1、1） 发酵的传统定义：酵母作用于果汁或发芽谷物，产生CO2的现象。 发酵的现代定义：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物 菌体或其代谢产物的过程。2） 发酵工程定义：利用微生物特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用 物质或直接应用于工业化生产的技术体系，是将传统发酵与 现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结 合并发展起来的发酵技术。（又称微生物工程，以微生物的生 命活动为基础）3） 微生物工业发酵的基本过程：4） 发酵工程与传统酿造、化学工程相比特点是：发酵是生物体自身进行的反应与传统酿造相比：1、发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备
2、中一次完成；2、反应通常在常温常压下进行，条件温和，耗能少，设备较简单；3、原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源，微生物本身能有选择地摄取所需的物质；4、容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应；5、发酵过程中需要防止杂菌污染，大多情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。与化学工程相比（发酵工程的一般特征）：1、作为生化反应，通常在常温常压下进行，因此没有爆炸之类的危险，各种设备都不必考虑防爆问题，还有可能使一种设备具有多种用途；2、原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，加入少量的各种
3、有机或无机氮源，只要不含毒物，一般无精制的必要，微生物本身就有选择地摄取所需物质；3、反应以生命体的自动调节方式进行，因此数十个反应过程能够像单一反应一样，在称为发酵罐的单一设备内很容易地进行；4、能够容易地生产复杂的高分子化合物，是发酵工业最有特色的领域；5、由于生命体特有的反应机制，能高度选择性地进行复杂化合物在特定部位的氧化、还原、官能团导入等反应；6、生产发酵产物的生物物质菌体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质。因此，除特殊情况外，发酵液等一般对生物体无害；7、发酵生产在操作上最需要注意的是防止杂菌污染8、通过微生物的菌种改良，能够利用原有生产设备使生产飞跃上升。5）
4、微生物发酵技术反应过程中的特点：1、 条件通常温和（常温、常压、弱酸、弱碱）。2、原料来源广泛，以糖、淀粉等碳水化合物为主。3、反应以生命体的自动调节方式进行，单一反应器内进行。4、发酵产品（多为小分子产品，也容易生产出复杂的高分子化合物）5、高度选择性地进行复杂化合物在特定部位的反应。6、生产发酵产物的微生物菌体本身也是发酵产物（发酵液一般对生物体无害）。7、防止污染（灭菌是发酵成败的关键）。8、改良微生物菌种（提高生产水平；菌种是发酵的根本因素）。6）微生物发酵技术发展历史过程及特点：1、自然发酵（天然发酵）：厌氧发酵、非纯培养、产物稳定性差（酒、醋、酱油）。2、纯培养技术建立：纯培养无菌
5、操作技术建立、密闭发酵罐、表层培养、显微镜诞生及微生物发现（甘油、丙酮、丁醇等初级代谢产物）。3、通气搅拌大规模发酵技术建立：好氧发酵、发现青霉素（次级代谢产物）。4、代谢控制发酵技术：生产谷氨酸，菌种经遗传育种、人工诱变等控制其代谢途径得到所需的代谢终产物（氨基酸、某些抗生素）。5、开拓发酵原料时期（石油发酵时期）：石化工副产品作为发酵原料、大型发酵罐、自动化、连续化（单细胞蛋白）。6、DNA体外重组技术的建立（基因工程阶段）：分子生物学、DNA重组、细胞融合（干扰素、激素）。7） 分批发酵：1、定义：(分批培养)是指将所有的物料（除空气、消沫剂、调节pH的酸碱物外）一次性加入发酵罐，然后灭
6、菌、接种、培养，最后将整个罐的内容物放出，进行产物回收。清罐结束后，重新开始新的装料发酵的发酵方式。 2、特点：非稳态培养过程、一次性投料一次性收获产品、封闭系 统、表现典型的生长周期（延滞期、对数生长期、稳定期、衰亡期）、稳定期细胞浓度最大。 3、优缺点：设备要求低、操作简单、易于掌握、适用于固体颗粒或较多泡沫的培养基灭菌、适用于小发酵罐中培养基的灭菌；不能使细胞始终处于最优条件、对培养基营养成分破坏较大，反复加热冷却使能耗增加、发酵周期延长、降低了发酵罐利用率。 补料发酵：1、定义：（半连续培养、半连续发酵）是指发酵中后期养料逐渐消耗，菌体逐渐走向衰老自溶，代谢产物不能再继续分泌，为延长中
