1、人脐带间充质干细胞静脉输注小鼠的安全性何君1,2，李洋1,2，陈威1,2，郝好杰3，李名烁1,2，韩瑞红1,2，武鑫1,2，卢星辰1,2，金翠英1,2，郭珣1,2，易辉1,2，李晓岑1,2，赵颖1,2，武岩1,2，徐玉环1,2 1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京，1000212.中国医学科学院糖尿病研究中心，北京，1000053.解放军总医院生命科学院基础医学所，北京，100853【摘要】目的 探讨C57/BL6J小鼠重复多次尾静脉输注人脐带间充质干细胞后的免疫反应和毒性。方法 将SPF级别的32只C57/BL6J小鼠随机分为阴性对照组、细胞移植组，每
2、组16 只，雌雄各半，细胞移植组小鼠尾静脉注射分离培养的第5代人脐带间充质干细胞，一次5106/只，每周注射一次，连续注射4周；阴性对照组每次注射相同容积的PBS。注射后后观察小鼠的一般症状，末次注射后1周、4周进行血细胞计数、血生化、免疫反应指标、脏器质量测定和组织病理学检查。结果 细胞移植组小鼠血细胞计数、血生化、脏器重量和脏器系数与对照组无显著性差异（P 0.05），脏器组织病理学在光镜下检查结果与对照组无形态学差别，以及免疫结果测定（T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+）与对照组无显著性差异( P 0.05)，较对照组有显著性差异（P 0.05). There w
3、as also no significant change in organ weight or organ coefficient between the two groups(P 0.05). There was no significant change in the subpopulation of T-cells (the percentage of CD3, CD4, CD8 T cells, and the ratio of CD4 and CD8 T cells). HUMSC transplantation group did not show any histopathol
4、ogical change in the viscera organs compared to control group. Conclusion:Results have suggested that intravenous injection of HUMSCs in C57/BL6J mice with repeated administrations is safe and feasible. No side effects and immune response were found in recipients.Key words Human umbilical cord mesen
5、chymal stem cell, Intravenous injection, Repeated administrations【作者简介】何君（1969-），女，副研究员，博士，研究方向：药理学和毒理学【基金项目】科技部863课题“干细胞治疗糖尿病的临床前方案优化及临床应用研究”（2011AA020113和2013AA020105），十一五重大新药创制专项(2009ZX09303-008) 863 project of stem cells to treat diabetes clinical scheme optimization and clinical application res
6、earch of the ministry of science and technology（2011AA020113 and 2013AA020105）, The 11th five-year fund of drug discovery projects(2009ZX09303-008)脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）具有多种作为种子细胞的优良特性，如在不同的诱导条件下可以向胰岛样细胞、肝样细胞、神经元样细胞、内皮细胞等进行分化1-5，连续传代培养和低温冻存后仍具有多向分化潜能，能造血支持和促进干细胞植入、免疫
7、调控和自我复制，并且干细胞来源丰富、容易获得、增殖能力强,因此人脐带间充质干细胞被认为最具临床应用前途6-11。有文献报道将人脐带间充质干细胞移植大鼠和食蟹猴未见明显毒性反应，认为人脐带间充质干细胞异种移植是安全可行的12-14，但未见有移植到小鼠体内的安全性详细研究，因此本实验对C57/BL6J小鼠采用尾静脉多次重复输注人脐带间充质干细胞，通过检测输注后不同时间点小鼠的各项生化和免疫指标，探讨静脉输注脐带间充质干细胞的安全性，为开展人脐带间充质干细胞的临床应用提供参考，也为今后进行脐带间充质干细胞安全性评价和在体研究选择花费低、常规易得的实验动物提供初步的实验依据。1 材料和方法1.1主要试
8、剂及仪器PE/FITC标记的大鼠抗小鼠CD4、CD8单抗，以及Percp标记的仓鼠抗小鼠CD3单抗均购自BD公司；抗小鼠CD19单抗购自eBioscience公司；抗小鼠IgG试剂盒（超敏二步法免疫组化检测试剂）购自美国GBI公司。FACSCalibur流式细胞仪(美国BD)、7100全自动生化分析仪（日本日立）、Pentra DX120全自动血液分析仪（法国ABX）、OPTIPHOT-2显微镜（日本尼康）。1.2 动物来源及饲养57周龄SPFC57/BL6J小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司【SXK（京）2009-0004】，饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所新药安全评价研究中心啮齿
