1、第九章第九章 细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病 第一节第一节 概述概述第二节第二节 细胞凋亡的影响因素及发生机制细胞凋亡的影响因素及发生机制第三节第三节 细胞凋亡过程与调控细胞凋亡过程与调控第四节第四节 细胞凋亡的常用检测方法简介细胞凋亡的常用检测方法简介第五节第五节 细胞凋亡调控异常与疾病细胞凋亡调控异常与疾病 男婴，男婴，头位剖宫产出生头位剖宫产出生2 2天天,体重体重3kg.3kg.产前诊断产前诊断:胎儿宫内窘迫胎儿宫内窘迫,脐带绕颈脐带绕颈,羊水过少羊水过少.产后诊断缺血缺产后诊断缺血缺氧性脑病氧性脑病,羊水污染羊水污染度。生后牛奶喂养度。生后牛奶喂养,第第2 2天白天天白天哭吵哭吵,哭声
2、大哭声大,面色红面色红,心肺听诊无异常心肺听诊无异常.晚上晚上9:009:00入睡入睡,凌晨凌晨3:003:00发现患儿死亡发现患儿死亡.家属要求解剖查明死因家属要求解剖查明死因.结果结果:显微镜下显微镜下可见大脑轻度水肿。可见大脑轻度水肿。原位末端标记法检测原位末端标记法检测发现大脑海马回发现大脑海马回细胞凋亡阳性率细胞凋亡阳性率为为55%,55%,主要分布在低主要分布在低氧敏感区；大脑脑干细胞凋亡阳性率为氧敏感区；大脑脑干细胞凋亡阳性率为96%96%，主要分，主要分布在与面部感觉、头部位置相关的背侧核区。布在与面部感觉、头部位置相关的背侧核区。结论：结论：宫内窘迫、脐带绕颈导致反复缺氧、羊
3、水污染等宫内窘迫、脐带绕颈导致反复缺氧、羊水污染等导致导致大量细胞凋亡大量细胞凋亡，大脑关键区域（如脑干）功能丧，大脑关键区域（如脑干）功能丧失致死。失致死。思考：思考：1.1.该患儿猝死的原因和机制是什么该患儿猝死的原因和机制是什么?2.2.为什么其大脑细胞会发生凋亡为什么其大脑细胞会发生凋亡?Clinical example细胞凋亡名称的由来英国英国AberdeenAberdeen大学病理系大学病理系 KerrKerr教授教授19721972年我和年我和WyllieWyllie在研究中在研究中观察到一种不同观察到一种不同于坏死的细胞死于坏死的细胞死亡方式，联想到亡方式，联想到秋日落叶，我们
4、秋日落叶，我们 就把它称作就把它称作Apoptosis20022002年年1010月月7 7日英国人悉尼日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯布雷诺尔、美国人罗伯特特霍维茨和英国人约翰霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在细胞程序苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理与医学奖。性死亡方面的研究获诺贝尔生理与医学奖。Sydney BrennerH.Robert HorvitzJohn E.Sulston 细胞凋亡的意义细胞凋亡的意义 生理意义生理意义 清除多余的、失去功能价值的细胞清除多余的、失去功能价值的细胞 确保器官、组织的正常生长、发育确保器官、组织的正常生长、发育 清除受损、衰老和突变的
5、细胞清除受损、衰老和突变的细胞 维持内环境的稳定维持内环境的稳定 清除受染细胞，发挥防御作用清除受染细胞，发挥防御作用病理意义病理意义 该死的细胞不死（凋亡不足）该死的细胞不死（凋亡不足）不该死的细胞死亡（凋亡过度）不该死的细胞死亡（凋亡过度）调控细胞凋亡过程是防病治病的新途径调控细胞凋亡过程是防病治病的新途径确保正常生长发育 例如：人胚胎肢芽发育过程中的指例如：人胚胎肢芽发育过程中的指（趾）间组织通过细胞凋亡机制而（趾）间组织通过细胞凋亡机制而被逐渐消除，形成指（趾）间隙。被逐渐消除，形成指（趾）间隙。细胞凋亡与坏死的区别细胞凋亡与坏死的区别 凋亡凋亡 坏死坏死诱导因素诱导因素 生理性、病理
6、性生理性、病理性 病理性损伤病理性损伤(低氧，毒素等低氧，毒素等)基因调控基因调控 有，主动过程有，主动过程 无，被动过程无，被动过程 病变范围病变范围 发生于单个细胞发生于单个细胞 一般发生于多数细胞一般发生于多数细胞细胞形态细胞形态 细胞皱缩，核固缩，细胞皱缩，核固缩，细胞肿胀，细胞肿胀，胞膜及细胞器相对完整胞膜及细胞器相对完整 胞膜及细胞结构破坏胞膜及细胞结构破坏 凋亡小体凋亡小体 有有 无无 炎症反应炎症反应 缺乏缺乏 存在存在 生化特点生化特点 有新蛋白质合成，耗能有新蛋白质合成，耗能 无新蛋白质合成，不耗能无新蛋白质合成，不耗能 DNADNA分解分解 DNADNA片段化片段化(18
7、0-200bp)(180-200bp)，弥漫性降解，弥漫性降解，电泳呈电泳呈“梯梯”状条带状条带 电泳呈均一电泳呈均一DNADNA片段片段 凋亡细胞(扫描电镜)凋亡细胞(透射电镜)形态学改变形态学改变细胞凋亡与坏死的形态变化 第二节第二节 细胞凋亡的细胞凋亡的 影响因素及发生机制影响因素及发生机制一、常见诱导或抑制凋亡的因素一、常见诱导或抑制凋亡的因素1.1.生理性凋亡信号：生理性凋亡信号：激素和生长因子失衡激素和生长因子失衡缺乏或过多缺乏或过多2.2.病理性凋亡信号：病理性凋亡信号：氧化应激的作用氧化应激的作用 死亡受体的激活死亡受体的激活 线粒体结构和功能的改变线粒体结构和功能的改变生物性