7、期代谢活动，维持较高的发酵产物的增长幅度，给发酵罐间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。 2、特点：介于分批发酵和连续发酵之间的一种微生物细胞的培养方式。 3、优缺点：维持菌体浓度、减缓供氧矛盾、避免发酵过早结束。与分批培养方式比较： 可以解除培养过程中的底物抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖的分解阻遏效应。对于好氧过程，可以避免在分批培养过程中因一次性投糖过多造成的细胞大量生长、好氧过多以至通风搅拌设备不能匹配的状况。微生物细胞可以被控制在一系列的过滤态阶段，可用来控制细胞的质量；并可重复某个时期细胞培养的过渡态，可用于理论研究。与连续培养方式比较： 不需要严格的无菌条件。不会产生微生物菌种的老化
8、和变异。最终产物浓度较高，有利于产物的分离。适用范围广。 连续发酵：1、定义：（连续培养、开放式培养）是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养液，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵培养方式。 2、特点：微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可以达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。 3、优缺点：温度较高、灭菌时间短、培养基营养成分得到最大限度的保护 简化操作步骤、缩短发酵周期、提高设备利用率、降低了人力物力的消耗、降低劳动强度、增加生产效率；连续发酵运转时间长，菌种多退化、易污染，培养基利用
9、率一般低于分批发酵 工艺中的变量较分批发酵复杂，较难控制和扩大，且对蒸汽和设备要求较高 不适合含有大量固体物料培养基的灭菌，生产次生代谢产物时一般不用连续发酵，因为生产次生代谢产物所需的最佳条件，往往与其产生菌种生长所需的最佳条件不一致，有的还与微生物细胞分化有关。8）工业化菌种的要求、发酵菌种必须满足的条件、发酵工业用菌种应具备的特点：1、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，产量高；2、可以在易于控制的培养条件下（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）迅速生长和发酵，且所需的酶活力高；3、生长速度和反应速度较快，发酵周期短；4、根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷
10、型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株；5、选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染噬菌体；6、菌株纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性；7、菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素、毒素等），以保证安全。9）自然界分离微生物的一般操作步骤：1、微生物样品的采集。通常土壤中含细菌数量最多，细菌（108）、放线菌（107孢子数）、霉菌（106孢子数）、酵母菌（105）、藻类（104）、原生动物（103）。525cm深处微生物较多，15cm阳光杀菌、水分蒸发，25cm以下氧份递减。菜园、近郊：细菌、放线菌；森林（枯枝落叶、腐殖质）：霉菌、酵母菌、纤维素酶产生菌
11、；肉类加工厂、饭店：蛋白酶和脂肪酶产生菌；南方、温泉、火山、北方堆肥：高温酶产生菌；南北极、冰窖、深海：低温酶产生菌。2、 微生物样品的富集培养定义：（施加选择性压力分离法）利用不同种类的微生物生长繁殖对环境和营养的要求不同，人为控制条件（碳源、氮源、pH、温度、需氧等），使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势而得以快速分离纯化的目的。细菌、放线菌生长繁殖偏碱；霉菌、酵母菌偏酸。3、 目的菌种的分离。 4、 目的菌的筛选。筛选菌株的重要指标：菌的营养特征菌的生长温度菌对所采用的设备和生产过程的适应性菌的稳定性菌的产物得率和产物在培养液中的浓度容易从培
