1、 张张 琰琰华东理工大学材料科学与工程学院华东理工大学材料科学与工程学院 RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默转录后基因沉默现象.它是一种跨越多种种属的古老的生物途径,同时它的出现为生物学家提供了一种快速、简便的反向遗传学技术,在后基因组时代功能基因的研究中具有重要的应用前景.2.2.基因治疗基因治疗lRNA干扰的核心内容是siRNA(RNA(small interfering RNA),它利用了由小干扰RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应
2、的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。lRNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达RNA的生物学功能。RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。2.2.基因治疗基因治疗（一）（一）RNAiRNAi的发现的发现l1990 年,为加深矮牵牛花(petunias)的紫色,Jorgensen 等导入了一个强启动子控制的色素基因。结果许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色。这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制
3、了，Jorgensen 把这个现象命名为共抑制(cosuppression)。P35S色素基因色素基因Ti质粒质粒色素色素基因基因重组重组转化转化繁殖繁殖美国科学家安德鲁美国科学家安德鲁-费里和克拉格费里和克拉格-米洛因为发现了米洛因为发现了RNARNA干扰现象而获得了干扰现象而获得了20062006年度诺贝尔医学奖年度诺贝尔医学奖 l1998 年,Andrew Fire 等在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的研究证明,在正义RNA 阻断基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)。他们将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达,
4、并证实这种抑制主要作用于转录之后,所以又称RNAi 为转录后基因沉默(postt ranscriptional gene silencing，PTGS)l1999 年,Hamilton 等在植物基因沉默的研究中首次发现,2125nt 的dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重要,而在转基因正确表达的植株中则未出现。lHammond 等进行的细胞提取物核酸酶活性实验，证明了这些小分子双链RNA（siRNA）在RNAi 中的作用。l随后人们陆续在果蝇(Drosophila)、锥虫(Trypanosomes)、涡虫(Planaria)、斑马鱼(Zebrafish)、拟南芥(Arabidopsis
5、thaliana)、大小鼠和人体内发现了RNAi 现象。RNAiRNAi 技术的应用技术的应用1.基因功能研究：利用RNAi技术使目的基因沉默，研究基因的功能。如利用RNAi技术证明ag-1基因与拟南芥花的发育有关。Chiou-Fen Chuang and Elliot M.Meyerowitz*PNAS April 25,2000 vol.97 No.9 49854990RNAiRNAi 技术的应用技术的应用2.临床应用：RNAi 机制可作为真核生物的基因组免疫系统,抑制外源和内源有害基因的表达。利用RNAi 技术把与病毒基因具同源性的siRNA 引入感染细胞将会抑制病毒的增殖,这为病毒相关
6、疾病的治疗提供了新的思路。利用RNAi 技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。3.3.基基因的传递系统因的传递系统一个理想的基因传递系统应具备以下重要的一个理想的基因传递系统应具备以下重要的性质性质 :携带性能携带性能 安全性安全性缓释作用缓释作用能携带足够数量的目的基因能携带足够数量的目的基因对机体没有毒性对机体没有毒性 、致病性或免疫原性、致病性或免疫原性 ,具有生物降解性或良好的生物相容性具有生物降解性或良好的生物相容性控制基因的释放控制基因的释放,延长基因的表达时间延长基因的表达时间,改善基因治疗的效果改善基因治疗的效果理想的基因传递系统理想的基因传递系统稳定性稳定