8、生物性理化性理化性免疫性免疫性二、细胞凋亡的发生机制二、细胞凋亡的发生机制(一一)氧化损伤氧化损伤-形成氧化应激状态形成氧化应激状态 1 1、氧化损伤诱导细胞凋亡的依据：、氧化损伤诱导细胞凋亡的依据：各种氧化剂（如各种氧化剂（如H2O2H2O2）可直接诱导细胞凋亡；）可直接诱导细胞凋亡；抑制超氧化物歧化酶（抑制超氧化物歧化酶（supexoxide dismutase,SODsupexoxide dismutase,SOD）活性）活性可诱导细胞凋亡；可诱导细胞凋亡；抗氧化剂（抗氧化剂（VitEVitE、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素（各种凋
9、亡诱导因素（TNFTNF、电离辐射）引起的细胞凋亡。、电离辐射）引起的细胞凋亡。2 2、氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：、氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：引起引起DNADNA损伤，激活损伤，激活P53P53基因；基因；引起引起DNADNA损伤，活化多聚损伤，活化多聚ADPADP核糖合成酶，耗竭核糖合成酶，耗竭NADNAD，消耗，消耗大量大量ATPATP；攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化；攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化；激活激活Ca2+/Mg2+Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶；依赖的核酸内切酶；细胞膜损伤，细胞膜损伤，Ca2+Ca2+内流增多；内流增多；损伤线粒体，使其膜通透性增加，膜
10、电位发生改变；损伤线粒体，使其膜通透性增加，膜电位发生改变；活化核转录因子活化核转录因子NF-BNF-B、AP-1AP-1，加速凋亡相关基因表达。，加速凋亡相关基因表达。（二）钙稳态失衡（二）钙稳态失衡 1 1、细胞钙稳态失衡诱导细胞凋亡的依据：、细胞钙稳态失衡诱导细胞凋亡的依据：各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程；各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程；凋亡发生时胞浆凋亡发生时胞浆Ca2+Ca2+浓度显著上升，并在随后的一系列凋浓度显著上升，并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶、需钙蛋白酶、磷脂亡改变中起关键性作用（核酸内切酶、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的
11、空泡化）；酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）；钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（如神经退行性钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（如神经退行性疾病）。疾病）。2 2、钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：、钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：激活激活Ca2+/Mg2+Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解依赖的核酸内切酶，降解DNADNA链；链；激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；于凋亡小体形成；激活核转录因