12、养液中回收产物（衡量菌种的生产性能）。5、未来的发展。10）土壤的基本特点：1、土壤的有机质含量、通风状况。2、土壤酸碱度、植被情况。3、季节（秋季为佳）。4、地域、地理条件（南方）。11）从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集培养？自然界中目的微生物含量很少，非目的微生物种类繁多，进行富集培养，使目微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，使筛选变得可能。12）菌种选育分子改造的目的？1、提高目标产物的产量。2、提高目标产物的纯度（减少杂质、副产物的生成，降低后期纯化成本）。3、防止菌种退化、改良菌种性状，改善发酵过程。4、改变生物合
13、成途径，以获得高产的新产品。13）什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义、应用价值？自然选育：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，选育出优良菌种的过程。利用自发突变引起的菌种性状变化的特点，可以较快地选育出优良菌种。自然选育可以有效地用于高性能突变株的分离。自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。14）自然筛选和菌种改良是两种获取优良的发酵菌种的途径。菌种改良：是指采用物理、化学、生物学方法处理目的微生物，使其遗传基因发生变化，将生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，使某些代谢产物过量积累，过的所需要的高产、优质、低耗的菌种。15） 种子的扩大培养：
14、就是将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。16）种子应满足的条件：1、菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短。2、生理性状稳定、遗传性状稳定。3、菌体总量及浓度能满足大量发酵罐的要求。4、无杂菌污染。5、保持稳定的生产能力。17）菌种退化：是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。18）如何防止菌种衰退？1、 合理育种。2、选用合适的培养基。3、创造良好的培养条件。4、控制传代次数。5、利用不同类型的细胞进行移种传代。6、采用有效的菌种保
15、藏方法。19）菌种：用于发酵过程作为活细胞催化剂的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。（来源于自然界大量的微生物，从中经分离并筛选出有用菌种。）种子：种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程，这些纯种培养物称为种子。 20） 革兰氏染色法：一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，革兰氏阳性菌都呈蓝紫色（芽孢杆菌、多数球菌、放线菌、真菌），革兰氏阴性菌都呈红色（无芽孢杆菌、少数球菌、弧菌）。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌
16、由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈蓝紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后呈无色，再经番红复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 21）种子扩大培养的目的与要求、一般步骤？1、目的：为发酵工业提供适宜微生物生长的特定的物理和化学环境，使其迅速大量繁殖，为生产提供相当数量的代谢旺盛的微生物菌种。2、种子的要求：菌种细胞的生
17、长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐要求；无杂菌污染；保持稳定的生长能力。3、一般步骤：休眠孢子母斜面活化摇瓶种子或茄子瓶斜面或固体培养基孢子一级种子罐二级种子罐发酵罐22）在大规模发酵的种子制备过程中，实验室阶段和生产车间阶段在培养基和培养物选择上各有何特点？实验室阶段培养物选择的原则：种子能扩培到一定的量和质，获得一定数量和质量的孢子、菌体。培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。生产车间阶段培养物的选