7、性载体系统本身应稳定载体系统本身应稳定 ,而且要保护携带的基因免受核酸酶等的破坏而且要保护携带的基因免受核酸酶等的破坏 靶向性能靶向性能 可有效地将目的基因输可有效地将目的基因输送至靶细胞内送至靶细胞内 理想的基因传递系统理想的基因传递系统可促进目的基因从内吞小泡释放进入胞浆可促进目的基因从内吞小泡释放进入胞浆 ；可促进目的基因转运可促进目的基因转运入核入核；可调控基因输入后在体内的表达可调控基因输入后在体内的表达,因为表达失控的后果将因为表达失控的后果将是非常严重的。是非常严重的。传递系统传递系统l在已进行的基因传递系统的临床研究中在已进行的基因传递系统的临床研究中 ,反转录病毒传反转录病毒
8、传递系统递系统占首位占首位 ,共计共计 150150多个治疗方案多个治疗方案 ,病例数达病例数达 1200 1200 多人多人 ；l脂质体传递系统脂质体传递系统位于第二位于第二,治疗方案治疗方案 70 70 多个多个 ,病病 例数例数达达 700 700 多人多人 ;l腺病毒传递系统腺病毒传递系统位于第三位于第三,治疗方案约治疗方案约 70 70 个个,病例数达病例数达 400 400 多人多人 ;l排在后面的基因传递系统依次是产生反转录病毒的包排在后面的基因传递系统依次是产生反转录病毒的包装细胞装细胞 、Pox Pox 病毒、病毒、DNA DNA 载体和腺相关病毒。载体和腺相关病毒。(一一)
9、病毒基因传递系统病毒基因传递系统 l病毒基因传递系统也称病毒载体病毒基因传递系统也称病毒载体 (viral vector),(viral vector),是野生型是野生型病毒经改造除去致病性后得到的基因输送系统病毒经改造除去致病性后得到的基因输送系统其主要特点是其主要特点是转染相对高效转染相对高效 ,但安全性较差但安全性较差。基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。并能调控其适度表达。常用的载体有两类：常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体和非病毒载体。病毒载体：病毒载体：逆转录病毒载体，逆转录病
10、毒载体，腺病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等；腺相关病毒载体等；非病毒载体：非病毒载体：与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。转移入患者体内。基因载体的选择基因载体的选择 治疗基因治疗基因导入受体细导入受体细胞的方法胞的方法 化学方法化学方法物理方法物理方法膜融合法膜融合法病毒载体法病毒载体法质粒质粒DNADNA直接转移法直接转移法基因转移方法基因转移方法 磷酸钙法磷酸钙法 DEAEDEAE葡聚糖法葡聚糖法 电穿孔法电穿孔法 粒子轰击法（基因枪法）粒子轰击法（基因枪法）(二二)非病毒基因传递系统非病毒基因传递系统 非
11、病毒基因传递系统也称非病毒载体非病毒基因传递系统也称非病毒载体 (non-viral vector),(non-viral vector),可可以克服病毒载体的很多缺陷以克服病毒载体的很多缺陷,己越来越引起科学家的重视。己越来越引起科学家的重视。目前已进入临床研究的主要是目前已进入临床研究的主要是阳离子脂质体阳离子脂质体和和DNA DNA 载体载体。非病毒基因传递系统的非病毒基因传递系统的主要特点主要特点是安全性好是安全性好,但转染相对但转染相对低效。低效。非病毒载体系统实际上是将需要导入的外源基因视为药物，将其运送到特定的细胞或组织器官。(1)DNA 载体载体lDNA DNA 载体又称载体又
12、称质粒质粒 DNA DNA(plasmid DNA)(plasmid DNA)或裸或裸 DNA DNA(naked DNA),(naked DNA),可能是最简单的非病毒传递系统。可能是最简单的非病毒传递系统。l用于基因治疗的质粒用于基因治疗的质粒 DNA DNA 产品与一般的药品很类似产品与一般的药品很类似 ,需要有一定的剂型和质量标准。需要有一定的剂型和质量标准。l纯化质粒纯化质粒 DNA DNA 的安全性较好的安全性较好 ,不会引起炎症反应等不会引起炎症反应等 ,适用面也较广适用面也较广 ,剂量可以因人而异。剂量可以因人而异。DNA 载体载体l 裸DNA(naked DNA)未经包装的质