12、子，加速凋亡相关基因表达；激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达；Ca2+Ca2+在在ATPATP的配合下使的配合下使DNADNA链舒展，暴露核小体之间的连接链舒展，暴露核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于核酸内切酶切割区内的酶切位点，有利于核酸内切酶切割DNADNA。（三）线粒体损伤（三）线粒体损伤 细胞凋亡期间线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨膜电细胞凋亡期间线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨膜电位（位（m）下降，能量代谢水平显著降低。）下降，能量代谢水平显著降低。1、依据为：、依据为：抑制线粒体三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡；抑制线粒体三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡；胞核出现
13、凋亡改变之前，常先有线粒体胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体m下降；下降；阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡。阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡。2、可能机制：、可能机制：线粒体内、外膜之间的通透性转换孔（线粒体内、外膜之间的通透性转换孔（PTP）具有调节）具有调节线粒体膜通透性的作用。正常情况下，绝大多数线粒体膜通透性的作用。正常情况下，绝大多数PTP处于关处于关闭状态。当线粒体跨膜电位在各种凋亡诱导因素作用下降低闭状态。当线粒体跨膜电位在各种凋亡诱导因素作用下降低时，时，PTP开放，导致线粒体膜通透性增大，使开放，导致线粒体膜通透性增大，使 细胞凋亡启动因子细胞色素细胞凋亡启动因子
14、细胞色素C 凋亡蛋白激活因子（凋亡蛋白激活因子（Apaf-1）凋亡诱导因子（凋亡诱导因子（apoptosis-inducing,AIF）等从线粒体内释放出来。等从线粒体内释放出来。细胞色素细胞色素C与与 Apaf-1相互作用可相互作用可激活激活caspase-9；而；而AIF可快速激活核酸内切酶，并增强可快速激活核酸内切酶，并增强caspase-3的水解活性。的水解活性。一、一、细胞凋亡的过程细胞凋亡的过程 1信号转导信号转导 2基因激活基因激活 3凋亡执行凋亡执行 4凋亡清除凋亡清除破坏生命破坏生命全部指令全部指令胞结构胞结构全部解体全部解体凋凋亡亡诱诱导导因因素素受受体体死死亡亡信信号号凋
15、亡凋亡相关相关基因基因激活激活凋亡细胞凋亡细胞被吞噬被吞噬 cAMPCa2神经酰胺神经酰胺DNase激活激活Caspases激活激活+第三节第三节 细胞凋亡过程与调控细胞凋亡过程与调控二、细胞凋亡的信号转导途径二、细胞凋亡的信号转导途径（一）参与细胞凋亡的第二信使系统（一）参与细胞凋亡的第二信使系统1.1.胞内胞内Ca2+Ca2+信号系统信号系统:依据有：细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升；用Ca2+载体A23187，升高BCCa2+水平，BC凋亡；用Ca2+络合剂降低细胞内Ca2+水平，可阻止凋亡。2.cAMP/PKA2.cAMP/PKA信号系统：信号系统：依据有：双丁酰cAMP可引起培
16、养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡；糖皮质激素使cAMP上升。3.3.神经酰胺信号系统：神经酰胺信号系统：神经酰胺（ceramide,CM）是神经鞘磷脂在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类转导细胞外应激信号的第二信使物质。4.4.二酰甘油二酰甘油/蛋白激酶蛋白激酶C C信号系统信号系统：二酰甘油是磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催化下产生的一种第二信使物质。二酰甘油是PKC内源性激活物。（二）细胞凋亡的信号通路（二）细胞凋亡的信号通路（1 1）死亡信号通路：）死亡信号通路：死亡配体（如死亡配体（如TNF-aTNF-a、FasL/CD95LFasL/CD95L、TWEAKTWEAK和和TRAILTRA
17、IL）与膜）与膜上相应的死亡受体上相应的死亡受体(TNFR(TNFR、FasFasCD95CD95、DR3DR3、DR4DR4DRS)DRS)结结合传递信号，胞内合传递信号，胞内caspase-2caspase-2、-8-8、-10-10被募集并激活。活被募集并激活。活化的化的caspase-8caspase-8释放到胞质中启动释放到胞质中启动caspasecaspase的级联反应的级联反应，激，激活下游的效应活下游的效应caspasescaspases，如，如caspase-3caspase-3，-6-6和和-7-7，导致细，导致细胞凋亡。胞凋亡。（2 2）交叉通路：）交叉通路：激活的激活的
