1、第五章 紫外可见分光光度法一教学内容1 紫外可见吸收光谱的产生（分子的能级及光谱、有机物及无机物电子能级跃迁的类型和特点）2 吸收定律及其发射偏差的原因3 仪器类型、各部件的结构、性能以及仪器的校正4 分析条件的选择5 应用（定性及结构分析、定量分析的各种方法、物理化学常数的测定及其它方面的应用二重点与难点1 比较有机化合物和无机化合物各种电子跃迁类型所产生吸收带的特点及应用价值2 进行化合物的定性分析、结构判断3 定量分析的新技术（双波长法、导数光谱法、动力学分析法）4 物理化学常数的测定三教学要求1 较为系统、深入地掌握各种电子跃迁所产生的吸收带及其特征、应用2 熟练掌握吸收定律的应用及测
2、量条件的选择3 较为熟练仪器的类型、各组件的工作原理4 运用各种类型光谱及的经验规则，判断不同的化合物5 掌握定量分析及测定物理化学常数的常见基本方法6 一般掌握某些新的分析技术四学时安排 5学时 研究物质在 紫外、可见光区 的分子吸收光谱 的分析方法称为紫外-可见分光光度法。紫外可见分光光度法是利用某些物质的分子吸收200 800 nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子 在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定。第一节 紫外可见吸收光谱一、分子吸收光谱的产生 在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转
3、动。这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级。在每一电子能级上有许多间距较小的振动能级，在每一振动能级上又有许多更小的转动能级。 若用E电子、 E振动、 E转动分别表示电子能级、振动能级转动能级差，即有 E电子 E振动 E转动。处在同一电子能级的分子，可能因其振动能量不同，而处在不同的振动能级上。当分子处在同一电子能级和同一振动能级时，它的能量还会因转动能量不同，而处在不同的转动能级上。所以分子的总能量可以认为是这三种能量的总和： E分子 = E电子 + E振动 + E转动 当用频率为n的电磁波照射分子，而该分子的较高能级与较低能级之差 E恰好等于该电磁波的能量 hn时，即有 E = hn
4、 （ h为普朗克常数） 此时，在微观上出现分子由较低的能级跃迁到较高的能级；在宏观上则透射光的强度变小。若用一连续辐射的电磁波照射分子，将照射前后光强度的变化转变为电信号，并记录下来，然后以波长为横坐标，以电信号（吸光度 A）为纵坐标，就可以得到一张光强度变化对波长的关系曲线图分子吸收光谱图。二、分子吸收光谱类型 根据吸收电磁波的范围不同，可将分子吸收光谱分为远红外光谱、红外光谱及紫外、可见光谱三类。 分子的转动能级差一般在0.005 0.05eV。产生此能级的跃迁，需吸收波长约为250 25mm的远红外光，因此，形成的光谱称为转动光谱或远红外光谱。 分子的振动能级差一般在0.05 1 eV，
5、需吸收波长约为25 1.25mm的红外光才能产生跃迁。在分子振动时同时有分子的转动运动。这样，分子振动产生的吸收光谱中，包括转动光谱，故常称为振-转光谱。由于它吸收的能量处于红外光区，故又称红外光谱。电子的跃迁能差约为1 20 eV，比分子振动能级差要大几十倍，所吸收光的波长约为12.5 0.06mm，主要在真空紫外到可见光区，对应形成的光谱，称为电子光谱或紫外、可见吸收光谱。 通常，分子是处在基态振动能级上。当用紫外、可见光照射分子时，电子可以从基态激发到激发态的任一振动（或不同的转动）能级上。因此，电子能级跃迁产生的吸收光谱，包括了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带，这就是为
6、什么分子的紫外、可见光谱不是线状光谱，而是带状光谱的原因。又因为绝大多数的分子光谱分析，都是用液体样品，加之仪器的分辨率有限，因而使记录所得电子光谱的谱带变宽。 由于氧、氮、二氧化碳、水等在真空紫外区（60 200 nm）均有吸收，因此在测定这一范围的光谱时，必须将光学系统抽成真空，然后充以一些惰性气体，如氦、氖、氩等。鉴于真空紫外吸收光谱的研究需要昂贵的真空紫外分光光度计，故在实际应用中受到一定的限制。我们通常所说的紫外可见分光光度法，实际上是指近紫外、可见分光光度法。 第二节 化合物紫外可见光谱的产生 在紫外和可见光谱区范围内，有机化合物的吸收带主要由ss*、pp*、ns*、np*及电荷迁