18、择原则：最终一般都是获得一定数量的菌丝体。培养基选择首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本、二是驯化。23）什么是接种量？对于细菌、放线菌及霉菌常用的接种量是多少？接种量：指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。细菌1%5%；酵母菌5%10%；霉菌7%15%、有时20%25%。24）什么是发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响发酵级数的因素有哪些？什么情况下可采用一级种子发酵？ 发酵级数：制备种子需逐级扩大培养的次数一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级
19、种子罐开始计算发酵级数发酵级数对发酵影响：1、种子级数少，可简化工艺和控制，减少染菌机会。 2、种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵 罐的生产率，增加染菌机会。 3、级数大难控制、易染菌易变异，管理困难，一般2-4级。 4、在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的 一个方面。影响发酵级数的因素：（1）菌种生长特性,孢子发芽及菌体繁殖速度；（2）发酵 规模；（3）工艺要求；（4）接种量的影响。酵母生长比细菌慢，比霉菌和放线菌快，通常用一级种子发酵。25）发酵级数确定的依据是什么？种子罐级数的确定主要取决的方面？1、菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度。2、所采用发酵罐的容积。26
20、）野生型菌株：从自然分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株的纯种。 营养缺陷型菌种：野生型菌株经过人工诱变或者自然突变失去合成某种营养（氨基酸，维生素，核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，成为营养缺陷型（营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的）。相应的野生型菌株称为原养型。原养型菌种：指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表现型上与野生型相同。27） 基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用来表示。完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株
21、营养需要的天然或半组合培养基。用来表示。补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。28）工业发酵常用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？碳源：糖类（淀粉、葡萄糖、蔗糖）、糖的衍生物（糖蜜）、脂类（动、植物油）、 有机酸（琥珀酸、柠檬酸、乳酸、乙酸）和低碳醇（甲醇、乙醇）、烃类、芳香 化合物及各种含碳化合物。葡萄糖：所有的微生物都能利用葡萄糖，但是会引起葡萄糖效应。糖蜜：是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖
22、蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。淀粉、糊精：缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶。 成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。 优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应。29） 生理性酸性物质：菌体代谢后能形成酸性物质的营养物（无机氮源）。生理性碱性物质：经微生物生理作用（代谢）后能产生碱性物质的营养物（无 机氮源）。30） 发酵营养基质的组成：碳源、氮源、无机盐及微量元素、水、生长因子、前体物质、产物促进剂和抑制剂。31） 生长因子：一类对微生物必不可少的物质，一般为一些小分子有机物，
23、需求 量很小（氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素等）。有机氮源是这 些生长因子的重要来源。32） 前体：一些添加到培养基中的物质，它们并不促进微生物的生长，但能直接 通过微生物的生物合成过程结合到产物分子上去，自身结构基本不 变，而产物产量却因此有较大的提高(前体使用时普遍采用流加的方法)。33） 产物促进剂：在发酵过程中添加的，既不是营养物又不是前体物质，但是 却能提高产量的物质。 产物抑制剂：主要是一些对生产菌代谢途径有某种调节能力的物质。34）什么是培养基？简述发酵培养基的特点和要求？培养基：利用人工方法配制的供微生物、植物和动物细胞生长繁殖或积累代谢产 物的各种营养物质的混合物。特点：
