1、细胞培养与应用 Bioengineering College Dalian University细胞培养与应用 Bioengineering College Dalian University 10 Bioengineering College Dalian UniversityvvvBioengineering College Dalian University1.(1)(2)(3)(4)2.Bioengineering College Dalian University1.动物细胞的分裂周期长：动物细胞分裂周期一般为12-48h。它不仅随细 胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不 同部位
2、的细胞所需的时间也不同。此外，培养 条件如：温度、pH、培养基成分等也会影响分 裂周期的长短。动物细胞体外培养特点Bioengineering College Dalian UniversityBioengineering College Dalian University2.贴附生长并伸展：贴附并伸展是贴壁型细胞体外培养时的基本 生长特点。它受许多因素影响，如离子浓度、机械、物理因素、生物因素等。动物细胞体外培养特点Bioengineering College Dalian UniversityBioengineering College Dalian University3.接触抑制(co
3、ntact inhibitition)现象：贴壁生长的细胞分裂增殖，细胞间逐渐汇合 相互接触时，细胞停止增殖，即细胞密度不 再增加，这一现象称为接触抑制或密度依赖 抑制现象。动物细胞体外培养特点Bioengineering College Dalian University4.有限细胞系和永久细胞系原代培养细胞经继代培养后即成为有限细胞系 只能在有限的时间内生存，经过10-50代后细胞 逐渐死亡。细胞继代次数和存活时间的长短以 细胞来源的年龄和种属不同而有差异。年龄越 大继代次数越少。动物细胞体外培养特点Bioengineering College Dalian University“”永久细
4、胞系有如下特征：细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生 长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减 小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增 加；细胞接种到体内后，生癌率上升。Bioengineering College Dalian University动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，原因是动物细胞只有细胞膜，而没有 细胞壁的保护。因此对培养环境十分敏感，一切 影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活。动物细胞体外培养特点Bioengineering College Dalian University5.1.温度:37 对低温耐受比对高温耐受强2.pH 7.2-7.
5、4 对偏酸性耐受强些3.气体 O2和 CO2(5%)CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-4.营养需求：培养基和血清5.渗透压6.无污染：培养要严格在无菌条件下进行，细菌、真菌、病毒、或其它细胞均可导致培养物的污染。动物细胞体外培养的条件Bioengineering College Dalian University实验室Bioengineering College Dalian University1.水处理设备：蒸馏水发生器、超纯水系统2.无菌设备：超净台、灭菌锅、滤器等 3.培养设备：CO2培养箱4.观察分析设备：显微镜、酶标仪等5.分离与保存设备：离心机、低温冰箱、液氮罐6.耗材：
6、培养瓶，吸管，电动移液器，培养板，冻存管等常用实验用品、设备Bioengineering College Dalian University水处理设备Bioengineering College Dalian University自动双重纯水蒸馏器纯水仪常用灭菌器具：v 为细胞操作提供无菌环境v 紫外线消毒v 湿热消毒，用途广v 干热消毒。v 过滤除菌无菌设备Bioengineering College Dalian Universityv超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净 化空气徐徐通过工作 台面，使工作台内构 成无菌环境。Bi
7、oengineering College Dalian University121,20min 2hBioengineering College Dalian University Bioengineering College Dalian University Bioengineering College Dalian UniversityBioengineering College Dalian Universityn设定条件为37，5CO2 。n使用CO2培养箱时应注意的 问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需 将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定 期消毒(90 ，14 h)。蒸馏水
8、槽中灭菌蒸馏水3000 毫升以保持箱内湿度，避免培 养液蒸发。CO2 UniversityBioengineering College DalianBioengineering College Dalian UniversityBioengineering College Dalian University酶标仪 微孔板震荡器Bioengineering College Dalian University Bioengineering College Dalian University Bioengineering College Dalian University Bioengineerin
9、g College Dalian UniversityBioengineering College Dalian University动物细胞小规模培养方法有：培养瓶培养法、培养板培养法、培养皿培养法。准备工作：1.器材的清洗、包装和灭菌2.培养液及其他培养用液的配置实验室动物细胞培养的一般过程Bioengineering College Dalian University：组织块培养法用剪刀将组织剪成小块组织消化培养用酶液将组织小块进一步分散成细胞团或单个细胞传代培养细胞覆盖80%-90%是传代的最佳时期细胞培养Bioengineering College Dalian University