7、移跃迁产生。无机化合物的吸收带主要由电荷迁移和配位场跃迁（即dd跃迁和ff跃迁）产生. 由于电子跃迁的类型不同，实现跃迁需要的能量不同，因此吸收光的波长范围也不相同。其中ss*跃迁所需能量最大，np*及配位场跃迁所需能量最小，因此，它们的吸收带分别落在远紫外和可见光区。从图中 可知，pp*（电荷迁移）跃迁产生的谱带强度最大，ss*、np*、ns*跃迁产生的谱带强度次之，（配位跃迁的谱带强度最小）。一、有机化合物的紫外可见吸收光谱（一）、跃迁类型 基态有机化合物的价电子包括成键s电子、成键p电子和非键电子（以 n表示）。分子的空轨道包括反键 s*轨道和反键p*轨道，因此，可能的跃迁为ss*、pp
8、*、ns* np*等。 1，ss*跃迁 它需要的能量较高，一般发生在真空紫外光区。饱和烃中的cc键属于这类跃迁，例如乙烷的最大吸收波长lmax为135nm。 2，ns*跃迁 实现这类跃迁所需要的能量较高，其吸收光谱落于远紫外光区和近紫外光区，如CH3OH和CH3NH2的ns*跃迁光谱分别为183nm和213nm。 3，pp*跃迁 它需要的能量低于ss*跃迁，吸收峰一般处于近紫外光区，在200 nm左右，其特征是摩尔吸光系数大，一般emax104，为强吸收带。如乙烯（蒸气）的最大吸收波长lmax为162 nm。 4，np*跃迁 这类跃迁发生在近紫外光区。它是简单的生色团如羰基、硝基等中的孤对电子
9、向反键轨道跃迁。其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100，属于禁阻跃迁。 5，电荷迁移跃迁 所谓电荷迁移跃迁是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向与接受体相联系的轨道上跃迁。因此，电荷迁移跃迁实质是一个内氧化还原的过程，而相应的吸收光谱称为电荷迁移吸收光谱。例如某些取代芳烃可产生这种分子内电荷迁移跃迁吸收带。 电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度较大，最大波长处的摩尔吸光系数emax可大于104。（二）、常用术语1，生色团 从广义来说，所谓生色团，是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。但是，人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。 2，助色团 助色团是
10、指带有非键电子对的基团，如-OH、 -OR、 -NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸光度。3，红移与蓝移（紫移） 某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团（ -OH、 -OR、 -NH2、-SH 、-Cl、-Br、-SR、- NR2 ）之后，吸收峰的波长将向长波方向移动，这种效应称为红移效应。这种会使某化合物的最大吸收波长向长波方向移动的基团称为向红基团。 在某些生色团如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波长会向短波方向移动，这种效应称为蓝移（紫移）效应。这些会使
11、某化合物的最大吸收波长向短波方向移动的基团（如-CH2、-CH2CH3、-OCOCH3）称为向蓝（紫）基团。(三)有机化合物紫外-可见吸收光谱1，饱和烃及其取代衍生物 饱和烃类分子中只含有s键，因此只能产生ss*跃迁，即s电子从成键轨道（ s ）跃迁到反键轨道（ s *）。饱和烃的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可见分光光度计的测量范围。 饱和烃的取代衍生物如卤代烃，其卤素原子上存在n电子，可产生ns* 的跃迁。 ns* 的能量低于ss*。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的ns* 跃迁分别出现在173、204和258nm处。这些数据不仅说明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相应的吸收
12、波长发生了红移，显示了助色团的助色作用。直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不大。但是它们是测定紫外和（或）可见吸收光谱的良好溶剂。2，不饱和烃及共轭烯烃 在不饱和烃类分子中，除含有s键外，还含有p键，它们可以产生ss*和pp*两种跃迁。 pp*跃迁的能量小于 ss*跃迁。例如，在乙烯分子中， pp*跃迁最大吸收波长为180nm 在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键共轭时，随着共轭系统的延长， pp*跃迁的吸收带 将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强。在共轭体系中， pp*跃迁产生的吸收带又称为K带。 3，羰基化合物 羰基化合物含有C=O基团。 C=O基团主要可产生p