18、caspase-8caspase-8同时能使胞质中同时能使胞质中bcl-2bcl-2家族的促凋亡因子家族的促凋亡因子BidBid（banding interface databasebanding interface database）断裂成一种截短的）断裂成一种截短的BidBid（truncated Bid,tBidtruncated Bid,tBid），），tBidtBid转移到线粒体上，诱转移到线粒体上，诱导细胞色素导细胞色素C C从线粒体释放进人胞质，从而把从线粒体释放进人胞质，从而把死亡受体通死亡受体通路和线粒体通路联系路和线粒体通路联系起来，有效地扩大了凋亡信号。起来，有效地扩大了
19、凋亡信号。（3 3）线粒体通路：）线粒体通路：FasFas 细胞表面受体（跨膜蛋白）；细胞表面受体（跨膜蛋白）；存在于多种组织细胞内；存在于多种组织细胞内；天然表达或转染表达的天然表达或转染表达的FasFas基因有促凋亡作用；基因有促凋亡作用；FasFas抗体模拟天然配基与受体抗体模拟天然配基与受体FasFas抗原结合激活凋亡信号转导抗原结合激活凋亡信号转导致细胞凋亡致细胞凋亡FasL 病毒感染的靶细胞病毒感染的靶细胞c-FLIP:cellular Fas-associated death domain-like IL-1 beta-converting enzyme inhibitory p
20、rotein三、细胞凋亡的调控因子三、细胞凋亡的调控因子（一）（一）Caspases酶系酶系 属于半胱氨酸蛋白酶家族，属于半胱氨酸蛋白酶家族，CaspaseCaspase 1-14 1-14个成员。根据其生个成员。根据其生物学功能，可划分为物学功能，可划分为ICEICE和和Ced-3Ced-3两个亚家族，两个亚家族，ICEICE亚家族：亚家族：caspase-1caspase-1，4 4，5 5，主要辅助炎症反应；，主要辅助炎症反应；ced-3ced-3亚家族：亚家族：caspase-2caspase-2，3 3，6 6，7 7，8 8，9 9，1010，则主要参与凋亡过程。则主要参与凋亡过程
21、。caspasescaspases在凋亡中的作用可以分为，在凋亡中的作用可以分为，启动型（启动型（caspase-2caspase-2，8 8，1010，9 9）效应型（效应型（caspase-3caspase-3，6 6，7 7）。）。它们参与凋亡的机制主要是：它们参与凋亡的机制主要是：灭活凋亡抑制蛋白。灭活凋亡抑制蛋白。以结构蛋白为靶子，导致结构蛋白解体。以结构蛋白为靶子，导致结构蛋白解体。以效应蛋白为靶子，调节或解体效应结构域。以效应蛋白为靶子，调节或解体效应结构域。降解细胞基因组降解细胞基因组DNADNACasepase-8Casepase-8FasTRADDTNFR1细胞凋亡细胞凋亡
22、CasepaseCasepase级联反应级联反应FADD活化的活化的Casepase-8Casepase-8FADD(二二)Bcl-2)Bcl-2家族家族Bcl-2是是B细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤/白血病白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2）基因）基因的缩写形式。的缩写形式。Bcl-2家族的成员是生存和死亡信号至关重要的整合因子。该家族可细分家族的成员是生存和死亡信号至关重要的整合因子。该家族可细分为三大类：为三大类：抗凋亡成员，如抗凋亡成员，如Bcl-2和和Bcl-XL 促凋亡成员，如促凋亡成员，如Bax和和Bak BH3-only 死亡蛋白死亡蛋白 Bcl-2是第一个
23、被确认具有抑制细胞凋亡作用的基因。是第一个被确认具有抑制细胞凋亡作用的基因。主要分布在线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜等处；主要分布在线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜等处；Bcl-2高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡；高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡；Bcl-2抗凋亡作用机制为：抗凋亡作用机制为：直接的抗氧化作用；直接的抗氧化作用；抑制线粒体释放促凋亡蛋白质；抑制线粒体释放促凋亡蛋白质；抑制促凋亡性调节蛋白质抑制促凋亡性调节蛋白质Bax、Bak的细胞毒作用；的细胞毒作用；抑制凋亡蛋白酶（抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活；）的激活；维持细胞钙稳态。维持细胞钙
