1、酶工程复习1.生物酶工程：在化学酶工程基础上发展起来的，以酶学理论和以DNA 重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，又称为高级酶工程2、化学酶工程、研究的主要内容：又为初级酶工程，是酶学理论与化学工程技术相结合的产物。主要研究内容：酶的工艺制备、酶和细胞的固定化技术、酶分子化学修饰、人工酶的合成、酶反应器和酶传感器、酶的应用等。3如何控制发酵产酶工艺条件：a. pH 调节办法：改变培养基组成或其比例；使用缓冲剂； 添加适宜的酸碱溶液以调节pH 值。b.温度调控的方法：一般采用热水升温、冷水降温；在发酵罐中，均设计有足够热传面积的热交换装置，如排管、蛇管。c.溶氧量调控的方法：调节通气量
2、、调节氧的分压、调节气液接触时间、调节气液接触面积、培养液的特性对溶氧速率有明显影响，若培养物粘度大，则不利于溶氧。 4酶生物合成模式包括哪些类型？各类型有何特点？如何提高各种模式下酶产量？各产酶模式的一般产酶动力学方程是怎样的？a. 同步和成型：又称生长偶联型，酶的合成与细胞生长同步进行，当细胞进入对数生长期， 酶大量产生，细胞生长进入平衡期后，酶合成随即停止。其方程为：dE/dt=X 特点：此类型生产的酶，其生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。这类酶相应的 mRNA 是很不稳定的。提高酶产量：增加细胞生长速率，提高mRNA 稳定性，降低发酵温度。b. 延续合成型：部分生长
3、偶联型，酶的合成伴随细胞生长开始，但在细胞生长进入平衡期后， 酶还可以延续合成较长的一段时间。其方程：dE/dt=X+X 特点：延续合成型的酶可受诱导但不受分解代谢物阻遏和产物阻遏，其对应的mRNA 很稳定。提高酶产量：最理想模式，添加诱导物。c. 中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期后，酶的合成也随即停止。其方程：dE/dt=X特点：此类型合成的酶，受反应产物反馈阻遏， 其对应的mRNA 是不稳定的。提高酶产量：增加细胞生长速率，提高mRNA 稳定性，解除阻遏。d. 滞后合成型：当细胞生长进入平衡期后，酶才开始大量合成。其方程：dE/dt=X 特点： 此类
4、型合成的酶，受分解代谢物阻遏，故在对数生长期不合成，但其mRNA 稳定性强，当细胞停止生长，分解代谢物阻遏解除，才开始利用积累的mRNA 进行翻译合成。提高酶产量：减少阻遏物浓度，尽量降解产生的阻遏物。5. 提高酶产量的方法有哪些？A.要选育或选择使用优良的产酶细胞。B.打破调控机制。C 添加表面活性剂、酶促进剂、诱导物。6. 在发酵产酶中，溶氧速率受哪些因素的影响？a.通气量：当通气量增大时可提高溶氧速率，反之使溶氧速率降低。b.氧的分压：增加空气压力，或提高空气中氧的含量都能提高氧的分压，从而提高溶氧速率。反之则使溶氧速率降低 c.气液接触时间：气液两相接触时间延长，可使更多的氧溶解，从而
5、提高溶氧速率；反之则使溶氧速率降低。d.气液接触时间：增加气流接触界面的面积，有利于提高溶氧率。e.培养物的特性：培养液的粘度大，产生气泡多，则不利于氧的溶解。通过改变培养液的组分或浓度，可有效地降低培养液粘度 7影响酶提取的主要因素有哪些？a.温度：通常抽提温度应控制在 0-10，对某些耐温的酶，如胃蛋白酶等，可以适当提高抽提温度。b.pH 值：抽提液的pH 值应远离酶的等电点， 不宜过高或过低。c.提取液体积：增加提取液用量，可提高提取率。d.添加保护剂：为了提高酶稳定性，防止酶变性、失活等常加入一些保护剂。 8常用的细胞破碎的方法主要有哪些？a.机械破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用
6、， 使细胞破碎的方法，称为机械破碎法。包括：机械捣碎法、研磨法、匀浆法。b.物理破碎法：通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的办法，包括：温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法。c.化学破碎法：利用各种化学试剂与细胞膜的作用，使细胞膜结构改变而破碎的方法。包括：有机试剂、表面活性剂。d.酶学破碎法：在一定条件下， 通过外加的酶或细胞自身存在的酶的作用，包括：外加酶处理、自溶法。9、利用沉淀技术分离制备酶有哪些方法？沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，与其他溶质分离。方法：a.盐析沉淀法：根据球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子
7、升高而增加，表现为盐溶，而随着盐浓度继续升高，并超出某一上限时，其溶解度又会以不同速度下降，表现为盐析。由于酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中，其溶解度存在差别而建立的一种纯化方法。最常用的盐析盐为（NH4)2SO4 b.等电点沉淀法：两性电解质在等电点时，溶解度最低，而不同的两性电解质使不同等电点，由此可将酶纯化。c.有机溶剂沉淀法：利用不同蛋白质在有机溶剂中溶解度不同而使之分离的方法。d.复合沉淀法（选择性沉淀法）：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀，再用适当方法把酶从复合物中重新析出。e.选择性变性沉淀法：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀而不影响所在的酶，从而使酶与杂质