13、p*、 ns* 、np*三个吸收带， np*吸收带又称R带，落于近紫外或紫外光区。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基。由于醛酮这类物质与羧酸及羧酸的衍生物在结构上的差异，因此它们np*吸收带的光区稍有不同。 羧酸及羧酸的衍生物虽然也有np*吸收带，但是， 羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接连结含有未共用电子对的助色团，如-OH、-Cl、-OR等，由于这些助色团上的n电子与羰基双键的p电子产生np共轭，导致p*轨道的能级有所提高，但这种共轭作用并不能改变n轨道的能级，因此实现np* 跃迁所需的能量变大，使np*吸收带蓝移至210nm左右。4，苯及其衍生物 苯有三个吸收带，它
14、们都是由pp*跃迁引起的。E1带出现在180nm（eMAX = 60，000）； E2带出现在204nm（ eMAX = 8，000 ）；B带出现在255nm （eMAX = 200）。在气态或非极性溶剂中，苯及其许多同系物的B谱带有许多的精细结构，这是由于振动跃迁在基态电子上的跃迁上的叠加而引起的。在极性溶剂中，这些精细结构消失。当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B谱带。5，稠环芳烃及杂环化合物 稠环芳烃，如奈、蒽、芘等，均显示苯的三个吸收带，但是与苯本身相比较，这三个吸收带均发生红移，且强度增加。随着苯环数目的增多，吸收波长红移越多，吸收强度也
15、相应增加。 当芳环上的-CH基团被氮原子取代后，则相应的氮杂环化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光谱，与相应的碳化合物极为相似，即吡啶与苯相似，喹啉与奈相似。此外，由于引入含有n电子的N原子的，这类杂环化合物还可能产生np*吸收带。二、无机化合物的紫外-可见吸收光谱 产生无机化合物紫外、可见吸收光谱的电子跃迁形式，一般分为两大类：电荷迁移跃迁和配位场跃迁。（一）电荷迁移跃迁 无机配合物有电荷迁移跃迁产生的电荷迁移吸收光谱。 在配合物的中心离子和配位体中，当一个电子由配体的轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上时，可产生电荷迁移吸收光谱。 不少过度金属离子与含生色团的试剂反应所生成的配合物以及许多水合无机离
16、子，均可产生电荷迁移跃迁。 此外，一些具有d10电子结构的过度元素形成的卤化物及硫化物，如AgBr、HgS等，也是由于这类跃迁而产生颜色。 电荷迁移吸收光谱出现的波长位置，取决于电子给予体和电子接受体相应电子轨道的能量差。（二）配位场跃迁 配位场跃迁包括d - d 跃迁和f - f 跃迁。元素周期表中第四、五周期的过度金属元素分别含有3d和4d轨道，镧系和锕系元素分别含有4f和5f轨道。在配体的存在下，过度元素五 个能量相等的d轨道和镧系元素七个能量相等的f轨道分别分裂成几组能量不等的d轨道和f轨道。当它们的离子吸收光能后，低能态的d电子或f电子可以分别跃迁至高能态的d或f轨道，这两类跃迁分别
17、称为d - d 跃迁和f - f 跃迁。由于这两类跃迁必须在配体的配位场作用下才可能发生，因此又称为配位场跃迁。三、溶剂对紫外、可见吸收光谱的影响 溶剂对紫外可见光谱的影响较为复杂。改变溶剂的极性，会引起吸收带形状的变化。例如，当溶剂的极性由非极性改变到极性时，精细结构消失，吸收带变向平滑。 改变溶剂的极性，还会使吸收带的最大吸收波长发生变化。下表为溶剂对亚异丙酮紫外吸收光谱的影响。 正己烷 CHCl3 CH3OH H2O pp* lmax/nm 230 238 237 243 n p*lmax/nm 329 315 309 305 由上表可以看出，当溶剂的极性增大时，由n p* 跃迁产生的吸