10、组织块培养法Bioengineering College Dalian Universityv取材分离v组织消化(胰蛋白酶、胶原酶)v培养过程组织消化培养Bioengineering College Dalian University传代培养Bioengineering College Dalian Universityv 游离期v 贴壁期v 潜伏期v 对数生长期v 停止期(平台期)Bioengineering College Dalian Universityv细胞接种后在培养液中呈悬浮状态；也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。v一般游离期持续10分钟4小时Bioengineering
11、 College Dalian University细胞附着于底物上，游离期结束。v贴壁表面要带阳性电荷和高度的表面活性；一般用 于细胞培养的表面是玻璃、塑料、金属和微载体。进口塑料培养瓶涂有生长基质(化学合成的功能基 团)。v血清中有促使细胞贴壁的带正电荷的糖蛋白(生长 基质)，这些促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细 胞再附着于吸附的促贴壁因子。Bioengineering College Dalian University细胞贴壁过程Bioengineering College Dalian Universityv此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。v细胞株潜伏期一般为624小时。：v细胞数随
12、时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。v细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂v机制：接触抑制、密度依赖性Bioengineering College Dalian UniversityBioengineering College Dalian University细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞 都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、培养细胞的活力测定活细胞是困难的。Bioengineering College Dalian UniversityBioengineering College Dalian University活细胞不被染色
13、，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力台盼蓝法测细胞活力细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。获得较好的冻存效果的方法：1.冻存和复苏的原则：慢冻快融2.在细胞冻存时加入低温保护剂能大大提高冻存效果。细胞冻存和复苏Bioengineering College Dalian University1.预先配制冻存液：含20%血清培养基、10%DMSO2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻 存液,用吸管吹打制成细胞悬液(1106-5106 细胞/mL)3.1mL/管分装于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名4.1年后，存活率可达80一90。DMSO液先用培养液配好，避免因临时配制产热
14、而细胞冻存方法称和冷冻日期。伤害细胞。Bioengineering College Dalian Universityl.从液氮中取出冷冻管，迅速投入 38 40 中，1分钟以内使其融化；2.于5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；3.低速离心10分钟；4.去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。细胞复苏方法Bioengineering College Dalian University水浴 四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝v MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成 结晶状的深紫色产物formazan。在特定溶剂存在的 情况下，可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测 定570nm波长附近的吸光
15、度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。Bioengineering College Dalian University导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包 括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)。通过检测从质膜破 裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会Bioengineering College Dalian University完整性丧失，碘化丙啶(PI)可以染色坏死细胞。法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。Hoechst 33342可以 穿透细胞膜，
16、染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。碘化丙啶(PI)不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常 细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的Bioengineering College Dalian University采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染的方v ()v vv vWestern blot2023/3/31572023/3/31585m602023/3/31 Bioengineering College Dalian Universityv细心v责任心v爱心沿固相表面单层贴 壁生长，直至长满 表面。表面长满后 不再生长，需
17、进行 传代。一般采用酶消化法 或机械法使细胞从 生长表面上脱落下 来。贴壁型细胞Bioengineering College Dalian University不规则三角形。中央有圆形细胞核，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起突连成网，生长时呈放射状、漩涡状走向。起源于中胚层的细胞(比如心肌、平滑肌、成 骨肌细胞)在体外培养时一般表现为这种形式。Bioengineering College Dalian University外形与体内成纤维细胞形状相似，大致呈梭形或贴壁型细胞v成纤维细胞型细胞核，彼此紧密相连的成单层生长。消化道上皮、肝、胰和肺泡上皮等起源于外 胚层和内胚层的细胞在体外培养生长
