1、专题五 课题3血红蛋白的提取和分离一、基础知识（一）血红蛋白提取与分离的依据1. 2. 3. 4. 5. （二）原理1凝胶色谱法凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。具体过程：凝胶颗粒相对分子质量较小的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板A 的蛋白质
2、由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。B（1） 混合物上柱；（2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；（3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。（4） 不同的蛋白质分子完全分开；（5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。2缓冲溶液缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是 ，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：在血红蛋白
3、整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？3电泳（1）概念：电泳是指 。（2）原理：许多重要的生物大分子，如 等都具有 ， 在 下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 、 的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。两种常用的电泳方法是 和 ，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。4蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？5样品处理血液由 和 组成，其中红细胞最多。红细胞
4、具有 的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质 ，其作用是 ，血红蛋白有 个肽链组成，包括 ，其中每条肽链环绕一个 ，磁基团可携带 。血红蛋白因含有 呈现红色。红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透明液体，这是 ，第4层是其他杂质的暗红色
5、沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的 。6凝胶色谱操作第一步要制作 ，第二步要 ，因为 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有 存在。因为气泡会 ，降低分离效果。第三步是 。用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快二、实验操作1样品
6、处理 （1）红细胞的洗涤目的：去除 方法： ，离心速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下（ 的红细胞液体倒入 再加入用 质量分数为09的氯化钠溶液洗涤。低速离心（低速短时间）重复4、5步骤 次，直至上清液中已没有 ，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。（2）血红蛋白的释放加 到 体积，再加40体积的 ，置于 上充分搅拌10分钟加速细胞破裂, 细胞破裂释放出血红蛋白（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:第1层（最上层）： 甲苯
7、层第2层（中上层）： 的沉淀层， 色薄层固体第3层（中下层）： 的水溶液层， 的液体第4层（最下层）：其它杂质 的沉淀层（4）透析2凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作2）凝胶色谱柱填料的处理（1）凝胶的选择： 。（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配成 。（3）凝胶色谱柱的装填方法 固定：将色谱柱处置固定在支架上装填：将 一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在（ ）高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为70）充分 12小时。3）样品加入与洗脱（1）加样前：打开下端出口
8、，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口。（2）加透析样品调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用 将1ml 的样品加到色谱柱的 样品渗入凝胶床： 洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱收集：待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 收集一试管连续收集思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即 ；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的 ；
9、最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 。3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（ ）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度三 实验结果分析与评价观察血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数 、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使 和 一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带 ，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。四、练一练1、2019年1月10日，施一公教授研究
10、团队在科学上报道了人源-分泌酶结合淀粉样前体蛋白（APP）的高分辨率冷冻电镜结构，揭示了结合底物后-分泌酶发生的构象变化，并对这些构象变化的功能进行了生化研究，从而为研究与癌症以及阿尔兹海默症相关的特异性药物设计提供了重要的结构信息。回答下列问题：（1）该项研究进行时，需控制温度、酸碱度等条件，因为高温、过酸、过碱会使-分泌酶的_遭到破坏，失去活性。（2）根据蛋白质的各种特性，如蛋白质分子的_、所带电荷的_、以及溶解度、吸附性、对其他分子亲和力等，可用来分离不同种类蛋白质，从而得到-分泌酶。（3）-分泌酶由4个跨膜蛋白亚基组成，分别为PS1、Pen-2、Aph-1和Nicastrin。若对-分
11、泌酶4个跨膜蛋白亚基进行分离、纯化及分子量测定，需采用_及电泳技术。前者是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，相对分子质量较_（填“大”或“小”）的跨膜蛋白移动速度较慢。（4）电泳是指_在电场的作用下发生迁移的过程。对-分泌酶的4个跨膜蛋白亚基进行分子量测定时，通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，该方法测定的结果只是_ _的分子量。该电泳迁移率完全取决于相对分子量的大小，原因是_。2、血红蛋白的提取与分离：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加入蒸馏水和甲苯，其中加入甲苯的目的是_ _。利用凝胶色谱法分离蛋白质，常选用血红蛋白为材料，其原因是_，该方法的基本原理是根据_ （蛋白质特性）而
12、达到蛋白质分离，蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、_ _、 、 。下图1是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是_。如果红色区带_，说明色谱柱制作成功。 一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如下图所示。由图可知携带者有2种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是_3、请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答下列问题：（1）将实验流程按先后顺序补充完整：_、_。（2）凝胶色谱法的基本原理是根据_分离蛋白质。（3）洗涤红细胞的目的是去除_ _，洗涤干净的标志是_。为防止血液凝固，在采血容器中通常要预先加入_。（4）凝胶色谱
13、操作结束后，需要用电泳来对蛋白质进行纯度鉴定，电泳利用了待分离样品中各种分子的 _的特性，使带电分子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的分离。（5）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质-SDS复合物，由于SDS ，从而使电泳的迁移率完全取决于分子的大小。42019年1月，施一公教授的研究团队在科学上报道了人源-分泌酶底物淀粉样前体蛋白的冷冻电镜结构，为研制阿尔兹海默症（AD）的治疗药物提供了重要的结构信息。临床发现，AD病人的脑组织中出现淀粉样斑块，它是由淀粉样前体蛋白被某些酶切割产生的短肽聚集而成，其中最关键的酶是-分泌酶，该酶由4条不同的肽链组成，编码其中某肽
14、链的基因所发生的突变与AD相关。请回答：（1）根据酶的专一性可知，-分泌酶是一种_（填“蛋白酶” 或“淀粉酶”），其基本组成单位是_。（2）若要分离-分泌酶，需考虑蛋白质的_、所带电荷的_ 、以及溶解度、吸附性、对其他分子亲和力等。_法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。在该方法中，相对分子质量较_（填 “大”或“小”）的蛋白质移动速度较慢。（3）通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量，但此方法不能直接测得-分泌酶的分子量，原因是_。5血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题：（1）将实验流程补充完整：A为_，B为_。（2）洗涤红细胞的目的是去除_，达到该目的的关键是控制离心的_。离心速度过高和时间过长会使_一同沉淀，达不到分离的效果。释放血红蛋白的过程中起作用的是_。（3）将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的原理是： 。（4）凝胶色谱法是根据_而达到蛋白质分离的有效方法。（5）在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，是因为气泡会_，降低分离效果。（6）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）的目的是 。（7）分离纯化好的血红蛋白，需要进行纯度鉴定，在鉴定方法中，使用最多的是 。
