RT+KD/RT L1/RL-纵坐标1/L-横坐标斜率=KD/RT与横坐标的交点=-1/KD与纵坐标的交点=1/RT问题1.横坐标为实验测得的值 存在误差2.直线转换所致 不均匀性3.均用F，由T-B所得有一定误差 表 8.1 三种直线化方法的比较（Monte Carlo 法模拟无或 有突出值各 1000 例数据处理的统计结果）Scatchard 法 双倒数法 W
20、oolf 法 无突出值 RT偏差（%）+1.61+0.24-0.03 RTCV（%）+3.89 5.21 3.85 KD 偏差（%）+3.25+0.85+0.30 KD CV（%）7.85 10.30 7.70 有 13 突出值 RT偏差（%）+2.77+0.76+0.12 RTCV（%）4.90 6.70 4.75 KD 偏差（%）+5.45+1.90+0.65 KD CV（%）9.75 13.10 9.50 3.直接曲线拟合（COMPUTER）测得TB、NSBTBn-NSB=Tn（CPM）-RL（浓度）RL对LT曲线拟合RL2-RLRT+LT+KD+RTLT=0横坐标为LT，近于实际公式R
21、L2-RLRT+LT+KD+RTLT=0为饱和曲线的直接表达式，可用最小二乘法或稳健回归法。横坐标是LT（自变量），纵坐标是RL（因变量），RT和KD是固定值。比直线化有一定的优势，其精密度和准确度均优于直线化法。四、双位点或多位点系统RBA饱和曲线的数据处理原因：有些配体的特异性相对低，能和 两种或两种 以上的 受体（或不同亚型）发生特异结合结果：RL是两种或两种以上特异结合的和 饱和曲线是两种或更多曲线的和第七节 受体与疾病一、疾病的发病机制的研究二、受体异常疾病的诊断三、指导治疗四、预后指标五、药物药效研究一、受体调节过度引起的疾病受体的调节是指某种细胞上的某种受体由于一些因素改变而发生
22、变化。受体的调节可以是受体数量（密度）的增加或减少，也可以是受体与配体亲和力的升高或降低。如果调节作用是受体本身和特异性配体发生结合反应的结果，则称为同系调节（homologous regulation）。若调节作用是其他受体甚至与受体无关的因素引起的，则称之为异系调节（heterologous regulation）。生理条件下，受体的调节是使机体更好地适应内外环境的变化，可是一旦调节过度，则会引起病理性的后果。如，甲状腺激素能使多种组织的肾上腺素受体密度上升，使组织的糖元分解加速，适应甲状腺激素促进细胞能量代谢的需要。但当甲状腺功能亢进时肾上腺素受体密度的过度增多则可导致心动过速或心律失常
23、。二、受体基因突变所引起的疾病由于遗传基因的突变而使受体异常，导致疾病产生。主要表现为细胞产生的受体与内源性配体的亲和力发生变化，大多数是亲和力下降。已知的由于受体基因突变引起的疾病如：ACTH受体发生突变，肾上腺对ACTH的反应性下降，临床表现为家族性糖皮质激素缺乏症；胰岛素受体亚单位发生突变，使机体对胰岛素的反应性下降，临床表现为A型抗胰岛素糖尿病（成年女性）；LH受体跨膜区突变，导致LHR与LH反应下降，临床表现为家族男性早熟。此外还有一些疾病如抗甲状腺激素型甲减、家族性糖皮质激素缺乏症、原发性抗皮质醇症、I型假型醛固酮缺乏症等都与受体基因突变有关 三、受体抗体引起的疾病受体是机体本身的
24、蛋白质，正常情况下机体不会产生针对受体的抗体，因而也不会形成受体与其自身特异性抗体的免疫复合物。但是在某些病理情况下，机体产生了针对某一受体蛋白的特异性抗体，并发生抗原抗体结合反应，导致受体功能异常，引起疾病。常见的有：Graves病患者机体产生抗促甲状腺激素受体（TSHR）抗体 四、受体与肿瘤有些病人的癌细胞存在相应的受体，有些没有。激素疗法对有受体的肿瘤有效，对没有受体的肿瘤则无效。如乳腺癌ER和PR阳性患者激素治疗有效，而阴性则治疗效果差。此外，检测肿瘤组织中的有关受体对决定治疗方案和预后判断都后重要，已成为常规。如174例急性淋巴细胞白血病患者骨髓中糖皮质激素受体（GCR）的检查结果表
25、明：凡是GCR水平低下者，即使经治疗有所缓解，也往往容易复发。雌激素受体阴性的乳腺癌患者，预后多不良。五、受体的变化是一些疾病的中间环节受体的变化是某些疾病的重要中间环节，有时表现为一对作用相反的受体向相反方向变化，使受体间失平衡，治疗上常开发针对受体特异性的药物。如过敏性哮喘时肾上腺素受体密度降低，M胆碱受体密度增加，可用肾上腺素受体激动剂减轻症状。六、受体研究是筛选药物和观察药物毒副作用的重要工具（一）、在药物作用机制中的作用应用放射配体结合分析法研究受体，可了解：（1）药物作用的特异性是由于特异性受体的存在；（2）受体与药物的反应决定了药理作用的量效关系；（3）不仅激动剂（Agonist
26、）的药理作用是通过和受体反应而产生的，而拮抗剂（Antagonist）也是如此。用以上概念可解释各种药理作用，这就是很多药物药理作用的起初反应。因此，可把通过与受体反应而引起的药理作用以下面的公式表示：D+RDRE（药物）（受体）（药物受体复合物）效应）如药物是R的特异性拮抗剂D，则作用方式是：D+RE（二）、在观察药物毒副作用中的应用 临床上常出现由于用药量过大，或是由于长期用药而产生药物中毒。如氯两嗪类的药物治疗精神分裂症的初期，出现的副作用是巴金森氏病，这是由于药物在阻滞边缘系统的多巴胺受体的同时也阻滞了纹状体的多巴胺受体。长期服用这类药物的病人，则可能出现刻板式的运动障碍，这是由于锥体
27、外系统的多巴胺受体高敏性的表现。七、受体-配体介导的放射性核素导向诊断与治疗在RBA的基础上，发展了受体-配体介导的放射性核素导向诊断与治疗技术。受体-配体反应实现肿瘤组织和细胞的放射性核素定向输送，需要某一受体在肿瘤靶组织或细胞有高度的表达，而在正常组织没有表达或很少表达，这样，才能实现靶向诊断与治疗作用（图8.17）。目前，常用的受体有转铁蛋白受体、LDL受体、无唾液酸糖蛋白受体、乳糖受体、胰岛素样生长因子受体、生长抑素受体、VIP受体、叶酸受体等等。受体-配体介导的肿瘤靶向诊断与治疗的优势:a.配体分子一般在体内有天然存在,一般无免疫原性;b.配体分子的分子量一般较小,可以人工合成，在体内的分布与廓清有特点；c.配体分子可以进行放射性核素标记或连接上化疗药物；d.配体与受体结合后，可以通过内化作 用或胞饮进入细胞浆甚至细胞核内。为了提高对靶细胞的杀伤效果，科学家也设计了一种靶向药物簇，即在一个配体的一面连接上一个分子桥，每个桥上可以连接多个放射性核素或药物，从而提高了连接的效率，产生更好的治疗效果。