13、粒载体，是结构最简单的非病毒载体。由于在体内易被降解破坏（缺乏保护性外包装）又无靶向性（缺乏可被靶细胞识别的成分），故多采用直接注射或基因枪等物理方法直接导入靶组织或靶器官,如皮肤、骨骼肌、心肌或肿瘤等。l 利用本法将编码抗原的基因导入皮下，可激发机体产生相应的免疫反应，被称为DNA疫苗（DNA vaccine），是一种较有前途的免疫方法。DNA 载体载体l质粒质粒 DNA DNA 在靶细胞中的表达效率较低在靶细胞中的表达效率较低 ,持续时间较短持续时间较短,因此需要的剂量比较大。因此需要的剂量比较大。l一般在一个疗程的治疗中需要毫克数量级的质粒一般在一个疗程的治疗中需要毫克数量级的质粒 DN
14、A DNA l如何进行质粒如何进行质粒 DNA DNA 的大规模生产的大规模生产 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。本低廉。基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后，可以自动形成包埋外源混合后，可以自动形成包埋外源DNADNA的脂的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源胞内吞作用将外源DNADNA（即目的基因）转（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。移至细胞内，并进行表达。(2)(2)脂质体载体脂质体载体(2)(2)脂质体载体脂质体载体 用脂质体作为载体进
15、行基因输送的研究已有用脂质体作为载体进行基因输送的研究已有 20 20 多年多年 ,这是因为脂质体可促进大分子物质对细胞这是因为脂质体可促进大分子物质对细胞膜的穿透膜的穿透。阳离子脂质体阳离子脂质体阴离子脂质体阴离子脂质体 pH pH 敏感型脂质体敏感型脂质体 融合脂质体融合脂质体 脂质体介导的基因转移示意图(a)阳离子脂质体阳离子脂质体l阳离子脂质体阳离子脂质体 (cationic liposomes(cationic liposomes)是基因治疗中应是基因治疗中应用最多的非病毒传递系统用最多的非病毒传递系统 l一般由带正电荷的脂类与中性脂类按一定的摩尔一般由带正电荷的脂类与中性脂类按一定
16、的摩尔比组成。比组成。(a)阳离子脂阳离子脂质体质体用于制备阳离子脂质体的阳离子脂类大多是合成的用于制备阳离子脂质体的阳离子脂类大多是合成的双链季铵盐型两性分子双链季铵盐型两性分子 主要作用就是提供正电荷，增加与主要作用就是提供正电荷，增加与 DNA DNA 的缩合的缩合 一般化学稳定性较好一般化学稳定性较好,可以生物降解可以生物降解,但均有一定的但均有一定的细细胞毒性胞毒性。(b)中性脂中性脂质体质体l中性脂类的作用是稳定脂质双层膜、降低阳离子脂质的中性脂类的作用是稳定脂质双层膜、降低阳离子脂质的毒性、特别是促进脂质体对细胞的渗透。毒性、特别是促进脂质体对细胞的渗透。胆固醇胆固醇 (Chol
17、(Chol)磷磷酯酰酯酰胆碱胆碱 (PC)(PC)磷磷酯酰酯酰乙醇乙醇胺胺 (PE)(PE)二油酰基磷脂酰胆碱二油酰基磷脂酰胆碱 (DOPC)(DOPC)二油酰基磷脂酰乙醇二油酰基磷脂酰乙醇胺胺 (DOPE)(DOPE)阳离子脂质体的转染效率影响因素阳离子脂质体的转染效率影响因素1.1.粒径粒径 内吞小泡的大小约在内吞小泡的大小约在 8080200 n m 200 n m 之间之间,因此内吞作用是一因此内吞作用是一个体积限制性步骤个体积限制性步骤,这就要求所制备的阳离子脂质体大小这就要求所制备的阳离子脂质体大小适宜适宜 ,而且复合物也应足够小而且复合物也应足够小,或者说缩合应比较完全或者说缩合
18、应比较完全；由由于复合物的形成是一个自发的过程于复合物的形成是一个自发的过程,控制起来有一定控制起来有一定难度难度,而且复合物还可能进一步聚集而且复合物还可能进一步聚集,因此一般是将脂因此一般是将脂质体质体 和和 DNA DNA 分别包装分别包装,临用时再进行混合临用时再进行混合 。1.1.粒径粒径 阳离子脂质体在血阳离子脂质体在血液循环液循环中的稳定性是一个重要的问题中的稳定性是一个重要的问题,阳离子脂质体在血阳离子脂质体在血液循环液循环中会带上负电荷中会带上负电荷,而且容易发生而且容易发生聚集或破裂聚集或破裂,释放出释放出 DNADNA。用用聚乙二醇等进行修饰聚乙二醇等进行修饰可在可在一定
19、程度上降低复合物与血液成份的相互作用。一定程度上降低复合物与血液成份的相互作用。2.2.稳定性稳定性1.1.具有多个正电荷头部的脂质体转染效率高具有多个正电荷头部的脂质体转染效率高,可能是与可能是与 DNA DNA 作用更牢、缩合较好有关作用更牢、缩合较好有关；2.2.二油二油酰酰基磷脂基磷脂酰酰乙醇乙醇胺胺（DOPEDOPE）具有很强的细胞膜具有很强的细胞膜去稳定化作用去稳定化作用,可以提高可以提高 DNA DNA 的转染效率的转染效率,随着随着 DOPE DOPE 比例增加比例增加,转染效率随之提高转染效率随之提高,但脂质体在血中的稳定但脂质体在血中的稳定性也会下降。性也会下降。(c)(c