24、培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少，避免污染。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于取材、采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等，及时分离、减少“三废”。必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。有利于减少培养基原料单耗，提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。35）简述培养基设计
25、的一般步骤和应注意的问题。步骤：对培养基原料的选择、对培养基各种成分用量的选择以及对培养条件的选 择。1、根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步 确定可能的培养基成分；2、通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养 基成分；3、当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度， 由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。注意问题：1、营养基质的选择（营养基质种类、营养基质原材料的质量问题、 营养基质选择的经济性原则）。 2、培养基成分用量的确定（参照微 生物细胞内元素的比例确定、参照碳氮比确定、其他因素）。3、成分 选择（菌种的同化能力、代谢的阻遏和诱导、
26、合适的C/N比、pH的 要求)。36） 淀粉的性质：1、白色无定形结晶粉末，存在于很多植物组织中。无还原性、 无甜味、不溶于冷水、有机溶剂。 2、（C6H10O5）n 由很多葡萄糖分子通过-1,4-糖苷键和-1,6- 糖苷键连接而成的具有一定层次构造的化学大分子。含水 分多、含蛋白质少的颗粒较大，多呈圆形或椭圆形；反之 多呈较小的多角形。37）淀粉水解一般有几种工艺？各有何特点？（酸解法、酶解法、酸酶结合法）1、 酸解法：是淀粉水解糖制备的传统方法，它是以无机酸为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。 优点：工艺简单、水解时间短、设备生产能力大。 缺点：高温高压以及酸的腐蚀对设备有一定
27、的要求；副反应多，影 响水解糖液的质量；对原料要求严格，淀粉颗粒必须大小均 匀，否则水解不均一不彻底。2、 酶解法：（双酶水解法）是用专一性很强的-淀粉酶将原料淀粉水解为糊精和低聚糖（液化），再用糖化酶继续水解为葡萄糖的制糖工艺（糖化）。 优点：条件温和，设备要求低；酶专一性强，副反应少；淀粉液初 始浓度较高，对原料要求较低；糖液颜色浅，较纯净。 缺点：生产周期长，需要专门的设备（培养酶），过滤困难（酶是蛋 白质）。3、 酸酶法：是先将淀粉用酸水解成低聚糖和糊精，再用糖化酶将其水解成葡萄糖的工艺。 酶酸法：是先用-淀粉酶将原料淀粉水解到一定程度，过滤除去杂质后，再用酸完全水解的工艺。糖液质量：
28、酶解法（酸酶法酶酸法）酸解法糖液粘度：酸解法酸酶结合法酶解法水解时间：酶解法酸酶结合法酸解法38） 实验室常用灭菌方法：1、 化学灭菌：利用化学药品的氧化作用或损伤细胞作用于微生物而将其杀死的方法。 针对：环境、皮肤、器材等。2、 射线灭菌：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线穿透微生物细胞进行灭菌的方法。 针对：无菌室、接种箱等。3、 干热灭菌：利用热空气将为生物体内的蛋白质氧化的方法（160保温1h）。 针对：玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品。4、 湿热灭菌：利用饱和湿热蒸汽是微生物体内蛋白质变性进行灭菌的方法（1212030min）。 针对：培养基、发酵设备、附属设备、管道等
29、。 优点：蒸汽来源容易、成本低、本身无毒高温蒸汽穿透力强、加速蛋白 质变性和微生物死亡、灭菌彻底操作简单细胞内蛋白质含水量高、 易变性。（最常用、最有效的灭菌方法）5、 过滤除菌：利用过滤方法阻留微生物的方法。 针对：制备无菌空气。6、 火焰灭菌（灼烧灭菌）：（最简单的干热灭菌法）在火焰上灼烧的方法。 针对：接种针、刀、镊、玻璃棒、三角瓶等。39）培养基的灭菌方法：1、分批灭菌（间歇灭菌、实罐灭菌）：升温、保温、冷却。实消：分批灭菌，就是将配置好的培养基全部输入到发酵罐内或其他装置中，通过蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定的时间，再冷却至接种温度，这一过程称之为实罐灭菌。优点：无需