9、类动物屏障设施【SYXK（京）2008-0012】，饲料经60Co照射，饮用水及垫料均经高压消毒无菌处理，对小鼠的实验操作均于无菌超净台中进行。1.3 实验材料来源人脐带间充质干细胞由解放军总医院生命科学院基础医学所培养和制备成细胞悬液，使用前均经流式细胞仪检测，细胞表面抗原符合间充质干细胞的表型特征：CD34-、CD45-、CD73-、HLA-DR-、CD90+、CD105+。具体制备及表型检测方法见该单位发表的文章15。1.4 动物分组及干细胞输注C57/BL6J小鼠随机分为细胞移植组、阴性对照组，每组16只，雌雄各半。收集培养的第5代人脐带间充质干细胞，采用PBS调整细胞浓度为2.510
10、10 /L，细胞移植组每只小鼠尾静脉注射0.2 ml/次（即5106细胞/只/次），每周注射一次，连续注射4周；阴性对照组小鼠每只尾静脉注射0.2 mL PBS。1.5 检测指标和方法实验期间每天观察一般症状；每周测定1次体重、摄食量。在末次输注后1周、4周分别将两组的一半小鼠禁食16h，从眼内眦静脉丛采集EDTA抗凝血进行血细胞计数和外周血T淋巴细胞亚群检测；采集血清进行肝肾功能指标测定；对动物实施安乐死后，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、胰腺等进行脏器称重（成对脏器一起称量），并计算脏器系数（=（脏器重量解剖当日小鼠体重）100）；采集动物肝脏左叶、左肾横截面中部各约0.3g保
11、存在液氮中，用免疫组化法检查免疫复合物，其余脏器于中性10%福尔马林固定液进行固定，取材修块后石蜡包埋切片，经苏木精-伊红染色，光镜下观察组织结构是否有病理变化。1.6 数据处理与统计方法本实验所产生的体重、摄食量、脏器重量及其系数、血细胞计数、血生化指标、T细胞亚群指标等计量数据，每组以“平均值 标准差”方式表示。应用SPSS13.0统计处理软件中独立样本t检验方法进行组间差异比较。P 0.05) ，结果见表1。末次输注后恢复1周、4周时，两组小鼠的脏器重量及脏器系数比较差异无显著性意义(P 0.05)，结果见表2。两组小鼠的摄食量差异无显著性意义(P 0.05) (表略)。表1 注射后小鼠
12、体重变化(meanstd)Tab 1 Changes in body weight in each group after injection (meanstd)实验时间Time对照组（n=8）Control注射组（n=8）Test0周（第一次注射当天）0 week（the day of 1st injection）15.91.015.70.91周（第二次注射当天）1 week（the day of 2nd injection）17.70.817.40.82周（第三次注射当天）2 weeks（the day of 3rd injection）19.11.018.91.23周（第四次注射当天）3
13、 weeks（the day of 4th injection）20.31.020.51.04周（末次注射后1周）4 weeks（1 week after last injection）20.81.121.31.05周（末次注射后2周）5 weeks（2 weeks after last injection）22.00.821.80.86周（末次注射后3周）6 weeks（3 weeks after last injection）22.90.822.60.87周（末次注射后4周）7 weeks（4 weeks after last injection）23.40.623.40.7注：实验4周及
14、以前各组的n=16,4周以后各组n=8。Note: n=16 of each group in the first 4 weeks, n=8 of each group after 4 weeks.2.2 血细胞计数结果末次输注后恢复1周时，注射组的HGB（血红蛋白）、CHC（平均红细胞血红蛋白浓度）、PLT（血小板计数）、BAS（嗜碱性粒细胞）与对照组有统计学差异（P0.05或P0.01）；恢复4周时，注射组的WBC（白细胞计数）、MCV（平均红细胞容积）、RDW（红细胞体积分布宽度）与对照组有统计学差异（P0.05或P 0.05)，结果见表3。表2 小鼠末次注射后1周、4周的脏器重量和脏器
15、系数Tab 2 Organ weight and organ coefficient in each group in 1 week and 4 weeks after last injection 脏器重量或脏器系数Organ weightorOrgan coefficient单位Unit末次注射后1周（1 week after last injection）末次注射后4周（4 weeks after last injection）对照组（n=8）Control注射组（n=8）Test对照组（n=8）Control注射组（n=8）Test脑Braing0.370.040.360.030.41