20、)阴离子脂质体阴离子脂质体l阴离子脂质体阴离子脂质体 (anionic liposomes(anionic liposomes)所用的阴离子脂所用的阴离子脂质包括磷质包括磷酯酰酯酰丝氨酸、心肌磷脂和二棕榈磷脂酰丝氨酸、心肌磷脂和二棕榈磷脂酰甘油等。由于载体与甘油等。由于载体与 DNA DNA 都带负电都带负电,为了为了提高包提高包封效率常需在制备脂质体时加入钙封效率常需在制备脂质体时加入钙。l阴离子脂质体的特点是可将低聚核苷酸定位于细阴离子脂质体的特点是可将低聚核苷酸定位于细胞核胞核,而且可延长低聚核苷酸在细胞内的保留时而且可延长低聚核苷酸在细胞内的保留时间。间。l对阴离子脂质体的研究还比较少
21、。对阴离子脂质体的研究还比较少。(d)pH(d)pH 敏感型脂质体敏感型脂质体 PHPH敏感脂质体敏感脂质体(pH-sensitive pH-sensitive liposomesliposomes)是一种具有细胞内是一种具有细胞内靶向和控制药物靶向和控制药物(如基因、肽、蛋白质如基因、肽、蛋白质)释放的功能性脂释放的功能性脂质体。质体。pH pH 敏感型脂质体敏感型脂质体膜融合机制膜融合机制1.1.在酸性条件下，即在核内体形成后几分钟内，进入溶酶在酸性条件下，即在核内体形成后几分钟内，进入溶酶体之前，体之前，pHpH从从7.47.4减至减至5.35.36.36.3左右时，可导致脂肪酯羧左右时
22、，可导致脂肪酯羧基的质子化，而引起六角晶相的形成，基的质子化，而引起六角晶相的形成，2.pH2.pH敏感脂质体膜发生结构改变，促使脂质体膜与核内体敏感脂质体膜发生结构改变，促使脂质体膜与核内体/溶酶体膜的融合，溶酶体膜的融合，3.3.将包封的物质导入胞浆及主动靶向病变组织，避免网状将包封的物质导入胞浆及主动靶向病变组织，避免网状内皮系统的清除。内皮系统的清除。(e)融合脂质体融合脂质体融合脂质体融合脂质体 是在制备脂质体时加入融合剂而获得。是在制备脂质体时加入融合剂而获得。常用融合剂包括常用融合剂包括 PEG PEG、甘甘油油 、PVA PVA、以及重组病毒的细以及重组病毒的细胞膜或某些病毒蛋
23、白胞膜或某些病毒蛋白。DOPE DOPE 也具有融合剂的性质也具有融合剂的性质,主要用于阳离子脂质体主要用于阳离子脂质体 /DNA/DNA 复合物的制备复合物的制备 。目前应用还比较少。目前应用还比较少。3.3.阳离子聚合物阳离子聚合物 阳离子聚合物阳离子聚合物 (cationic polymer)(cationic polymer)与与 DNA DNA 可以在电荷作可以在电荷作用下发生缩合用下发生缩合,形成稳定的复合物形成稳定的复合物,防止防止 DNA DNA 的降解的降解,其大小可在其大小可在 100 n m 100 n m 以下以下,表面带正电表面带正电,有利于与靶细胞有利于与靶细胞的的
24、 吸附。吸附。这类载体的安全性较好这类载体的安全性较好 ,容易制备容易制备 ,不足之处不足之处是缺乏靶向性是缺乏靶向性,而且单独应用时转染效率比较低。而且单独应用时转染效率比较低。3.3.阳离子聚合物阳离子聚合物l可选择的阳离子聚合物可选择的阳离子聚合物 聚氨基化合物聚氨基酸星状树突体阳离子聚合物阳离子聚合物基因载体基因载体聚乙烯亚聚乙烯亚胺胺(PEI)lPEI是一种比较常用的阳离子聚合物是一种比较常用的阳离子聚合物l具有高度分枝的结构具有高度分枝的结构,l内部的氨基与末端的氨基可在不同的内部的氨基与末端的氨基可在不同的 pH 下离子化下离子化,l有较强的缓冲性能有较强的缓冲性能PEIPEI有
25、较强的缓冲性能有较强的缓冲性能：一方面一方面：有利于有利于 DNA 的稳定性的稳定性；另一方面另一方面：PEI 在酸性条件下构象改变可促进在酸性条件下构象改变可促进 DNA 从内从内吞小泡中的释放吞小泡中的释放 乳糖化肝细胞星状树突体星状树突体l星状树突体星状树突体(starburst dendrimers)的核心分子至少的核心分子至少有三个具化学活性的侧链有三个具化学活性的侧链,在这些化学活性部位与其他在这些化学活性部位与其他同样的分子聚合同样的分子聚合,如此反复如此反复,产生一个类似球型的分枝产生一个类似球型的分枝状聚合物。状聚合物。l典型的星状树突体是聚氨基典型的星状树突体是聚氨基酰胺酰