18、时多呈上皮细胞型。v上皮细胞型细胞贴壁型细胞细胞呈不规则扁平多角形，中间有扁圆形胞Bioengineering College Dalian University细胞贴附于支持物上分散生长，一般不连 接成片；常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或 变形运动，速度快且方向不规则；细胞内易出 现色暗的吞噬性颗粒。该类细胞主要是单核巨 噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细v游走型细胞贴壁型细胞胞、单核细胞等。Bioengineering College Dalian University形态上不规则，由胞体和胞突两部分组成，胞突呈细长型，类似丝状伪足。最常见的多形型细胞是神经元和神经胶质细胞。v多形型
19、细胞贴壁型细胞Bioengineering College Dalian Universityv非贴附型细胞此类细胞体外生长不必贴 附于支持物上，可在培养 液中悬浮生长。来源于血 液、淋巴组织的细胞以及 某些肿瘤细胞、转化细胞悬浮型细胞系都属于此类细胞。形态 学特点是胞体始终为球形。Bioengineering College Dalian University动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养。兼性贴壁型细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠L929细胞等。Bioengineering College Dalian University的溶液，分天然培养基和合
20、成培养基。天然培养基有血清、血浆和组织提取液。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验 产物的提取和实验结果的分析。易发生支原 体污染培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长Bioengineering College Dalian University合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和 数量，用人工方法模拟合成的。主要成分是氨 基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一 些辅助物质。目前已设计出许多种培养基，如 MEM、RPMI-1640、DMEM等。优点:标准化生产，成分相对固定,成本低缺点:只能维持生存，需要额外补充血清。Bioengineering C
21、ollege Dalian University成分复杂，提供维持细胞生长增殖的各种生长因 子和保持细胞生物学性状所需的许多未知成分。常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清包括小牛血清和胎牛血清。胎牛血清来源 少，价格高。小牛血清要求刚生下未哺乳的小牛。优质血清：透明，淡黄色，无沉淀物，无污染。一般使用浓度10%，冻存细胞时用20%。血清Bioengineering College Dalian Universityv vv血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞 生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中 培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清 因子的综合反应。v在生长因子、
22、蛋白质工程、基因表达调控等研究领 域，迫切需要用无血清培养基培养细胞Bioengineering College Dalian University通过在基础培养基中补充已知的一些细胞生长因子代替血清，比如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广培养基Bioengineering College Dalian University1.玻璃器皿：浸泡、刷洗、浸酸、冲洗 2.橡胶制品：浸泡、2%NaOH1%盐酸浸泡、蒸馏水煮沸3.塑料制品：自来水冲洗、2%NaOH浸泡、自来水、5%盐酸浸泡、冲洗4.金属器具：擦拭、消毒常用各材质器材、器皿的准备烘干、包装、湿
23、热或干热灭菌煮、自来水冲洗、Bioengineering College Dalian UniversityBioengineering College Dalian University1.水：新鲜制备的三蒸水或去离子水2.平衡盐缓冲液：常用有Hanks液、Earl液和PBS等PBS：NaClKClNa2HPO4.H2OKH2PO48.00.2 1.56 0.20gggg加水至1000ml细胞培养用液的配制Bioengineering College Dalian University常用的胰蛋白酶液浓度是0.25。用无Ca2+、Mg2+的缓冲液配制；用滤器过滤除菌。消化时间 2-10分钟,
24、用含血清培养液终止其对细胞的消化 作用。用于传代细胞消化时常和EDTA联合使用。胶原酶对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适 用于消化纤维组织、上皮组织。作用温和，长时 间作用也不会影响细胞，血清和钙、镁离子对其Bioengineering College Dalian University3.消化液：胰蛋白酶、胶原酶、EDTA溶液无影响。4.培养基：合成培养基大多数都已商品化，如DMEM、RPMI-1640、MEM等。一般为粉末状，按每袋 可配置1L培养基的量分装。配制时，一袋粉末溶 于1L三蒸水中，加入2g NaHCO3，用0.22m的滤 膜抽滤灭菌；分装后于4短期保存，尽快用完。Bioen
25、gineering College Dalian University基础培养基血清双抗80一955一20 各100单位毫升血清中含有：多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等)多种金属离子；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成分Bioengineering College Dalian UniversityRPMI-1640培养粉碳酸氢钠加三蒸水 至 1000ml,完全溶解后，调节pH值至7.2 过滤除菌，分装，4保存1袋2.0g青、链霉素加血清各100单位毫升终浓度 10培养基的配制举例Bioengineering College Dalian University