16、0.020.410.02心脏Heartg0.080.010.090.020.110.030.10.02肝脏Liverg0.80.160.830.130.920.050.940.09脾脏Spleeng0.060.010.050.010.060.010.060.01肺脏Lungg0.120.030.130.020.160.020.140.03胸腺Thymusg0.040.020.030.010.040.020.040.01肾脏Kidneyg0.210.050.230.030.290.030.260.03脑系数Brain coefficient%1.790.251.770.181.770.091.7
17、40.08心脏系数Heart coefficient%0.340.150.440.070.470.110.440.07肝脏系数Liver coefficient%3.880.934.050.633.980.234.030.41脾脏系数Spleen coefficient%0.280.030.230.060.260.040.250.03肺脏系数Lung coefficient%0.590.170.620.120.670.10.610.11胸腺系数Thymus oefficient%0.190.120.140.050.170.060.170.05肾脏系数Kidney coefficient%1.0
18、20.251.10.151.250.141.110.13表3 小鼠末次注射后1周、4周的血细胞计数指标结果(meanstd)Tab 3 Changes in hematological parameters in each group in 1 week and 4 weeks after last injection (meanstd)末次注射后1周）（1 week after last injection）末次注射后4周）（4 weeks after last injection）指标index单位unit对照组（n=8）Control注射组（n=8）Test对照组（n=8）Control
19、注射组（n=8）Test白细胞计数WBC109/L5.70.84.714.51.15.90.7*红细胞计数RBC1012/L10.30.310.10.39.51.19.21.2血红蛋白HGBg/L17461675*1761416313红细胞比容HCTL/L0.520.020.520.020.480.050.460.06平均红细胞体积MCVfL511511511501*平均红细胞血红蛋白含量MCHPg16.90.316.70.318.50.717.91.1平均血红蛋白浓度MCHCg/L33333256*3661135920红细胞宽度RDW%11.80.3120.711.10.511.70.6*血
20、小板计数PLT109/L5938268370*84694875113平均血小板体积MPVfL5.30.25.20.25.40.25.70.6淋巴细胞百分比LYM%74.63.573.23.078.33.681.54.4单核细胞百分比MON%0.10.10.00.10.00.00.10.1中性粒细胞百分比NEU%22.13.122.82.518.03.115.83.5嗜酸性粒细胞百分比EOS%2.21.41.91.51.61.01.51.1嗜碱性粒细胞百分比BAS%1.10.21.90.9*1.91.11.30.7注：与同时间点的对照组比较，*，P0.05；*，P0.01。Note：Compar
21、ed with a control group at the same point time，*，P0.05；*，P0.01. 2.3 血清生化结果末次输注后恢复1周时，注射组的AST（天门冬氨酸氨基转移酶）、BUN（尿素氮）、A/G（白/球比）与对照组有统计学差异（P0.05或P0.01）；恢复4周时，注射组的ALB（白蛋白）、TBIL（总胆红素）、A/G（白/球比）与对照组有统计学差异（P0.05或P 0.05)，结果见表4。但以上有显著性差异的指标均在文献报道的正常值范围内，与对照组比较，差异无生物学意义。表4 小鼠末次注射后1周、4周的血生化指标变化(meanstd)Tab 4 Cha
22、nges in serum biochemical parameters in each group in 1 week and 4 weeks after last injection (meanstd)末次注射后1周）（1 week after last injection）末次注射后4周）（4 weeks after last injection）指标index单位unit对照组（n=8）Control注射组（n=8）Test对照组（n=8）Control注射组（n=8）Test丙氨酸氨基转移酶ALTU/L397379275275天门冬氨酸氨基转移酶ASTU/L1182214626*11
23、03111040总蛋白TPg/L54.251.4053.482.6953.621.7051.543.00白蛋白ALBg/L34.281.5634.761.9133.921.2332.291.63*球蛋白GLOg/L19.981.8418.732.0819.700.9619.251.81总胆红素TBILmol/L0.910.361.100.321.000.03 1.230.13*碱性磷酸酶ALPU/L14929148171201911913尿素氮BUNmmol/L11.801.579.921.36*10.540.9110.781.09肌酐CREmol/L14.961.9114.221.5815.