26、胺(polyamidoamine)。星状树突体星状树突体l星状树突体的聚合过程是可以星状树突体的聚合过程是可以 控制的控制的,因此可以获得不因此可以获得不同粒度大小的产物。这类载体用于体外实验已很成功同粒度大小的产物。这类载体用于体外实验已很成功 l 目前正在研制可生物降解的目前正在研制可生物降解的,或者可形成圆筒状的星状或者可形成圆筒状的星状树突体。树突体。l由于具有分枝结构由于具有分枝结构,星状树突体也具缓冲性能星状树突体也具缓冲性能,可促进可促进 DNA 从内吞小泡中释放。从内吞小泡中释放。聚氨基酸聚氨基酸l虽然有虽然有 4 4 种带正电的氨基酸种带正电的氨基酸,但用于基因输送的聚但用于
27、基因输送的聚氨基酸几乎只有聚赖氨酸氨基酸几乎只有聚赖氨酸 在在2020世纪世纪6060年代就已有文献报道。年代就已有文献报道。l聚氨基酸聚氨基酸 /DNA/DNA 复合物缺乏靶向性复合物缺乏靶向性,而且由于是线性而且由于是线性的结构的结构,不能促进复合物从内吞小泡中释放不能促进复合物从内吞小泡中释放DNA,DNA,因此因此往往需要进行一些往往需要进行一些修饰修饰以改善其性能。以改善其性能。修饰的聚修饰的聚赖氨酸赖氨酸基因载体基因载体 4.4.纳米粒载体纳米粒载体l纳米粒传输系统具有前述理想的基因传递系统具备的很纳米粒传输系统具有前述理想的基因传递系统具备的很多重要性质多重要性质,特别是特别是安
28、全性、稳定性和缓释作用明显。安全性、稳定性和缓释作用明显。l进行适当进行适当修饰后可提高其靶向性和转染效率修饰后可提高其靶向性和转染效率。目前应用。目前应用较多的制备纳米粒的材料有明胶较多的制备纳米粒的材料有明胶 、壳聚糖等。、壳聚糖等。5.5.非病毒基因输送系统的优化非病毒基因输送系统的优化 可以说到目前为止可以说到目前为止,所有的非病毒基因输送系统都并不十所有的非病毒基因输送系统都并不十分理想分理想,总有一些不足之处总有一些不足之处,需要进行优化与完善。需要进行优化与完善。1 1.在提高靶向性方面在提高靶向性方面,常用的方法是受体介导或抗体介导常用的方法是受体介导或抗体介导的方法的方法 受
29、体介导的受体介导的基因载体基因载体运输5.5.非病毒基因输送系统的优化非病毒基因输送系统的优化2.促进促进 DNA DNA 从内吞小泡中释放从内吞小泡中释放 3.3.促进促进 DNA DNA 的转运入核的转运入核4.4.载体输送系统中基因的表达载体输送系统中基因的表达5.5.安全性安全性 6.6.各种载体与各种修饰方法进行组合各种载体与各种修饰方法进行组合 非病毒载体的一些进展非病毒载体的一些进展l基因缝线 将裸DNA直接涂粘或通过大分子多聚物偶联到手术缝合线上，进行血管、肌肉和组织的缝合而实现基因转移；l基因球囊和基因支架 用大分子多聚物将基因载体黏附于球囊导管或支架表面的方法 完成对心血管
30、系统内的基因转移；l基因针 应用鱼精蛋白将基因载体黏附在针灸针上，刺入肌肉组织内并施加短暂的高压脉冲电刺激，使细胞膜结构暂时性松动，产生纳米级小孔洞，可实现局部组织的高效基因转移。这些方法使血管或骨骼肌的局部性基因转移更为有效而方便。l纤维蛋白凝固溶解 将基因载体与可溶性纤维蛋白原混合成复合液，从体外注射至血管周围，在凝血酶和组织凝血因子作用下，可溶性的纤维蛋白原和基因载体的复合物被转变为不溶性的复合物，黏附在血管周围，7-14天后在内源性纤溶酶的作用下，纤维蛋白自行溶解，从而实现血管外膜的基因转移。l温度敏感性多聚物 可通过使多聚物膨胀缩小的温度变化来控制DNA的释放，如生物可降解的 PEG
31、 poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid)(PLGA)为非离子亲水三联多聚物，呈温度依赖性溶液-凝胶态转换。在室温（4-20）为液状，而在体温（30）则转换成凝胶状。因而在体外易于与质粒DNA形成多聚物溶液，而进入体内后即在注射部位转换成水凝胶，缓慢释放质粒DNA，从而延长转染时间 世界上第一个正式被批准用于基因治疗的病例是世界上第一个正式被批准用于基因治疗的病例是先天性腺苷脱氨酶（先天性腺苷脱氨酶（ADAADA）缺乏症。）缺乏症。19901990年年9 9月美月美国国BlaeseBlaese博士成功地将正常的人的博士成功地将正常的人的ADAADA基因植入基
32、因植入ADAADA缺乏症病人的淋巴结内，完成世界上首例基缺乏症病人的淋巴结内，完成世界上首例基因治疗试验。因治疗试验。（一）遗传病的基因治疗研究（一）遗传病的基因治疗研究 已知人类有已知人类有40004000多种遗传病，在人群中的发病率多种遗传病，在人群中的发病率约为约为40405050。但真正了解病因，能进行产前诊断。但真正了解病因，能进行产前诊断的仅限于那些为数不多的常见遗传病。的仅限于那些为数不多的常见遗传病。1 1.在在DNADNA水平明确其发病原因及机制；水平明确其发病原因及机制；2.2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.3.该基因的表达不需
