1、绪论基因（gene）：是合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA，包括编码蛋白质或RNA的核酸序列及为保证转录所必需的调控序列。断裂基因（splite gene）真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因基因组（genome）：是指一个物种的单倍体的染色体所携带的全部遗传信息。C值（C value）：一种生物体单倍体基因组的DNA含量总是恒定的，它通常称为该物种DNA的C值。C值矛盾：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象（又称：C值悖论，C value paradox
2、） 必需基因：指关系到生物体存活的基因，可通过基因突变的方法确定致死位点的数量，以得知基因组必需基因的数量 重叠基因（overlapping gene）是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。 类核（nucleoid）：是指原核生物基因组通常由一条环状的双链DNA分子组成，在细胞中与蛋白质结合成染色体的形式，在细胞内形成一个致密的区域。转座子：能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列称为转座因子（transposable element），又称为可转座元件插入序列(insertion sequence，IS) ：2 000bp以内
3、，两端正向重复序列（direct repeats，DR）、反向重复序列（inverted repeats，IR），中间1kb左右的编码序列，仅编码和转座有关的转座酶。复合型转座子( composite transposon) ：2 00020 000bp之间，两端由一对IS元件组成，带有与转座作用有关的基因和其他基因。 质粒（plasmid）：是指一类染色体外具有自主复制能力的环状双链DNA分子，属染色体外基因组。质粒的不相容性：两种不同的质粒因利用同一复制和维持机制，在复制和随后向子代细胞分配的过程中会发生竞争，从而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质粒将被丢失的现象。Alu家族是灵长类
4、基因组特有的含量丰富的中度重复序列，是散在重复序列中最大的一个家族，因序列内部有限制性内切酶AluI的酶切位点而得名。反向重复序列 ：是指两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上的反向排列。 卫星DNA 是另一类高度重复序列，这类重复序列的重复单位一般由2-10bp组成，成串排列。 多基因家族（multi gene family） ：是指由某一祖先基因经过复制和变异所产生的一组基因。 假基因(pseudogene)具有与功能基因相似的序列，但由于有许多突变以致失去了原有的功能，不能转录或转录后生成无功能的蛋白质的基因，常用表示。母系遗传。子代线粒体基因组来自母亲，父系的线粒体基因组在精卵结合时一
5、般不能进入卵细胞。因此，在子代个体发育过程中没有父母双方线粒体DNA的重组发生。基因组学（Genomics）是一门对生命有机体全基因组进行序列分析和功能研究的新兴学科。人类基因组计划（The Human Genome Project， HGP）是二十世纪九十年代初开始启动的多国科学合作计划，对少数人进行全基因组（即24条非同源染色体，共30亿碱基）的测序和拼接，绘制出人类基因的谱图 。遗传图谱（genetic map）：又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。遗传多态性：在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出
6、现频率皆高于1%物理图谱（physical map）：利用限制性内切酶将大分子DNA切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离碱基对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)为路标的图谱。物理图谱的完成是一个里程碑式的成功，它准确地得出了基因的相对位置。基因图谱（转录图谱）：在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。 基因定位克隆：是指利用微卫星和SNP全基因组扫描来搜索与疾病性状紧密相关的位点，从而确定疾病相关基因的位置并进一步获得克隆。比较基因组学：是一门新兴的交叉学科，在基因组学水平上研究不同物种在基因组结构与
7、功能方面亲缘关系、内在的联系，以及进化地位。 宏基因组是指生境中全部微小生物遗传物质的总和。宏基因组学就是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段,通过非培方法进行某个特殊生态环境中微生物群落的鉴定。主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选。可用于发现新基因、开发新的生物活性物质、研究群落中微生物多样性等。蛋白质组蛋白质组（proteome）：PROTEins + genOME，意思是Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋白质）蛋白质组学(proteomics): 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的
8、一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等电聚焦电泳与第二向SDS-PAGE组成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白质等电点（pI）的差异进行分离，SDS-PAGE则是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离。 等电聚焦（IEF）：在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的pH梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，带正电荷的蛋
9、白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自的pI处时，所带净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上。这种不同的蛋白质分别聚集在各自的pI处，形成一条狭窄稳定的区带而彼此分开的现象称为等电点聚焦。SDS-PAGE： 在PAGE系统中加入SDS和还原剂后所组成的电泳系统。SDS是一种阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质分子内，破坏蛋白质分子内的氢键及疏水作用，改变蛋白质分子的三级和四级结构；还原剂则断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质分子去折叠，结构变得舒展。蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子间原有电荷的差异。蛋白质
