1、血涂片制备与染色血涂片制备与染色1【目的】掌握血涂片的制备和染色方法。【原理】将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。用含天青B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。2实验用品实验用品器材器材:一次性采血一次性采血针、消毒液、消毒棉签、针、消毒液、消毒棉签、洁净载洁净载玻玻片片 、推片、推片试剂试剂:Wrights:W
2、rights（瑞氏）染液（瑞氏）染液3【操作】1采血 2制作涂片 3干燥涂片 4标记涂片 5染色 6观察结果4部位：WHO推荐中指或无名指尖内侧为宜，耳垂采，耳垂采血受温度影响大；半岁以下拇指或足部，特殊人血受温度影响大；半岁以下拇指或足部，特殊人员视情况而定。员视情况而定。采血步骤及注意事项：应严格实行一人一针制；采血步骤及注意事项：应严格实行一人一针制；穿刺的深度的适当，切忌用力挤压，以免混入组穿刺的深度的适当，切忌用力挤压，以免混入组织液，影响检验结果。用消毒干棉球擦去第一滴织液，影响检验结果。用消毒干棉球擦去第一滴血，以后流出的血液可以使用。血，以后流出的血液可以使用。皮肤采血法（毛细
3、血管采血法）皮肤采血法（毛细血管采血法）5 涂片技术是制备血液样品最常用的技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，染色后可对血液中各种细胞形态进行形态观察、细胞计数、细胞大小测量等工作。6血涂片制备血涂片制备推片载玻片血液一张满意的血涂片应厚薄均匀 头 体 尾鲜明涂片干燥后用铅笔在血涂片的头部写上姓名和编号李四B 1 2 37方法与步骤方法与步骤1 1：采血，挤出第二滴血置于载玻片的右侧：采血，挤出第二滴血置于载玻片的右侧82.2.再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘，先再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状。向后稍移动轻轻触及
4、血滴，使血液沿玻片端展开成线状。9103045两玻片的角度以30-45为宜，轻轻将双凹片向前匀速推进，即涂成血液薄膜。113.3.成片，干燥成片，干燥一张满意的血涂片应厚薄均匀 头 体 尾鲜明李四12 血涂片质量评价血涂片质量评价均匀、厚薄、头体尾、边缘、两侧均匀、厚薄、头体尾、边缘、两侧注意：血滴大，速度快、角度大注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚血膜厚一张良好血涂片的标准是：厚薄适宜、头体尾分一张良好血涂片的标准是：厚薄适宜、头体尾分明、细胞分布均匀、边缘整齐、两侧及两头留有明、细胞分布均匀、边缘整齐、两侧及两头留有空隙，血膜长度约空隙，血膜长度约4 4厘米。厘米。13不良血涂片不良血涂
5、片144.4.标记标记涂片干燥后用铅笔在血涂片的头部写上姓名和编号李四123155.5.血涂片染色血涂片染色勿冲洗再加勿冲洗再加瑞氏染色瑞氏染色液液5-8滴后将滴后将液和液和液充分混匀静置液充分混匀静置10分钟分钟直接流水冲洗至无浮色（切勿先倒掉染液）涂片经水洗干燥后用油镜分类计数100个白细胞李四李四123123涂片干燥后加瑞氏染色涂片干燥后加瑞氏染色液液5-8滴滴覆盖整个血膜覆盖整个血膜1分钟分钟16瑞氏染色原理瑞氏染色原理 细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的和作用，各种细胞成分化学性质不同，对
6、各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为粉红色，称为嗜酸性物质嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为称为嗜碱性物质嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为均可结合，染淡