33、要精确调控；该基因的表达不需要精确调控；4.4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞该基因能在一种便于临床操作的组织细胞(如皮肤细胞，骨如皮肤细胞，骨髓细胞等髓细胞等)中表达并发挥其生理作用；中表达并发挥其生理作用；5.5.该遗传病不经治疗将有严重后果该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以存活等如不治疗难以存活等)。可。可供选择并符合上述供选择并符合上述4 4条以上要求的不过只有条以上要求的不过只有3030余种遗传病。余种遗传病。遗传病基因治疗必须符合以下要求：遗传病基因治疗必须符合以下要求：1 1腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)(P
34、NP)缺乏症缺乏症 2 2珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 3 3血友病和其他血浆蛋白缺乏症血友病和其他血浆蛋白缺乏症 4 4苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 5 5莱莱-纳纳(Lesch-Nyhan(Lesch-Nyhan)综合征综合征 6 6家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 7 7囊性纤维化病囊性纤维化病 （二）恶性肿瘤基因治疗研究（二）恶性肿瘤基因治疗研究 （1 1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；制癌症的发生、发展和转移；肿瘤发生是一
35、个极为复杂的过程，许多基因的突变肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。会导致肿瘤的发生。（2 2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；发挥抑癌作用；（3 3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；排斥反应；（4 4）通过导入）通过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞。杀伤癌细胞。1.1.肿瘤基因治疗的基本策略肿瘤基因治疗的基本策略 从实际应用于临床治疗的
36、角度来看，肿瘤基因治疗从实际应用于临床治疗的角度来看，肿瘤基因治疗的策略包括：的策略包括：(1)(1)直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长。直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长。(2)(2)增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤细胞。增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤细胞。(3)(3)改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效。改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效。2.2.肿瘤基因治疗的常用方法肿瘤基因治疗的常用方法 基因干预技术：通过基因干预，使得肿瘤细胞过基因干预技术：通过基因干预，使得肿瘤细胞过度表达的癌基因得到抑制，从而降低其恶性表型。度表达的癌基因得到抑制，从而降低其恶性表型。自杀基因治疗自杀基因治疗分子化疗：直接杀
37、死分子化疗：直接杀死肿瘤细胞肿瘤细胞。肿瘤的免疫基因治疗：以激发机体肿瘤免疫效应或肿瘤的免疫基因治疗：以激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。提高免疫效应细胞功能。提高化疗效果的辅助基因治疗：提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。耐药基因治疗。3.3.自杀基因治疗自杀基因治疗 基本原理：基本原理：向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具