18、收带发生蓝移，而由pp* 跃迁产生的吸收带发生红移。因此，在测定紫外、可见吸收光谱时，应注明在何种溶剂中测定。 由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或数据表中必须注明所用的溶剂。与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相同。在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。选择溶剂时注意下列几点：（1）溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质应该是惰性的。即所成溶液应具有良好的化学和光化学稳定性。 （2）在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小的溶剂。（3）溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收。第三节 紫外-可见分光光度计一、组成部件 紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：
19、即光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统。（一）光源 对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小。 分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。 热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。钨灯和碘钨灯可使用的范围在340 2500nm。这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关，在可见光区，辐射的能量与工作电压4次方成正比。光电流与灯丝电压的n次方（n1）成正比。因此必须严格控制灯丝电压，仪器必须配有稳压装置。 在近紫外区测定时常用氢灯和氘灯。它们可在160
20、 375 nm范围内产生连续光源。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大35倍。（二）单色器 单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。 单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色散元件，起分光的作用。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度度、选择性及校准曲线的线性关系等。 能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。 棱镜有玻璃和石英两种材料。它们
21、的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域内。石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三 个光域。 光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。入射、出射狭缝，透镜及准光镜等光学元件中狭缝在决定单色器性能上起重要作用。狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭
22、缝又会减弱光强。（三）吸收池 吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料两种。石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。（四）检测器 检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。 常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。 硒光电池对光的敏感范围为300800nm，其中又以500 600nm最为灵敏。这种光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流计的光电流，但由于容
23、易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中。 光电管在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。 光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。（五）信号指示系统 它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。二、紫外-可见分光光度计的类型 紫外-可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三种类型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波