30、专门的灭菌设备，设备投资少；灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低灭菌温度低。缺点：时间长而对培养基成分破坏大；操作难于实现自动控制。2、连续灭菌（高温瞬时：使蛋白质变性；保护营养成分、灭菌）连消：连续灭菌，将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流灭菌后进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。优点：采用高温快速灭菌法；可以把培养基按其性质分开灭菌；有利于自动控制；节省冷却水。缺点：投资费用高；对物料要求高；蒸汽用量大。40） 影响培养基灭菌的因素：1、培养基成分（油脂、糖类、蛋白质会增加微生物的耐热性）2、培养基成分的颗粒度（颗粒越大、蒸汽穿透用时越长、灭菌难）3、培养基的pH（pH越低，灭菌所需时间越
31、短）4、微生物细胞含水量（含水量越少、蛋白质越不易变性、灭菌时间越长）5、微生物性质与数量（细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感，放线菌、霉菌孢子对热的抵抗力较强）6、冷空气排出情况7、泡沫（易形成隔热层、不易杀死其中潜伏的微生物）8、搅拌（使培养基均匀、不造成局部过热或灭菌死角）41）发酵使用空气净化标准是什么？“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降到零或极低，从而使污染的可能性将至极小。一般按10-3计算（1000次发酵周期所用的无菌空气只允许1次染菌）。合适的空气状态（温度、湿度），除去微生物颗粒、满足生物细胞培养需要。（南方、近地、工业城市较北方、远地、农村含菌量高）42
32、） 空气除菌、净化方法：【见38）】1、 热杀菌（有效可靠，对设备要求较高、消耗大量能源、成本高）2、 辐射杀菌：破坏蛋白质等活性物质（表面灭菌、有限空间内的空气灭菌）3、 静电除菌：利用静电引力吸附带电粒子达到除尘灭菌的目的（效率低、能耗少）4、 过滤除菌：通过过滤介质阻截微生物（制备无菌空气）43） 空气过滤除菌预处理的目的（标准）和工艺流程（步骤）：目的：1、提高压缩空气的洁净度，降低空气过滤器的负荷 2、去除压缩后空气中所带的油水，以合适的空气湿度和温度进入空气过 滤器。工艺流程：采风塔、粗过滤器（除尘）、空气压缩机、空气贮罐（稳压）、空气冷却器、气液分离器（除水除油）、空气加热器（增
33、加相对温度）、空气过滤器。44） 介质过滤除菌原理：当气流通过滤层时，基于滤层纤维的层层阻碍，迫使空气在流动过程中出现无数次改变气速大小和方向的绕流运动，从而使微生物颗粒与滤层纤维间产生惯性撞击截留、拦截截留、布朗扩散截留、重力沉降及静电引力等作用，将其中的尘埃和微生物截留在介质层内，达到过滤除菌的目的。45）消毒：是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。灭菌：是指把物体上所有的微生物（包括细菌芽孢在内）全部杀死的方法。（防腐：是指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。用于防腐的化学药物叫做防腐剂。无菌：不含活菌的意思，是灭菌的结果。防止微生物进入机体或物体的操作技术称为无菌操作。）46）
34、 营养基质（底物）：是指供微生物生长及产物合成的原料，主要包括碳源、氮源、无机盐、微量元素和生长调节物质等。47） 发酵热：发酵过程中产生的净热量，是引发发酵过程中温度变化的原因。发酵热=生物热+搅拌热-蒸发热辐射热48） 温度对发酵的影响：1、最适温度范围内，生长速度随温度升高而增加，缩短微生物生长周期。2、最适温度下可缩短生长缓慢期和孢子萌发时间。3、较低温度，氧溶解度大、通气量充足、生长速率相对较低。4、生长延迟期主要取决于温度，生长后期主要取决于溶解氧。温度控制：1、根据菌种及生长阶段选择。（在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生
35、长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。发酵后期，产物合成能力降低，又提高温度，刺激产物合成到放罐。） 2、根据培养条件选择。（通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。） 3、根据菌生长情况。（菌生长快，维持在较高温度时间要短些）49）pH对发酵过程的影响：1、是微生物细胞原生质膜的电荷发生改变。2、直接影响酶的活性。3、直接影响代谢过程（菌体代谢方向、代谢产物合成）。影响pH的因素：1、基质代谢。2、产物形成。3、菌体自溶，pH上