38、有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将转染了该基因的肿瘤细胞转染了该基因的肿瘤细胞“自杀自杀”。这些基因也相应。这些基因也相应地被称为地被称为“自杀基因自杀基因”。自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一 自杀基因治疗的前提条件是自杀基因治疗的前提条件是“自杀基因自杀基因”的表达必须局的表达必须局限于肿瘤细胞中，而不伤及正常细胞。限于肿瘤细胞中，而不伤及正常细胞。利用免疫脂质体、受体介导等技术利用免疫脂质体、受体介导等技术进行定向基因转移。进行定向基因转移。利用病毒载体进行基因转移
39、。利用病毒载体进行基因转移。肿瘤特异性基因转录。肿瘤特异性基因转录。肿瘤内直接注射。肿瘤内直接注射。自杀基因转移常用方法自杀基因转移常用方法 4.4.肿瘤的免疫基因治疗肿瘤的免疫基因治疗 激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。主要包括细胞因子为目的的一种肿瘤基因治疗方法。主要包括细胞因子（或受体）基因治疗和抗原抗体基因治疗两大类。（或受体）基因治疗和抗原抗体基因治疗两大类。5.5.提高化疗效果的辅助基因治疗提高化疗效果的辅助基因治疗 临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题：临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大
40、难题：（1 1）是患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在）是患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交差细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交差耐受，最终导致化疗失败。耐受，最终导致化疗失败。（2 2）是大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨）是大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。髓造血细胞的功能受到抑制。(1)(1)药物增敏基因治疗药物增敏基因治疗 将鸡钙调素（将鸡钙调素（calmodulinca
41、lmodulin,CaM,CaM）基因导入小鼠乳腺癌细）基因导入小鼠乳腺癌细胞株胞株C127C127，结果仅需低剂量的长春新碱或长春花碱即可明，结果仅需低剂量的长春新碱或长春花碱即可明显抑制该细胞株的生长。对其作用原理进行研究后发现，显抑制该细胞株的生长。对其作用原理进行研究后发现，CaMCaM基因的表达产物作为细胞内信号传导系统的重要物质，基因的表达产物作为细胞内信号传导系统的重要物质，明显增加了肿瘤细胞对长春新碱或长春花碱的吸收量而相明显增加了肿瘤细胞对长春新碱或长春花碱的吸收量而相应减少了排出量，从而提高了肿瘤细胞内化疗药物浓度，应减少了排出量，从而提高了肿瘤细胞内化疗药物浓度，导致肿瘤
42、细胞死亡。导致肿瘤细胞死亡。为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可以考为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可以考虑将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化疗药物虑将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。增加，从而达到增强化疗效果的目的。(2)(2)耐药基因治疗耐药基因治疗 在解决化疗所致骨髓细胞造血功能受到严重抑制的在解决化疗所致骨髓细胞造血功能受到严重抑制的问题方面，通过向肿瘤患者的骨髓细胞导入某种耐药基问题方面，通过向肿瘤患者的骨髓细胞
43、导入某种耐药基因，如因，如mdr-1mdr-1基因等，以增强骨髓细胞的抗药性，以便耐基因等，以增强骨髓细胞的抗药性，以便耐受大剂量的化疗药物，以达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。受大剂量的化疗药物，以达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。目前除了开发针对肿瘤细胞耐药性产生机制的拮抗剂，目前除了开发针对肿瘤细胞耐药性产生机制的拮抗剂，如用于阻断如用于阻断P-P-糖蛋白所引发多药耐药的戊脉安（糖蛋白所引发多药耐药的戊脉安（verapamilverapamil）和用于阻断和用于阻断GSHGSH合成的丁硫氨酸亚砜胺（合成的丁硫氨酸亚砜胺（BSOBSO）等。还）等。还采用基因干扰技术，在基因水平阻断耐药基因的表达，采用