24、长分光光度计。1，单光束分光光度计 经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。2，双光束分光光度计 经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。 双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。3，双波长分光光度计 由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（l
25、1和l2）的单色光；利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值A（A=Al1-Al2）。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。 通过光学系统转换，使双波长分光光度计能很方便地转化为单波长工作方式。如果能在l1和l2处分别记录吸光度随时间变化的曲线，还能进行化学反应动力学研究。三、分光光度计的校正 通常在实验室工作中，验收新仪器或实验室使用过一段时间后都要进行波长校正和吸
26、光度校正。 建议采用下述的较为简便和实用的方法来进行校正：镨铷玻璃或钬玻璃都有若干特征的吸收峰，可用来校正分光光度计的波长标尺，前者用于可见光区，后者则对紫外和可见光区都适用。也可用K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度。定性分析 紫外可见分光光度法是一种广泛应用的定量分析方法，也是对物质进行定性分析和结构分析的一种手段，同时还可以测定某些化合物的物理化学参数，例如摩尔质量、配合物的配合比和稳定常数、以及酸、碱的离解常数等。 紫外可见分光光度法在无机元素的定性分析应用方面是比较少的，无机元素的定性分析主要用原子发射光谱法或化学分析法。在有机化合物的定性分析鉴定及结构分析方面，由于紫外可见光谱较为
27、简单，光谱信息少，特征性不强，而且不少简单官能团在近紫外及可见光区没有吸收或吸收很弱，因此，这种方法的应用有较大的局限性。但是它适用于不饱和有机化合物，尤其是共轭体系的鉴定，以此推断未知物的骨架结构。此外，它可配合红外光谱法、核磁共振波谱法和质谱法等常用的结构分析法进行定量鉴定和结构分析，是不失为一种有用的辅助方法。一般定性分析方法有如下两种： 1. 比较吸收光谱曲线法吸收光谱的形状、吸收峰的数目和位置及相应的摩尔吸光系数，是定性分析的光谱依据，而最大吸收波长及相应的是定性分析的最主要参数。比较法有标准物质比较法和标准谱图比较法两种。利用标准物质比较，在相同的测量条件下，测定和比较未知物与已知
28、标准物的吸收光谱曲线，如果两者的光谱完全一致，则可以初步认为它们是同一化合物。为了能使分析更准确可靠，要注意如下几点：一、是尽量保持光谱的精细结构。为此，应采用与吸收物质作用力小的非极性溶剂，且采用窄的光谱通带； 二、是吸收光谱采用对作图。这样如果未知物与标准物的浓度不同，则曲线只是沿轴平移，而不是象曲线那样以的比例移动，更便于比较分析。三、是往往还需要用其它方法进行证实，如红外光谱等。利用标准谱图或光谱数据比较。常用的标准谱图有以下表中的四种：1 Sadtler Standard Spectra(Ultraviolet),Heyden,London,1978. 萨特勒标准图谱共收集了4600
29、0种化合物的紫外光谱。2 R.A.Friedel and M.Orchin,“Ultraviolet and Visible Absorption Spectra of Aromatic Compounds”,Wiley,New York, 1951. 本书收集了597种芳香化合物的紫外光谱。 3 Kenzo Hirayama：“Handbook of Ultraviolet and Visible Absorption Spectra a of Organic Compounds.”,New York,Plenum,1967。4 “Organic Electronic Spectral Da
30、ta”。2. 计算不饱和有机化合物最大吸收波长的经验规则 有伍德沃德（Woodward）规则和斯科特（Scott）规则。 当采用其它物理或化学方法推测未知化合物有几种可能结构后，可用经验规则计算它们最大吸收波长，然后再与实测值进行比较，以确认物质的结构。伍德沃德规则它是计算共轭二烯、多烯烃及共轭烯酮类化合物*跃迁最大吸收波长的经验规则，如表13.7和表13.9所示。计算时，先从未知物的母体对照表得到一个最大吸收的基数，然后对连接在母体中电子体系(即共轭体系)上的各种取代基以及其他结构因素按上所列的数值加以修正，得到该化合物的最大吸收波长。结构分析 紫外可见分光光度法可以进行化合物某些基因的判别