24、稳态。BaxBax Bax Bax超表达超表达线粒体膜形成多聚体线粒体膜形成多聚体影响线粒体完整性；影响线粒体完整性；BaxBax形成同源二聚体形成同源二聚体 抑制抑制Bcl-2Bcl-2诱导凋亡；诱导凋亡；BaxBax与与Bcl-2Bcl-2形成异源二聚体形成异源二聚体促进细胞生长；促进细胞生长；胞内胞内BaxBax与与Bcl-2Bcl-2蛋白比例变动蛋白比例变动调控凋亡的发生。调控凋亡的发生。（三）（三）p53p53 P53基因有野生型（基因有野生型（wtp53）和突变型（）和突变型（mtp53）。）。野生型野生型P53基因编码的基因编码的P53蛋白是一种蛋白是一种DNA结合蛋白，结合蛋白
25、，P53蛋白在细胞周期蛋白在细胞周期G1期发挥检查点的功能：期发挥检查点的功能：（1）检查染色体）检查染色体DNA的损伤，一旦发现有缺陷的损伤，一旦发现有缺陷DNA，它通过剌激它通过剌激CDI的表达，阻止细胞进入下一周期，启的表达，阻止细胞进入下一周期，启 动动DNA修复机制；修复机制；（2）如修复失败，）如修复失败，P53则启动细胞凋亡机制，诱导细胞则启动细胞凋亡机制，诱导细胞 凋亡。凋亡。P53突变型则具有癌基因的作用，可以诱导细胞发生恶突变型则具有癌基因的作用，可以诱导细胞发生恶 性转化。性转化。（四）（四）IAPs凋亡抑制蛋白家族（凋亡抑制蛋白家族（Inhibitor of Apopt
26、osis protein，IAP）是近年发）是近年发现的一类抑制细胞凋亡的蛋白因子现的一类抑制细胞凋亡的蛋白因子目前已经得以证实的目前已经得以证实的IAP有两种，一种是有两种，一种是Cp-IAP，另一种是，另一种是Op-IAP。人类的人类的IAP可以与可以与caspases直接作用抑制其功能，直接作用抑制其功能，泛素化水解泛素化水解procaspase或活化形式的或活化形式的caspase，通过结合通过结合JNK1调节因子调节因子TAK1激活激活JNK1和和NF-B，发挥非，发挥非caspase依赖的凋亡抑制作用。依赖的凋亡抑制作用。目前，在肿瘤领域，研究最广泛的目前，在肿瘤领域，研究最广泛的
27、IAP家族成员之一是家族成员之一是Survivin。它具。它具有高度的组织表达特异性：在正常成人组织几乎不存在，但在几乎所有高度的组织表达特异性：在正常成人组织几乎不存在，但在几乎所有恶性肿瘤（如肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌等）有恶性肿瘤（如肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌等）中都有中都有Survivin的高表达。大量资料表明，抑制的高表达。大量资料表明，抑制Survivin的表达可以的表达可以明显增加放疗、化疗诱导的肿瘤细胞凋亡。明显增加放疗、化疗诱导的肿瘤细胞凋亡。（五）（五）c-myc c-myc是一种双向调节的癌基因是一种双向调节的癌基因，激活介导细胞增殖基因激
28、活介导细胞增殖基因 激活介导细胞凋亡基因激活介导细胞凋亡基因 无足够的生长因子持续作用则细胞发无足够的生长因子持续作用则细胞发生凋亡生凋亡 有足够的生长因子持续作用则细胞发有足够的生长因子持续作用则细胞发生增殖生增殖第四节第四节 凋亡的常用检测方法简介凋亡的常用检测方法简介一、细胞凋亡的形态学检测一、细胞凋亡的形态学检测 1.普通光学显微镜：普通光学显微镜：染色细胞：结合不同的染料可观察到核固缩、碎裂以及凋亡小体的形成；染色细胞：结合不同的染料可观察到核固缩、碎裂以及凋亡小体的形成；未染色细胞：体积变小、变形，胞膜完整但出现发泡现象，可见凋亡小体。未染色细胞：体积变小、变形，胞膜完整但出现发泡
29、现象，可见凋亡小体。贴壁细胞：出现皱缩、变圆、脱落；贴壁细胞：出现皱缩、变圆、脱落；2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察：荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察：用用DNA特异性的荧光染料：如吖啶橙（特异性的荧光染料：如吖啶橙（acridine,AO）、）、Hoechst 33342、Hoechst 33258、碘化丙啶（、碘化丙啶（propidium lodide,PI）及溴乙啶（）及溴乙啶（ethidium bromide,EB）等染色。）等染色。染料与染料与DNA的呈非嵌入式结合，紫外光激发时发射明亮的荧光。的呈非嵌入式结合，紫外光激发时发射明亮的荧光。结果评判：结果评判：活细胞核呈弥散
30、均匀荧光；凋亡细胞核或胞质内可见浓染致密的活细胞核呈弥散均匀荧光；凋亡细胞核或胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光，如果见到颗粒状荧光，如果见到3个或个或3个以上的个以上的DNA荧光碎片可确认为凋亡细胞。荧光碎片可确认为凋亡细胞。3透射电子显微镜观察：透射电子显微镜观察：电子显微镜是观察细胞形态最好的方法，电子显微镜是观察细胞形态最好的方法，可以同时反映细胞膜的发泡及膜的完整性、细胞器的改变、细胞核及染可以同时反映细胞膜的发泡及膜的完整性、细胞器的改变、细胞核及染色质的改变及凋亡小体的形成等，因此能检测早期凋亡的细胞。色质的改变及凋亡小体的形成等，因此能检测早期凋亡的细胞。二、凋亡细胞膜改变的检测二