44、基因干扰技术，在基因水平阻断耐药基因的表达，使肿瘤细胞丧失多药耐药性，从而易于被化疗药物杀死。使肿瘤细胞丧失多药耐药性，从而易于被化疗药物杀死。（三）病毒性疾病的基因治疗研究三）病毒性疾病的基因治疗研究 据统计，据统计，75%75%的人类传染病是由病毒引起的。病毒的人类传染病是由病毒引起的。病毒感染人体后不仅可能急性发病，还可以在人体内长期潜伏，感染人体后不仅可能急性发病，还可以在人体内长期潜伏，造成终身伤害。病毒还是造成先天畸形的重要因素之一。造成终身伤害。病毒还是造成先天畸形的重要因素之一。研究表明，它与某些癌症、自身免疫性疾病和内分泌疾病研究表明，它与某些癌症、自身免疫性疾病和内分泌疾病
45、也存在一定的联系。迄今为止，临床上对绝大多数病毒感也存在一定的联系。迄今为止，临床上对绝大多数病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治疗手段，而在众多开展的抗病染性疾病仍然缺乏有效的治疗手段，而在众多开展的抗病毒治疗方案中，抗病毒基因治疗十分引人注目。毒治疗方案中，抗病毒基因治疗十分引人注目。1 1调节机体免疫应答调节机体免疫应答 （1 1）将细胞因子）将细胞因子(如干扰素、白细胞介素等如干扰素、白细胞介素等)的基因，导的基因，导入机体免疫细胞，激活免疫细胞并促进其增殖分化，增入机体免疫细胞，激活免疫细胞并促进其增殖分化，增强机体的细胞和体液免疫应答，促进机体清除病毒感染强机体的细胞和体液免疫应答，促进
46、机体清除病毒感染细胞和游离病毒。细胞和游离病毒。（2 2）将能够诱导机体产生保护性免疫应答的病毒抗原基）将能够诱导机体产生保护性免疫应答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，导入机体，表达因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，导入机体，表达的抗原不仅可以诱导机体产生保护性抗体，还可以引发的抗原不仅可以诱导机体产生保护性抗体，还可以引发特异性的细胞免疫应答，产生对野生致病病毒攻击的防特异性的细胞免疫应答，产生对野生致病病毒攻击的防御作用。御作用。2 2抗病毒复制：抗病毒复制：（1 1）抑制病毒与宿主细胞结合：即阻断病毒表面抗原）抑制病毒与宿主细胞结合：即阻断病毒表面抗原决定簇与宿主细胞受体间
47、的特异性结合。决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。（2 2）干扰病毒基因组的转录起始和调控。）干扰病毒基因组的转录起始和调控。（3 3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。（4 4）RNARNA干扰技术。干扰技术。（5 5）将抗病毒蛋白质基因，如）将抗病毒蛋白质基因，如2 255腺苷酸合成酶等基腺苷酸合成酶等基 因，导入机体细胞并持续表达，可以激活核酸酶因，导入机体细胞并持续表达，可以激活核酸酶F F，降解，降解病毒病毒RNARNA，对，对RNARNA病毒的感染产生明显的抵抗作用。病毒的感染产生明显的抵抗作用。根据病毒在机体细胞中复制周期的各个环节来设计的，根
48、据病毒在机体细胞中复制周期的各个环节来设计的，主要包括：主要包括：基因治疗的问题与展望基因治疗的问题与展望l 治疗基因调控元件的选择；治疗基因调控元件的选择；l 安全高效载体的构建和转移技术的选择；安全高效载体的构建和转移技术的选择；l靶细胞的选择。靶细胞的选择。华东理工大学华东理工大学2010201020112011学年第学年第1 1学期学期 高分子药物载体高分子药物载体课程论文课程论文 2010.102010.10班级 学号 姓名 开课学院 材料学院 任课教师 张琰 成绩 论文题目：(1)综述纳米技术在高分子药物载体系统构建中的应用；(2)综述高分子材料在基因药物载体系统中的研究进展；(3)综述抗肿瘤药物载体系统的研究进展论文要求：任选一题，根据论文题目，通过查阅文献资料，内容能够反映教师要求，举例恰当，论文格式符合规范（参见华东理工大学学报）。2000字左右。包括中文摘要、关键词、正文和参考文献。不可以整篇抄袭，如果抄袭，论文以零分计。教师评语：评分项目 各项分值 得分内容与要求的吻合情况 （5）摘要 （10）关键词 （5）综述内容 （50）正文组织结构 （15）参考文献及标注 （15）教师签名 2010年 月 日 论文提交邮箱：论文提交截止时间：2010年11月30日