10、-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质的分子量大小。 质谱分析法（MS）是指在一定条件下，将样品分子电离成离子，然后通过测定这些离子的质荷比（m/z）和强度来进行定性和定量的一种分析方法。质谱分析法的过程为：将样品气化并电离成带电离子，然后通过一定方法将不同m/z的离子分开，并测定其强度，绘出质谱图，对质谱图进行分析可得到关于样品分子结构和定量方面的信息。标准质谱图：有机分子受到电子轰击后，会断裂形成不同的多种离子，以离子的质荷比m/z为横座标，离子强度为纵坐标作图，得到的质谱图称为标准质谱图，也叫棒图。 电喷雾质谱（ESI）基质
11、辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI）完整的现代质谱仪由进样系统、离子源、质量分析器、离子检测器、数据处理及控制系统五部分组成，此外还有一个保持质谱仪高真空度的真空系统。离子源和质量分析器是质谱仪最重要的两个部件，也是不同质谱仪的主要差别所在。肽质量指纹图谱法 基本过程为：蛋白质混合物样品经过2-DE分离后，从胶上切下需要鉴定的蛋白质斑点，用胰蛋白酶进行水解，胰蛋白酶在特定位点切割蛋白质，形成长短不一的多肽混合物，用MALDI-TOF质谱仪对多肽混合物进行质量分析，得到肽片段质谱图，一个质谱峰代表一种肽片段离子。由于各种蛋白质的一级结构不同，胰酶水解后产生的肽片段数目及质量均不相同，具有特
12、征性，因此将得到的肽片段质谱图称为PMF。肽序列标签鉴定法 蛋白质由20种氨基酸组成，在蛋白质上随意选取一个四肽序列，根据概率论计算，另一个蛋白质上出现相同四肽序列的概率为1/204，即1/160,000，因此从理论上说，只要测定一个蛋白质中56个氨基酸残基的序列，就足以作为鉴别蛋白质的特异性标签，称为肽序列标签。酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system)是20世纪90年代初期发展出来的一种用于研究蛋白质相互作用的方法手段，它利用酵母细胞内的真核表达系统，将两种外源蛋白质的基因分别与酵母转录因子的两个功能结构域融合，通过质粒导入酵母细胞，以酵母细胞表型的改变作为外源蛋白是
13、否发生相互作用的筛选标志。等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。等电聚焦电泳: 利用具有pH梯度的支持介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。等点聚焦：就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上；基因工程基因工程（gene engineering ）：又称DNA重组技术（DNA recombination），是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞
14、内复制和表达的技术。分子克隆（molecular cloning ）：是指将目的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子大量拷贝的技术。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。回文结构（palindrome structure）：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。粘性末端（sticky end）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。平末端（blunt end）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产
15、生的末端。同工异源酶（isoschizomers）：指来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。 同尾酶（isocaudarner）：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶。Klenow片段： 补齐双链DNA的3末端，同时可使3 末端DNA标记上同位素。 cDNA克隆中，合成cDNA第二链。 DNA序列分析。Taq DNA聚合酶（简称Taq 酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是7080，Taq酶具有53 聚合酶活性和依赖于聚合作用的53外切酶活性。逆转录酶（reverse transcriptase）是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化
16、合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，简称末端转移酶）：分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3末端-OH上。末端转移酶的功能主要有： 在载体或目的基因 3末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。 用于DNA 3末端的同位素探针标记。DNA连接酶（DNA ligase）：称为基因工程的缝纫针，它的主要功能是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5磷酸基团与3羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平
17、末端的DNA连接起来。DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两种类型。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5-磷酸基团。主要用途有： 除去DNA片段上的5磷酸以防自身连接。 在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，从RNA或DNA上除去5端的磷酸。T4多核苷酸激酶核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分。其主要作用有： 除去粘性末端以产生平末端。 除去cDNA合成时形成的发夹结构。 分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。载体（vector）：指能携带外源DNA片段导入