31、、凋亡细胞膜改变的检测1.细胞膜完整性的检测：细胞膜完整性的检测：可用膜非通透性染料，如台盼蓝、碘化丙啶、溴化乙锭等进行鉴别，这可用膜非通透性染料，如台盼蓝、碘化丙啶、溴化乙锭等进行鉴别，这些染料可以使膜通透性增加的细胞（如坏死细胞及凋亡后期的继发性坏死的些染料可以使膜通透性增加的细胞（如坏死细胞及凋亡后期的继发性坏死的细胞）着色，而活细胞及凋亡细胞则不着色。其中以台盼蓝拒染试验最常用。细胞）着色，而活细胞及凋亡细胞则不着色。其中以台盼蓝拒染试验最常用。2.磷脂酰丝氨酸外翻分析（磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV/PI双染色法）：双染色法）：Annexin-V是一种分子量为是一种分子量为3
32、5-36KD的的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与依赖性磷脂结合蛋白，与PS具有具有高度亲和力。将高度亲和力。将Annexin-V进行荧光素（进行荧光素（FITC、PE）或生物素标记，以标）或生物素标记，以标记了的记了的Annexin-V作为荧光探针，利用作为荧光探针，利用流式细胞仪流式细胞仪或或荧光显微镜荧光显微镜可观察到早可观察到早期凋亡细胞膜表面暴露的期凋亡细胞膜表面暴露的PS与荧光探针特异结合而出现荧光；与荧光探针特异结合而出现荧光；由于细胞膜仍然具有完整性，因此膜通透性染料由于细胞膜仍然具有完整性，因此膜通透性染料PI不能进入细胞，而无法标记不能进入细胞，而无法标记细胞核。凋亡晚期或坏死
33、的细胞由于细胞核。凋亡晚期或坏死的细胞由于PS外翻及膜通透性增加而同时受到荧外翻及膜通透性增加而同时受到荧光探针和光探针和PI的标记因此将的标记因此将Annexin-V与与PI匹配使用，可以同时区分：匹配使用，可以同时区分：活细胞（活细胞（Annexin-V和和PI双阴性）双阴性）凋亡早期（凋亡早期（Annexin-V阳性、阳性、PI阴性）阴性）凋亡晚期或坏死细胞（凋亡晚期或坏死细胞（Annexin-V和和PI双阳性）。双阳性）。细胞膜的变化细胞膜的变化三、三、DNA片断化检测片断化检测1.电泳法：电泳法：采用常规方法分离提纯采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化，进行琼脂糖凝胶和溴
34、化乙啶染色，表现为梯形电泳图谱乙啶染色，表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。如果细胞量很少，还可在分离提纯如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使）使DNA标记，标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。的形成。2.流式细胞术（流式细胞术（Flow cytometry，FCM）分析：）分析：凋亡细胞固定后膜通透性增加，细胞内降解的小分子凋亡细胞固定后膜通透性增加，细胞内降解的小分子DNA外漏，使细胞核外漏，使细胞核DNA的含量低
35、于正常细胞的二倍体，的含量低于正常细胞的二倍体，且由于且由于DNA的降解与荧光染料的结合减少，细胞荧光强度的降解与荧光染料的结合减少，细胞荧光强度降低。因此应用降低。因此应用DNA特异荧光染料如特异荧光染料如PI，Hoechst，DAPI等染色后，在等染色后，在FCM进行细胞周期分析中，显示在进行细胞周期分析中，显示在G1峰前出现一个峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体或称亚含量减少的亚二倍体或称亚G1（sub-G1）细胞峰，又称凋亡细胞峰。）细胞峰，又称凋亡细胞峰。可对典型凋亡定性和定量，可间接判断凋亡细胞所处的周可对典型凋亡定性和定量，可间接判断凋亡细胞所处的周期时相期时相;不典型凋亡或混
36、有大量坏死细胞时可影响结果。不典型凋亡或混有大量坏死细胞时可影响结果。电泳法检测凋亡电泳法检测凋亡DNA Ladder原位末端转移酶标记技术原位末端转移酶标记技术(TdT或或TUNEL)凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活,核核DNA被切被切割成许多双链割成许多双链DNA片段以及高分子量片段以及高分子量DNA单链断裂点单链断裂点(缺缺口口),暴露出大量暴露出大量3羟基末端羟基末端,如用如用(TdT)将标记的将标记的-dUTP进进行缺口末端标记行缺口末端标记,则可原位特异地显示出凋亡细胞。则可原位特异地显示出凋亡细胞。(一一)荧光标记法荧光标记法 *采用美国采用美