36、升，发酵后期，pH上升。导致pH下降的因素：C/N过高；溶氧不足；消泡剂过量、脂肪酸增加；生 理酸性物质存在。导致pH上升的因素：C/N过低；生理碱性物质存在。（pH上升是补料标志）50） 搅拌的作用：1、搅拌能把大的空气泡打碎成为微小气泡（小气泡的上升速度要比大气泡慢）。2、搅拌使液体作涡流运动。3、搅拌使菌体分散，避免结团。51）临界氧浓度（C临）：指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。（微生物的临界氧浓度一般0.0030.05mmol/L） 溶氧浓度（DO）：氧在水中的饱和浓度（C*）。发酵液氧浓度：CL供氧系数（氧传质系数）：KL（与空气线速度的次
37、方成正比）dC/dT=KL（C*-CL）溶氧控制（提高）：1、搅拌。2、降温。3、改善发酵液浓度提高传质。4、培养基。5、气体组成成分。（发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降；发酵中后期：溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等；发酵后期：由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升 。）52） 泡沫产生规律：1、通气量越大，搅拌越剧烈，则产生的泡沫越多。2、培养基中蛋白质含量越多，发酵液的粘度、浓度越大，则生成的泡沫稳定性就越高。3、菌体旺盛生长时，产生的泡沫多，当发酵液中营养基质被菌体大量
38、消耗时，浓度下降，则气泡的稳定性也减弱，在发酵后期，伴随菌体的自溶，使发酵液中蛋白质浓度又上升，则发酵液的起泡性又增强。泡沫对发酵的不利影响：减少发酵的有效容积，通过排气管溢出，造成发酵液流失。可能从罐顶的轴封渗出罐外，增加了染菌的机会。使部分菌体粘附在罐盖或罐壁上，而失去作用。影响通气搅拌的正常进行，妨碍代谢气的排出，对菌体呼吸造成影响，甚至使菌体代谢异常，影响生产率。发酵过程泡沫控制的方法：选择消泡剂的依据：表面活性剂，具有较低的表面张力，消泡效果明显。对气-液界面的散布系数必须足够大，才能迅速消泡,与起泡液有一定程度的亲和性。无毒害性，对人、畜无害，不被微生物同化，对菌体生长和代谢无影响
39、，不影响产物的提取和产品质量。 不干扰各种测量仪表的使用；不干扰溶解氧、pH等测定仪表使用，最好不影响氧的传递。在水中的溶解度较小，以保持持久的消泡性能。来源方便，使用成本低。消泡剂的种类、性能和应用范围：天然油脂：玉米油、米糠油、豆油、棉子油、鱼油及猪油等（豆油是红霉素的前体，鱼油是螺旋霉素的前体）聚醚类：聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油(又称泡敌)。（用于四环素发酵效果很好，相当于豆油的1020倍）高碳醇、脂肪酸和酯类：如十八醇、聚二醇 （在水体系里是有效的消泡剂）硅酮类（聚硅油类） ：最常用的是聚二甲基硅氧烷，也称二甲基硅油。聚二甲基硅氧烷及其衍生物 ：适用于放线菌和细菌发酵 （单独使用
40、效果差，常与分散剂（微晶二氧化硅）一起使用）羟基聚二甲基硅氧烷 ：曾用于青霉素和土霉素发酵氟化烷烃：具有极其小的表面能53） 发酵异常原因：1、种子培养异常菌种生长缓慢菌丝结团代谢不正常 2、发酵异常： 菌体生长差pH异常溶氧水平异常 泡沫过多菌体浓度过高或过低.染菌隐患的检查：1、显微镜检查法（革兰氏染色）2、平板划线培养或斜面培养检查法。3、肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4）。4、发酵过程异常现象观察法。杂菌污染的途径：1、种子带菌。2、空气带菌。3、设备的渗漏或“死角”。4、原材料灭菌不彻底。5、人为操作不当。6、噬菌体污染。染菌的预防措施：1、强化空气净化过程。2、严格培养原料及设备的灭菌。3、定期检测发酵设备及管道。4、严格培养物的移接。5、预防噬菌体危害。55） 噬菌体污染途径、危害、预防：途径：环境污染、设备的渗漏或死角、空气系统、培养基灭菌过程、补料、取样 及其他人为操作等。繁殖：噬菌体吸附到寄主细胞上。噬菌体的头部核酸通过尾管注入到寄主细 胞中。以寄主细胞内物质为原料，复制合成噬菌体自身的部件。完成 组装。分泌酶水解细胞壁使细胞破裂。危害：反复连续感染、短时间内菌体自溶、分泌酶水解菌体细胞壁。预防：1、定期检查并采取有效措施消灭噬菌体。2、检查生产系统，消除各种 不安全因素。3、选育抗噬菌体菌株和轮换使用生产菌株。