24、413.3714.042.17白球比A/G1.730.22 2.000.09*1.720.09 1.970.15*注：与同时间点的对照组比较，*，P0.05；*，P0.01。Note：Compared with a control group at the same point time，*，P0.05；*，P 0.05)，结果见表5。表5 小鼠末次注射后1周、4周的外周血T淋巴细胞亚群变化（mean std）Tab 5 Changes of T cell subsets of peripheral blood in each group in 1 week and 4 weeks after
25、 last injection（mean std）末次注射后1周）（1 week after last injection）末次注射后4周）（4 weeks after last injection）指标index对照组（n=8）Control注射组（n=8）Test对照组（n=8）Control注射组（n=8）TestCD3+（%）49.696.1547.148.1843.453.7947.545.40CD4+（%）32.915.7930.846.7428.613.3230.895.21CD8+（%）16.651.9416.081.8916.722.3917.031.78CD4+/CD8+2
26、.000.441.920.351.750.371.840.422.4 组织病理学及免疫复合物检查结果末次输注后恢复1周、4周，输注组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、胰腺、性腺等受检脏器，与对照组小鼠组织在光镜下病理学观察结果无明显差异。对小鼠肝脏及肾脏中免疫复合物的检查采用超敏二步法免疫组化法，按照试剂盒（货号pv-9002）的操作说明进行，将组织切片后，用3% H2O2去离子水孵育 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶，然后滴加一抗、孵育、洗涤、显色等。末次输注后恢复1周、4周，两组小鼠的肝脏及肾脏均未见IgG沉积。3. 讨论随着对间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，已经可以
27、从多种组织中分离出间充质干细胞，但自体间充质干细胞输注由于受到来源有限、数量较少，以及随着年龄增长间充质干细胞增殖及多向分化能力均下降等局限，难以满足临床治疗的需要，因而来源及数量不受限制、免疫原性低的干细胞成为理想的治疗细胞。由于脐带间充质干细胞具有来源广泛、易于获得、取材方便、排除了伦理道德方面限制等优点，成为了临床进行同种异体移植的研究热点。近年的国内外许多研究证实，人脐带间充质干细胞不表达HLA-DR5,10，低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD407-8，免疫原性低，同种异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，已有异种移植治疗肝损伤、肾脏疾病、糖尿病足及自身免疫性疾病方面的
28、研究报道3,10,14-15 。对于不同来源、不同制取和培养方式、不同体外诱导方式得到的人脐带间充质干细胞，重复多次输注受体是否安全，是否对机体产生免疫原性，对于不同疾病采用怎样的细胞数量、体积及移植时间是安全有效的，这些问题都必须在临床治疗前进行动物体内试验探讨，但由于动物与人的种属差异性，没有明确合适的实验动物种属，因此对这些方面的详细研究目前较少。张学峰等12-14将人脐带间充质干细胞异种输注到大鼠或食蟹猴体内，发现无明显的脏器毒性作用和明显的免疫原性，因此这两种动物可考虑用于人脐带间充质干细胞的安全性和治疗效应评价的实验动物，但食蟹猴购买价格高，食蟹猴和大鼠实验时需要提供的人脐带间充质
29、干细胞数量大，无疑增加了实验成本。目前国内外虽有利用小鼠进行间充质干细胞体内研究，但主要应用免疫缺陷小鼠如SCID或NOD-SCID进行11，但这些小鼠购买费用高，而且对饲养环境要求较高，如果有常规易得、供试品消耗量较小的动物能进行以上相关实验，更符合动物伦理的3R原则，因此本实验采用C57/BL6J小鼠进行了探讨。目前较多研究认为充质干细胞输注患者所需细胞数为(1.02.0)106/kg11,18，按照人与小鼠等效体表面积折算方法，25g左右的小鼠应输注细胞5105/只，本实验以相当于人临床拟用剂量的10倍剂量5106/只静脉重复注射小鼠四次，结果发现注射组小鼠输注干细胞后的AST、BUN、
30、A/G、ALB、TBIL等血清生化指标均值，以及部分血细胞计数指标，如HGB、CHC、PLT、BAS、WBC、MCV、RDW，虽然与对照组有统计学差异，但注射组小鼠以上指标均在文献报道的正常值范围内，差异无生物学意义；小鼠输注人脐带间充质干细胞后对摄食量、体重、T细胞亚群、脏器系数等也不产生明显影响，小鼠的肝脏、肾脏组织未见免疫复合物，组织脏器也未出现病理学改变，表明静脉多次输注人脐带间充质干细胞，对C57/BL6J小鼠的肝、肾功能，以及其它内脏无明显毒性作用，也免疫原性，重复多次异种静脉移植人脐带间充质干细胞是安全可行的，同时提示C57/BL6J小鼠可作为人脐带间充质干细胞进行安全性和效应学
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