37、国Oncor公司公司ApopTag TM 试剂盒，或德国试剂盒，或德国Boehringer Mannheim公司公司In Situ Cell Death Detection试剂盒试剂盒 (二二)酶标记法酶标记法 *采用美国采用美国Oncor公司公司ApopTagTM-Peroxidase试剂盒试剂盒 FACS检测末端标记的检测末端标记的U937凋亡细胞凋亡细胞TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的形态测定，并可检测出极
38、少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。特异性强，可进行定位及定量；特异性强，可进行定位及定量；耗费大，混有较多坏死细胞时可影响结果。耗费大，混有较多坏死细胞时可影响结果。凋亡的形态学检测凋亡的形态学检测U937 Cell（荧光素染色）（荧光素染色）大鼠结肠组织染色大鼠结肠组织染色末端转移标记技术检测细胞凋亡末端转移标记技术检测细胞凋亡U937细胞（荧光素染色）细胞（荧光素染色）末端转移标记技术检测细胞凋亡末端转移标记技术检测细胞凋亡大鼠脊髓（大鼠脊髓（PI染色，双染法染色，双染法）四、其他检测方法四、其他检测方法1.线粒体膜势能的检测线粒体膜势能的检测 线粒体跨膜电位的存在，使一些
39、亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。可用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。低。可用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。2.Caspase-3活性的检测活性的检测 分析方法：分析方法：Western blot 荧光分光光度计分析荧光分光光度计分析 流式细胞术分析流式细胞术分析3.凋亡相关蛋白凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19（PDCD5）是一种人类新基因，具有促进细胞凋亡的作）是一种人
40、类新基因，具有促进细胞凋亡的作用。凋亡早期用。凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。凋亡早期凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和）外翻和细胞核细胞核DNA的片段化，提示的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。凋发生的事件之一。凋 亡早期亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出的核转位具有普遍
41、意义，不同细胞凋亡早期均出现现TFAR19高表达和核转位。高表达和核转位。apoptosiapoptosis s正常机体细胞生长与死亡的平衡正常机体细胞生长与死亡的平衡生生长长坏死、凋坏死、凋亡亡正常机体正常机体凋亡相对不足凋亡相对不足发病学上，细胞凋亡是机体天然的抗癌机制之一发病学上，细胞凋亡是机体天然的抗癌机制之一肿瘤细胞肿瘤细胞FasFas基因转录和表达水平下降基因转录和表达水平下降肿瘤免疫逃逸肿瘤免疫逃逸FasFas基因突变、死亡结构域缺失；可溶性基因突变、死亡结构域缺失；可溶性FasFas水平升高水平升高肿瘤发生肿瘤发生肿瘤细胞高表达肿瘤细胞高表达FasLFasL、T T细胞高表达细
42、胞高表达FasFas肿瘤免疫逃逸肿瘤免疫逃逸细胞凋亡过度细胞凋亡过度2 2 心血管疾病心血管疾病 心力衰竭心力衰竭 心肌缺血与再灌注损伤心肌缺血与再灌注损伤 坏死与凋亡共存坏死与凋亡共存 发生机制发生机制：氧化应激；细胞内钙超载；：氧化应激；细胞内钙超载；FasFas受体上调；受体上调；p53p53基因转录增强基因转录增强 凋亡特点凋亡特点：早期凋亡为主，晚期坏死为主早期凋亡为主，晚期坏死为主 梗死灶中央以坏死为主，周边凋亡为主梗死灶中央以坏死为主，周边凋亡为主 慢性、轻度缺血以凋亡为主，慢性、轻度缺血以凋亡为主，急性、重度缺血则常常发生坏死急性、重度缺血则常常发生坏死 IRIR引起细胞凋亡有
43、时比单纯缺血更严重引起细胞凋亡有时比单纯缺血更严重3.3.神经元退行性疾病神经元退行性疾病 特定神经元进行性丧失为病理特征的疾病特定神经元进行性丧失为病理特征的疾病阿尔茨海默病（阿尔茨海默病（Alzheimer disease ADAlzheimer disease AD）图示疾病谱的改变，图示疾病谱的改变，ADAD患病率呈急剧上升趋势患病率呈急剧上升趋势Lancet（2004）n 严重降低了老年严重降低了老年 人的生活质量人的生活质量n 增加了家庭和社会负担增加了家庭和社会负担n 是医学研究的热点课题是医学研究的热点课题老年性痴呆症老年性痴呆症（ADAD）4 4）机制：）机制：-淀粉样蛋白基