18、宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。克隆载体：能将载体外源DNA在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的DNA的载体。pBR322质粒是由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。pUC系列载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA质粒载体。溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。M13噬菌体粘粒(cosmid)是由质粒和l噬菌体的cos位点构建而成。表达载体是指能将外源基因在受体
19、细胞中有效转录和正确翻译的载体。报告基因：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因。终止子：一个基因的3末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能。增强子（enhancer）：是一类显著提高基因转录效率的顺式作用元件。基因组文库（genomic library，G-文库）是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。转化（transformation）：是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。感受态细胞(competent cell)：细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。蓝白斑筛选法：
20、某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码b-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸a-肽的DNA片段， IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型b-半乳糖苷酶实现基因内a-互补，形成完整的b-半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal 形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。当外源基因插入lacZ基因中MCS，lac a-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无b-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选法。变性（denaturation） ：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。融解温度
21、（ melting temperature，Tm）：在热变性过程中，紫外吸收增加达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度。复性（renaturation）：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。退火（annealing）：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。核酸分子杂交（molecular hybridization）:两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。核酸探针（nucleic acid probe)：是指能
22、与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。原位杂交（In situ hybridization ）是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization, FISH）是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。基因芯片(gene chip)：又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray），是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纤维膜等载体。该技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核
23、酸序列分析手段。聚合酶链式反应技术及应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是生命科学界的重大发明，是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸内切酶可识别特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的
24、DNA分子的序列信息单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism，简称PCR-SSCP）本法就是将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。巢式PCR（nested PCR ）逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）one-step RT-PCR：在同一体系中加入逆
25、转录酶、逆转录引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR。多重PCR(multiplex PCR) PCR一般由一对引物扩增产生一个核酸片段，以此手段诊断疾病的效率低。为提高效率，常采用多重PCR技术。该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定。锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不对称PCR（asymmetric PCR） 其基本原理是：采用两条
26、不同浓度的引物，即非限制引物（高浓度引物）与限制性引物（低浓度引物），二者之比为50100:1。在PCR最初10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA（dsDNA）；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导的PCR就会产生大量的单链DNA（ssDNA）。尽管此时单链DNA仅以线性速率递增，但其浓度已能满足双脱氧链终止法测定DNA序列的要求。反向PCR（inverse PCR） 扩增长片段PCR（long PCR，long-distance PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 原位PCR (in situ PCR)差示PCR（DD-PCR） 定量PCR 实时荧光定量PC