8、分离。10利用蛋白质的等电点不同可以选择哪些技术将蛋白质分离？等电聚焦，等电点结晶，等电点沉淀，层析聚焦11、什么是分子筛凝胶层析？又称凝胶过滤、分子排阻层析，是以多孔凝胶为固定相利用溶液中酶与其他杂质分子大小不同而进行的分离技术。12. 什么是膜分离技术？借助一定口径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状、不同特性的物质颗粒或分子分离的技术，统称为膜分离技术。13. 什么是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳？其原理及用途是什么？指在聚丙烯酰胺凝胶制备时， 加入 12%的十二烷基硫酸钠（SDS），制成 SDS-聚丙烯胺凝胶进行电泳。原理：当蛋白质溶液中加入 SDS 和硫基乙醇（一种还原剂）以后，硫基乙
9、醇使蛋白质中的二硫键还原，SDS 使蛋白质的共价键破坏，使多亚基的蛋白质解离成各个亚基，在一定条件下1.4g SDS 与 1g 蛋白质或亚基结合形成 SDS-蛋白质复合物。由于 SDS 阴离子带负电荷，SDS-蛋白质复合物上就结合了大量阴离子，掩盖了蛋白质之间原来的电荷的差别。而 SDS 与蛋白质结合后， 引起蛋白质构象的变化，在水溶液中都变成长椭圆形，为此， SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中迁移率不再受到其原有电荷和分子形状影响，而只决定于蛋白质的分子量。用途：SDS- 凝胶电泳主要用于测定蛋白质的分子量。14. 亲和层析技术的原理是什么？ 亲和层析是利用生物分子之间所具有的专一而又可逆的亲
10、和力，使生物分子分离纯化的技术。原理：酶与底物（包括辅助因子）、底物类似物或其竞争性抑制剂之间都具有较高的生物亲和力，能专一而可逆地形成酶-配基络合物。因此， 将这类配基偶联固定于载体作为固定相时，含有待纯化酶的溶液流经该固定相，该酶就能迅速而有选择性地与相应配基结合，而其他杂质流出固定相，从而达到纯化该酶的目的。 15.何谓酶分子修饰？通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程，称为酶分子修饰。16. 酶分子修饰有哪些方法？分别有哪些修饰剂？a.金属离子置换修饰：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。通常都是二价金属离
11、子，如Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。金属离子置换修饰只适用于本来结构中含有金属离子的酶。b.大分子结合修 饰：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细改变，从而改变酶的特性与功能的方法，常用修饰剂：右旋糖酐，聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等。修饰剂在使用前一般需经活化。c.有限水解修饰：肽链的水解在限定的肽键上进行，称为肽链有限水解，利用肽链有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，常用修饰剂：各种专一性较强的蛋白酶或肽酶 d.酶蛋白侧链基团修饰：酶蛋白侧链基团修饰是指用各种小分子化合物对酶蛋白的AA
12、残基上的侧链功能基团进行修饰，使这些基团发生改变，从而引起次级键的变化，使蛋白质空间结构发生变化，导致酶的功能与特性的改变。常用修饰剂：氨基修饰剂、羧基修饰剂、胍基修饰剂、巯基修饰剂e.氨基酸置换修饰：酶蛋白多肽链特定位置上的各种 AA，是酶化学结构和空间结构基础，若将肽链上某AA 换成另外的 AA，则会引起酶蛋白空间构象某些改变 f.物理修饰：通过各种物理方法， 使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。17. 什么是固定化酶和固定化细胞？固定化酶：固定在载体上，并在一定空间内进行催化 反应的酶。固定化细胞：固定在载体上，并在一定空间范围内进行生命活动的细胞。 18常
13、用的酶和菌体固定化的方法有哪些？A.吸附法：通过载体表面和酶分子表面之间的氢键、疏水键和-电子亲和力等物理作用力， 将酶固定于不溶性载体的方法，称为物理吸附法，简称吸附法。b.包埋法：将酶或含酶菌体包埋于各种多孔载体中，使酶固定化的方法，称为包埋法。c.结合法:选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键，与酶结合在一起的固定化方法，称为结合法。d.交联法：利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。e.热处理法将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。19、酶固定化后其性质都有哪些变化？为