44、因位于淀粉样蛋白基因位于2121号染色体，当号染色体，当钙钙超载、氧化应激超载、氧化应激或或神经生长因子分泌不足神经生长因子分泌不足时，时，Ca2Ca2内内流增加，激活与流增加，激活与-淀粉样蛋白合成有关的基因，使淀粉样蛋白合成有关的基因，使-淀粉样蛋白含量增加，沉积于神经元内，进一步激淀粉样蛋白含量增加，沉积于神经元内，进一步激活周围的活周围的MM释放细胞因子和炎性介质促进释放细胞因子和炎性介质促进神经细胞凋神经细胞凋亡的发生亡的发生1 1）ADAD：主要是由于海马及基底神经核的胆碱能神经主要是由于海马及基底神经核的胆碱能神经 元大量凋亡而丧失；元大量凋亡而丧失；2 2）尸检：）尸检：大脑皮
45、质广泛萎缩，脑沟变宽，脑回变大脑皮质广泛萎缩，脑沟变宽，脑回变 窄，脑室扩大；窄，脑室扩大；3 3）病理切片：）病理切片：-淀粉样蛋白沉积，神经元缠结；淀粉样蛋白沉积，神经元缠结；ADAD的主要脑病理学特征和临床表现的主要脑病理学特征和临床表现老年斑老年斑 (A(A)神经原纤维缠结神经原纤维缠结 (P-tau)(P-tau)主要脑病理学特征主要脑病理学特征h主要临床表现是主要临床表现是记忆障碍记忆障碍血管内皮细胞血管内皮细胞凋亡过度凋亡过度而而血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞凋亡不足凋亡不足 血脂血脂（oxLDLoxLDL）血流动力学改变血流动力学改变 动脉内膜功能受损动脉内膜功能受损 血管内皮解
46、剖性损伤血管内皮解剖性损伤 单核单核C C粘附、移行内膜下粘附、移行内膜下 内皮下胶原暴露内皮下胶原暴露 吞噬吞噬LDLLDL成为泡沫成为泡沫C C 血小板激活血小板激活 释放释放GF GF（PDGFPDGF、FGFFGF、EGFEGF,TGF-TGF-）刺激平滑肌刺激平滑肌C C、成纤维、成纤维C C增生增生 刺激结缔组织形成、抑制平滑肌刺激结缔组织形成、抑制平滑肌C C增生增生1 1细胞凋亡与自身免疫病细胞凋亡与自身免疫病（1 1）机制）机制 1）自身反应性免疫细胞凋亡受阻）自身反应性免疫细胞凋亡受阻C3H/gld鼠鼠FasL基因点突变基因点突变MRL/Lpr鼠鼠Fas基因插入突变基因插入
47、突变FasL分子结构异常分子结构异常Fas蛋白低表达蛋白低表达自身反应性自身反应性T细细胞逃避阴性选择胞逃避阴性选择2 2）凋亡促使产生致病性自身抗原）凋亡促使产生致病性自身抗原 （具潜在免疫原性的细胞组分聚集）（具潜在免疫原性的细胞组分聚集）异常自身免疫应答异常自身免疫应答3 3）微环境异常）微环境异常Th1/Th2Th1/Th2凋亡失衡凋亡失衡 Th1/Th2Th1/Th2细胞偏移细胞偏移AIDAID4 4）自身）自身AbAb进入体细胞结合相应靶进入体细胞结合相应靶AgAg 干扰细胞正常功能干扰细胞正常功能体细胞凋亡体细胞凋亡5 5）基因缺陷或环境因子）基因缺陷或环境因子DNADNA甲基化
48、甲基化 *阻止细胞对致凋亡信号的反应性阻止细胞对致凋亡信号的反应性 自身反应性自身反应性T/BT/B细胞产生和寿命细胞产生和寿命 *含低甲基化含低甲基化DNADNA的核小体释放的核小体释放 刺激自身反应性刺激自身反应性B B细胞产生自身细胞产生自身AbAb6)6)器官特异性器官特异性AIDAID靶细胞高表达靶细胞高表达FasFas *致病因子致病因子 局部（局部（细胞、甲状腺上皮细胞）炎症细胞、甲状腺上皮细胞）炎症 高表达高表达FasFas CTL CTL通过通过Fas/FasLFas/FasL杀伤之杀伤之（2 2）举例）举例 A A类风湿关节炎类风湿关节炎 1 1）病理改变）病理改变 病变关
49、节滑膜细胞凋亡障碍病变关节滑膜细胞凋亡障碍 细胞增生细胞增生 2 2）机制）机制 *关节液中关节液中IL-1IL-1和和TGF-1TGF-1，滑膜细胞，滑膜细胞FasFas表达表达；*关节液中关节液中sFassFas表达表达，抑制，抑制Fas/FasLFas/FasL途径途径;*滑膜细胞滑膜细胞Bcl-2Bcl-2、BclBcl-XL-XL表达表达，凋亡域值，凋亡域值；*关节滑液中单核细胞关节滑液中单核细胞FasLFasL；*关节滑液关节滑液T T细胞对凋亡产生抗性；细胞对凋亡产生抗性；3 3）诱导凋亡治疗）诱导凋亡治疗ARAR *FasL FasL的重组载体转染关节组织；的重组载体转染关节组
50、织；*应用抗应用抗FasFas抗体促使抗体促使FasFas交联。交联。B B系统性红斑狼疮（系统性红斑狼疮（SLESLE）1 1）FasFas系统功能紊乱系统功能紊乱 *T/B T/B细胞细胞FasFas表达表达；*T/B T/B细胞细胞FasFas的的DDDD突变；突变；*sFassFas分泌分泌；*FasLFasL分子结构异常；分子结构异常；2 2）T/BT/B细胞细胞DNADNA甲基化甲基化 凋亡受阻凋亡受阻 低甲基化低甲基化DNADNA诱生自身抗体诱生自身抗体3 3）组织细胞凋亡释放大量核小体）组织细胞凋亡释放大量核小体 诱导抗核抗体产生诱导抗核抗体产生2 2细胞凋亡与病毒感染细胞凋亡