27、R（RT-FQ-PCR）在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 重组PCR（recombinant PCR）：将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。该技术主要应用于DNA片段的任何位置引入点突变、插入、缺失以及两个不相邻片段的连接。其基本原理是将突变碱基、插入或缺失片段、或一种物质的几个基因片段的部分碱基设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重组合的DNA。扩增曲线荧光阈值：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）
28、，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数SYBR Green ： 只有和双链DNA结合后才发荧光（ SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位）变性时，DNA双链分开，无荧光在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBR Green 也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析TaqMan： 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有53外切核酸
29、酶活性，可水解探针Molecular Beacon：分子信标生物分子的分离纯化生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。生物大分子：匀浆(Homogenization) 细胞被置于一密闭的容器中 (常为玻璃).匀浆器配有一非常合适的插头,通过其上下及左右的往复运动来破碎细胞.超声(Sonication) 超声波发生器可直接浸入到细胞悬浮物中,超声波发生器会经振动发出高频率的声波而使细胞破碎.PMSF(苯甲基磺酰氟)巯基乙醇（ -mercaptoethanol）二硫苏糖醇(DTT)还原型的谷胱甘肽（Glu-Cys-Gly）
30、盐溶-在低浓度时, 由于盐能屏蔽蛋白之间的电荷-电荷相互作用,添加盐通常会增加荷电分子的溶解性。盐析-大量盐夺走水分子，破坏水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏亲水胶体，蛋白质分子形成沉淀。有机溶剂沉淀法 降低水溶液的介电常数，减少溶剂的极性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。选择性沉淀法 生物大分子在物理化学性质等方面的差异， 选择一定的条件使杂蛋白变性沉淀而得到分离提纯。 常用的有热变性，选择性酸碱变性，有机溶剂变性 等电点沉淀法 不同等电点的电解质，在达到电中性时溶解度最低， 易发生沉淀，主要用于去除杂蛋白 有机聚合物
31、沉淀法 聚乙二醇 Polyethylene Glycol, PEG透析 ：将半透膜制成袋状，将生物大分子样品置于袋内，将透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。超滤是一种加压膜分离技术，即在一定压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到部分纯化。密度梯度离心法：双链DNA,单链DNA,RNA和蛋白质具有不同的密度，可用密度梯度离心形成不同密度的纯样品区带，达到分离目的。酚抽提法(SDS法）本法最初于1976年由Stafford及其
32、同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。 甲酰胺解聚法1987年Kupiec等报道了甲酰胺（formamide）解聚法，该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和有机溶剂。 玻棒缠绕法用该法收集高分子量DNA的沉淀始于20世纪30年代，现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改进而来。本法有两
33、个关键步骤：一是基因组DNA沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面；二是将DNA沉淀缠绕在带钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转移至pH8.0的TE缓冲液中。碱裂解法染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SD
34、S裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA 煮沸裂解法是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。CsCl-EB法：利用CsCl形成的连续密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。聚乙二醇沉淀法（一种分级沉淀法）柱
35、层析法 （树脂）酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法 ：分离总RNA磁性球珠分离法 该法联合利用了oligo（dT）与poly（A）的互补配对、生物素（biotin）与链亲和素（streptavidin）的结合特异性以及磁性分离原理，可对poly（A）+RNA进行高效、灵敏及快捷的分离。纯度（purity）或比活性（specific activity），以增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生物学活性（比活常以活力单位数/毫克蛋白质表示），即从蛋白混合物中设法去除不要的杂蛋白和变性的靶蛋白，使靶蛋白的产量达到最高值。盐析法：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破
36、坏，导致蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。离子交换层析：根据各种离子或离子 与离子
37、交换剂的结合力不同而进行分类纯化密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度：不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法电泳(elctrophoresis)：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳。(elctrophoresis) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：常用于蛋白质分 子量的测定。每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电