31、、共轭体系及构型、构象的判断。 1. 某些特征集团的判别有机物的不少基团(生色团)，如羰基、苯环、硝基、共轭体系等，都有其特征的紫外或可见吸收带，紫外可见分光光度法在判别这些基团时，有时是十分有用的。如在270300nm处有弱的吸收带，且随溶剂极性增大而发生蓝移，就是羰基n*跃迁所产生R吸收带的有力证据。在184nm附近有强吸收带(E1带)，在204nm附近有中强吸收带(E2带)，在260nm附近有弱吸收带且有精细结构(B带)，是苯环的特征吸收，等等。可以从有关资料中查找某些基团的特征吸收带。2. 共轭体系的判断 共轭体系会产生很强的K吸收带，通过绘制吸收光谱，可以判断化合物是否存在共轭体系或
32、共轭的程度。如果一化合物在210nm以上无强吸收带，可以认为该化合物不存在共轭体系；若在215250nm区域有强吸收带，则该化合物可能有两至三个双键的共轭体系，如13丁二烯，为217nm，为21,000；若260350nm区域有很强的吸收带，则可能有三至五个双键的共轭体系，如癸五烯有五个共轭双键，为335nm，为118,000。3. 异构体的判断 包括顺反异构及互变异构两种情况的判断。 顺反异构体的判断生色团和助色团处在同一平面上时，才产生最大的共轭效应。由于反式异构体的空间位阻效应小，分子的平面性能较好，共轭效应强。因此，及都大于顺式异构体。例如，肉桂酸的顺、反式的吸收如下： 280nm =
33、13500 295nm =27000同一化学式的多环二烯，可能有两种异构体：一种是顺式异构体；另一种是异环二烯，是反式异构体。一般来说，异环二烯的吸收带强度总是比同环二烯来的大。互变异构体的判断某些有机化合物在溶液中可能有两种以上的互变异构体处于动态平衡中，这种异构体的互变过程常伴随有双键的移动及共轭体系的变化，因此也产生吸收光谱的变化。最常见的是某些含氧化合物的酮式与烯醇式异构体之间的互变。例如乙酰乙酸乙酯就是和烯醇式两种互变异构体：它们的吸收特性不同：酮式异构体在近紫外光区的为272nm(为16)，是n*跃迁所产生R吸收带。烯醇式异构体的为243nm(为16000)，是*跃迁出共轭体系的K
34、吸收带。两种异构体的互变平衡与溶剂有密切关系。在象水这样的极性溶剂中，由于 可能与H2O形成氢键而降低能量以达到稳定状态，所以酮式异构体占优势:而象乙烷这样的非极性溶剂中，由于形成分子内的氢键，且形成共轭体系，使能量降低以达到稳定状态，所以烯醇式异构体比率上升:此外，紫外可见分光光度法还可以判断某些化合物的构象(如取代基是平伏键还是直平键)及旋光异构体等。定量分析紫外可见分光光度法定量分析的方法常见到的有如下几种 ： 1. 单组分的定量分析如果在一个试样中只要测定一种组分，且在选定的测量波长下，试样中其它组分对该组分不干扰，这种单组分的定量分析较简单。一般有标准对照法和标准曲线法两种。标准对照
35、法在相同条件下，平行测定试样溶液和某一浓度Cs（应与试液浓度接近）的标准溶液的吸光度Ax和As则由Cs可计算试样溶液中被测物质的浓度Cx标准对照法因知使用单个标准，引起误差的偶然因素较多，故往往较不可靠。标准曲线法这是实际分析工作中最常用的一种方法。配制一系列不同浓度的标准溶液，以不含被测组分的空白溶液作参比，测定标准系列溶液的吸光度，绘制吸光度浓度曲线，称为校正曲线（也叫标准曲线或工作曲线）。在相同条件下测定试样溶液的吸光度，从校正曲线上找出与之对应的未知组分的浓度。此外，有时还可以采用标准加入法。2. 多组分的定量分析 根据吸光度具有加和性的特点，在同一试样中可以同时测定两个或两个以上组分
36、。假设要测定试样中的两个组分A、B，如果分别绘制A、B两纯物资的吸收光谱，绘出三种情况，如图13.20所示。 （a） 情况表明两组分互不干扰，可以用测定单组分的方法分别在1、2测定A、B两组分；（b）情况表明A组分对B组分的测定有干扰，而B组分对A组分的测定无干扰，则可以在1处单独测量A组分，求得A组分的浓度CA。然后在2处测量溶液的吸光度及A、B纯物质的和值，根据吸光度的加和性，即得则可以求出CB；（c）情况表明两组分彼此互相干扰，此时，在1、2处分别测定溶液的吸光度及，而且同时测定A、B纯物质的、及、。然后列出联立方程 解得CA、CB。显然，如果有n个组分的光谱互相干扰，就必须在n个波长处