14、什么？酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会影响酶原有的性质。如微环境的化学组成，与酶相结合的表面结构，底物进入与底物排出微环境的速度，微环境的局部pH 等。稳定性：固相酶的稳定性比游离酶高。热稳定性；对蛋白酶水解作用稳定性； 对变性试剂作用的稳定性；保藏稳定性；最适温度：固相酶的最适温度一般比天然酶高，个别会有所降低；同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同。最适 pH：a.载体性质对最适pH 影响：用带负电荷载体制备的固定化酶，最适pH 比游离酶最适 pH 高；用带正电荷载体制备的固定化酶，最适pH 比游离酶
15、最适 pH 低；用不带电荷载体制备的固定化酶，最适 pH 一般不改变。b.产物性质对最适 pH 影响；若酶催化反应产物为酸性时，固定化酶最适pH 比游离酶的最适pH 要高。若酶催化反应产物为碱性时，固定化酶最适 pH 比游离酶的最适 PH 要低。若酶催化反应产物为中性时，固定化酶最适pH 不变。底物特异性：固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一般为：作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。20. 什么是酶传感器？是由固定化酶与能量转换器密切结合而成的传感器装置，是生物传 感器的一种，已广泛用于临床诊断、工业发
16、酵、环境监测等。21. 用交联法如何制备固定化酶？利用戊二醛两个醛基都可与酶蛋白分子的游离氨基反应， 形成 Schiff 碱，从而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。将酶吸附于载体上， 或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定化酶“网”膜或“网”颗粒。这种方法又称为双重固定化法。 22分离制备碱性磷酸酶采用何种方法？分离的原理及主要的操作流程是什么？本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀浆中分离纯化碱性磷酸酶（AKP）。先用醋酸钠（低渗破膜作用）制备肝匀浆。醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后以出去杂蛋白。含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷
17、乙酸进行反复分离纯化。根据 AKP 在 33%的丙酮或 30%的乙醇中溶解，而在 50%的丙酮或 60%的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙酸重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。23. 如何测定酶作用的最适温度,最适pH 以及其可逆抑制剂对酶抑制作用的类型?一般的试验方法是在一定条件下先将酶在不同的温度下处理一段时间，迅速降温，然后再在一定温度条件下测定酶活力。以处理温度为横座标，酶反应速度为纵座标作图。可得到酶的热稳定曲线，根据这条曲线即可求出酶的热稳定范围一般的试验方法是将酶液分成若干份，分别置于一系列不同的pH 的溶液中保温处理一定时间，然后再调至某一标准的p
18、H 或直接在最适pH 条件下进行活力测定。以处理的pH 值为横座标、反应速度为纵座标作图。可得到酶的酸碱稳定性曲线，由此即可求出酶的酸碱稳定范围。添加抑制剂，以反应速度倒数1/V 或 1/A510作纵座标，以底物浓度倒数1/S为横座标，作图，观察直线在纵轴和横轴上的交点位置并计算其 K 值，与未加抑制时的 K 值比较。说明mm该抑制剂属于何种类型。竞争抑制 km 增大，vm 不变,非竞争抑制是km 不变，vm 减小。反竞争是两者都发生了变化24. 用固定化L-氨基酸酰化酶可生产什么产品？生成L-氨基酸。将化学合成的 N-酰基-DL-氨基酸经 L-氨基酸酰化酶进行不对称水解，L酰基氨基酸被水解生
19、成L-氨基酸，余下的 N-酰基-D-氨基酸经化学消旋再生成DL-酰基氨基酸，重新进行不对称水解。反复进行，可将 DL-酰基氨基酸几乎都变成 L-氨基酸。工业上已用固定化 L-氨基酰化酶连续生产L-苯丙氨酸和L-色氨酸。25. 酶在食品、医药、及分析检测方面有哪些用途？食品：应用于食品工业的酶制剂、酶法生产葡萄糖、果葡糖浆的生产、饴糖的生产、酶在蛋白制品加工中的应用、酶在果蔬加工中的应用、酶在改善食品品质与风味中的应用医药：a.主要的医药用酶：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等；b.用酶进行疾病的诊断：一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测定体内某些物质的含量， 从而诊断某些疾病；c.用酶治疗各种疾病：蛋白酶、溶菌酶等d.用酶制造各种药物：利用酶的催化作用将前体物质转变为药物；e.分析检测：利用酶催化作用的高度专一性对物质进行检测，巳成为物质分析检测的重要手段。