38、荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，Eq值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。pH梯度以两性电解质ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外电场作用下自然形成。按照等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦。亲和层析（ Affinity Chromatography) 是以蛋白质与结合在介质上的配基间的特异亲和力为工作基础。配基可以是生物学特异的，如底物、抗体、
39、抑制剂、辅酶及蛋白质（如抗原、抗体）、核酸。也可以是具有相对特异相互作用的凝集素（糖结合蛋白）、染料和疏水分子(亦可归属疏水相互作用色谱)。亲和层析是应用了特定蛋白的生物学特异性而不是物化特性。具有亲和选择性强，纯化效率高，可以一步纯化。GST 融合载体毛细管电泳（CE）高效液相色谱（HPLC）分子生物学新技术及其应用代谢组(metabolome)是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合, 包含一系列不同化学型的分子, 比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。 代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变
40、化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。高效液相色谱技术（HPLC）高效毛细管电泳技术（HPCE）气相色谱-质谱联用技术（GC-MS)液相色谱-质谱联用技术 （LC-MS)毛细管电泳-质谱联用技术 （CE-MS)： 毛细管电泳是以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。只有CE，解释不完整。核磁共振技术 （NMR）：基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学，主要用于反映化合物结构中的H和C原子的位置信息。miRNA：是由2125个核苷酸组成的非编码RNA；它通过与靶
41、基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达；它在生物体生长发育、细胞增殖、分化、凋亡以及人类各种疾病的发生发展过程中发挥重要的调控作用。miRNA基因克隆：miRNA克隆是依赖于其本身的特殊结构，5端的磷酸基团和3端的羟基基团，以T4 RNA连接酶在分子末端加上连接子，然后利用RT-PCR方法扩增获得目的片段，克隆到合适的载体，最后测序验证。PAGE/Northern blotting：基本原理：PAGE/Northern blotting与常规核酸杂交技术原理相同，都是根据碱基互补配对原理，设计特异探针，与膜杂交，经放射自显影后分析杂交信号。唯一的差
42、别在于选择对小分子RNA分离效率更高的PAGE代替琼脂糖作为分离胶。MicroRNA基因芯片技术 ：即经过标记的待测microRNA与芯片上特定位置的探针根据碱基互补配对原则杂交，再经特定仪器扫描，以计算机相关软件对荧光信号进行检测，并转化为可读的数字信息，最后经大量数据分析筛选出有显著表达差异的microRNA。 MicroRNA实时定量PCR：利用能特异标记PCR产物的荧光物质，显示PCR 产物的动态累积，得到S 型的扩增曲线；假设该曲线的前期PCR 符合指数性扩增，于是在单纯指数方程的基础上，通过比较产物积累的速度来间接比较初始模板的分子数。 最初，实时定量PCR被用于定量检测小RNA分
43、子的前体表达；现在，经过方法改进可用于检测成熟小RNA分子的表达。基因诊断血常规 （MCV,MCH）基因诊断-指利用分子生物学技术，检测体内DNA或RNA在结构或表达水平上的变化，从而对疾病做出诊断的方法，通常又称为分子诊断(Molecular Diagnosis)。lncRNABiomarker is a measurable indicator of the severity or presence of some disease state. More generally a biomarker is anything that can be used as an indicator o
44、f a particular disease state or some other physiological state of an organism.Molecular biomarkers have been defined as biomarkers that can be discovered using basic and acceptable platforms such as genomics and proteomicsDNA polymorphisms-RFLPDNA polymorphisms-VNTRDNA polymorphisms-SNP核酸分子杂交：来源不同的D
45、NA（或RNA）片段，按照碱基互补关系形成异源双链分子的过程。Southern印迹杂交Northern印迹杂交点杂交（Dot-Blot）反向点杂交（Reverse Dot-Blot）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）：在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性退火延伸三个基本反应步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。DNA芯片技术荧光原位杂交比较基因组杂交多重探针连接扩增Multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA) 变性高效色谱分析Dena
46、turing high performance liquid chromatography (DHPLC) 第一代：双脱氧核苷酸末端终止法第二代：焦磷酸测序（Pyrosequencing）第三代：单分子实时测序（Single Molecule Real Time Sequencing , SMRT)杜氏肌营养不良 （Duchenne muscular dystrophy ）症状前诊断（Asymptomatic diagnosis）产前诊断 （Prenatal diagnosis）着床前诊断 （Preimplantation diagnosis）核酸杂交捕获（Hybrid Capture，HC）基 因 治 疗基因治疗（ Gene therapy ）广义概念将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。基因矫正（gene correction） 对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能； 基因置换（gene replacement）