37、分别测定吸光度的加和值，然后解n元一次方程以求出各组分的浓度。应该指出，这将是繁琐的数学处理，且n越多，结果的准确性越差。用计算机处理测定结果将使运算大为方便。3. 双波长分光光度法 当试样中两组分的吸收光谱较为严重时，用解联立方程的方法测定两组分的含量可能误差较大，这时可以用双波长分光光度法测定。它可以进行一组分在其它组分干扰下，测定该组分的含量，也可以同时测定两组分的含量。双波长分光光度法定量测定两混合物组分的主要方法有等吸收波长法和系数倍率法两种。等吸收波长法试样中含有A、B两组分，若要测定B组分，A组分有干扰，采用双波长法进行B组分测量时方法如下：为了要能消除A组分的吸收干扰，一般首先
38、选择待测组分B的最大吸收波长2为测量波长，然后用作图法选择参比波长1，作法如图所示。在2处作一波长轴的垂直线，交于组分B吸收曲线的另某一点，再从这点作一条平行于波长轴的直线，交于组分B吸收曲线的另一点，该点所对应的波成为参比波长1。可见组分A在2和1处是等吸收点，由吸光度的加和性可见，混合试样在2和1处的吸光度可表示为双波长分光光度计的输出信号为A，可见仪器的输出讯号A与干扰组分A无关，它只正比于待测组分B的浓度，即消除了B的干扰。系数倍率法当干扰组分A的吸收光谱曲线不呈峰状，仅是陡坡状时，不存在两个波长处的等吸收点时，如图所示。在这种 情况下，可采用系数倍率法测定B组分，并采用双波长分光光度
39、计来完成。选择两个波长1、2，分别测量A、B混合液的吸光度、，利用双波长分光光度计中差分函数放大器，把、分别放大k1、k2倍，获得、两波长处测得的差示信号S：调节放大器，选取和，使之满足得到系数倍率K为差示信号S与待测组分B的浓度CB成正比，与干扰组分A无关，即消除了A的干扰。4. 导数分光光度计法 采用不同的实验方法可以获得各种导数光谱曲线。不同的实验方法包括双波长法、电子微分法和数值微分法。 将对波长求导: 在整个波长范围内可控制在恒定值，则上式表明，第一，导数分光光度法的一阶导数信号与浓度成正比例，不需要通过对数转换为吸光度；第二，测定灵敏度决定于摩尔吸光系数在特定波长处的变化率 ，在吸
40、收曲线的拐点波长处最大，灵敏度最高。如图 所示。 对于二阶导数光谱：只有当一阶导数时，二阶导数信号才与浓度成正比例。测定波长选择在吸收峰处，其曲率最大，灵敏度就高。三阶导数光谱：当一阶导数时，三阶导数信号与浓度成比例，测定波长在曲率半径小的肩峰处最大，可获得高的灵敏度。 在一定条件下，导数信号与被测组分的浓度成比例。测量导数光谱曲线的峰值方法有基线法、峰谷法，如图13.24所示。 基线法又称切线法在相邻两峰的极大或极小处画一公切线，在由峰谷引一条平行于纵坐标的直线相交于a点，然后测量距离他t的大小的。峰谷法测量相邻两峰的极大和极小之间的距离p，这是较常用的方法。峰零法测量峰至基线的垂直距离z。
41、该法只适用与导数光谱曲线对称于横坐标的高阶导数光谱。导数分光光度法对吸收强度随波长的变化非常敏感，灵敏度高。对重叠谱带及平坦谱带的分辩率高，噪声低。导数分光光度法对痕量分析、稀土元素、药物、氨基酸、蛋白质的测定，以及废气或空气中污染气体的测定非常有用。6. 其它分析方法：简单介绍动力学分光光度法及胶束分光光度法动力学分光光度法 一般的分光光度法是在溶液中发生的化学反应达到平衡后测量吸光度，然后根据吸收定律算出待测物资的含量。而动力学分光光度法则是利用反应速率与反应物、产物或催化剂的浓度之间的定量关系，通过测量与反应速率成正比例关系的吸光度，从而计算待测物质的浓度。根据催化剂的存在与否，动力学分
42、光光度法可分为非催化和催化分光光度法。当利用酶这种特殊的催化剂时，则称为酶催化分光光度法。由反应速度方程式及吸收定律方程式可以推导出动力学分光光度法的基本关系为 A=KCc式中K为常数，Cc为催化剂的浓度。测定Cc的方法常有固定时间法、固定浓度法和斜率法三种。优点：灵敏度高，选择性好(有时是特效的)、应用范围广(快速、慢速反应，有副反应，高、低浓度均可)。 缺点：影响因素较多，测量条件不易控制，误差经常较大。胶束增容分光光度法 胶束强度分光光度法是利用表面活性剂的增强、增敏、增稳、褪色、析向等作用，以提高显色反应的灵敏度、对比度或选择性，改善显色反应条件，并在水向中直接进行光度测量的分光光度法
43、。表面活性剂(有阳离子型、阴离子型、非离子型之分)在水相中有生成胶体的倾向，随其浓度的增大，体系由真溶液转变为胶体溶液，形成极细小的胶束，体系的性质随之发生明显的变化。体系由真溶液转变为胶束溶液时，表面活性剂的浓度称为临界胶束浓度，常用cmc表示。由于形成胶束而使显色产物溶解度较大的现象，称为胶束增容效应。由于胶束与显色产物的相互作用，结合成胶束化合物，增大了显色分子的有效吸光截面，增强其吸光截面，增强其吸光能力，使增大，提高显色反应的灵敏度，称为胶束的增敏效应。胶束增容分光光度法比普通分光光度法的灵敏度由显著的提高，可达106(Lmol1cm)。近年来，这种方法得到很广泛的应用。这种方法得到很广泛的应用。