7、紫色，称为中性物质中性物质。17 图图 瑞氏染色原理示意图瑞氏染色原理示意图 18瑞氏瑞氏-吉姆萨染色吉姆萨染色【原理原理】将瑞特染料和吉姆萨染料按一定比例混合将瑞特染料和吉姆萨染料按一定比例混合后对细胞进行染色，其染色原理同瑞特和吉姆后对细胞进行染色，其染色原理同瑞特和吉姆萨染色法，但染色效果更佳，因为其综合了瑞萨染色法，但染色效果更佳，因为其综合了瑞士和吉姆萨染色法的优点。士和吉姆萨染色法的优点。19【方法学评价方法学评价】瑞氏染液和吉姆萨染液对细胞进行染色时有瑞氏染液和吉姆萨染液对细胞进行染色时有各自的显色特征，前者对细胞质和颗粒着色较好，各自的显色特征，前者对细胞质和颗粒着色较好，后者
8、对细胞核结构显示清晰。因此将二者结合，后者对细胞核结构显示清晰。因此将二者结合，能取长补短、集中优势，用该混合染液对血细胞能取长补短、集中优势，用该混合染液对血细胞进行染色，其细胞核、细胞质和细胞内颗粒均着进行染色，其细胞核、细胞质和细胞内颗粒均着色鲜艳，对比鲜明。瑞氏色鲜艳，对比鲜明。瑞氏-吉姆萨混合染色法是临吉姆萨混合染色法是临床上广泛使用的方法。床上广泛使用的方法。20染色步骤 A、待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴Wrights染液盖满血膜为止，染色1 min。B、滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10分钟。C、用流水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。21【质量控制质量控制】血膜要干透后
9、才能染色，否则染色时易脱落血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落.染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好。般染液淡、染色时间长些效果好。染液不能过少，以防蒸发沉淀。染液不能过少，以防蒸发沉淀。冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防止染料冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防止染料沉着。冲洗时间也不能长。沉着。冲洗时间也不能长。染色过淡，可复染。染色过淡，可复染。染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色。染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色。22【染色结果评价染色结果评价】正常情况：血膜外观呈淡琥珀色。在显微镜下红细胞染正
10、常情况：血膜外观呈淡琥珀色。在显微镜下红细胞染成粉红色，在厚薄均匀处略有碟状感。白细胞胞质中的颗成粉红色，在厚薄均匀处略有碟状感。白细胞胞质中的颗粒能显示出各种细胞的特有色彩，细胞核染紫红色，核染粒能显示出各种细胞的特有色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。色质结构清楚。染色环境偏酸：则红细胞和嗜酸性颗粒偏红，白细胞核染色环境偏酸：则红细胞和嗜酸性颗粒偏红，白细胞核呈浅蓝色或不着色，染色过酸呈浅蓝色或不着色，染色过酸pH3.5pH3.5时，则呈现一片红色，时，则呈现一片红色，白细胞中除嗜酸性颗粒外均不着色。白细胞中除嗜酸性颗粒外均不着色。染色环境偏碱：则所有细胞呈灰蓝色，微偏碱者红细胞染色环
11、境偏碱：则所有细胞呈灰蓝色，微偏碱者红细胞暗红、白细胞颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色甚至黑暗红、白细胞颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色甚至黑紫色或蓝色。中性颗粒也偏粗染成紫黑色，血膜过厚的地紫色或蓝色。中性颗粒也偏粗染成紫黑色，血膜过厚的地方呈绿色。方呈绿色。236.6.血涂片的观察血涂片的观察低倍镜观察1.染色情况(满意、偏酸、偏碱）2.细胞分布情况油镜下分类计数：体尾交界处。油镜分类时应按一定走向，不要重复计数。（共计数100个白细胞）李四李四12312324体尾交界处体尾交界处理想区理想区域域 细胞重叠细胞重叠 细胞太稀细胞太稀理想区域理想区域25各类成熟白细胞的形态学：各类成熟白细胞
12、的形态学：q中性粒细胞（中性粒细胞（NeNe）：在瑞氏染色血涂片上呈圆形，直）：在瑞氏染色血涂片上呈圆形，直径径101013m13m，胞浆染粉红色，核形一叶（杆状核）至，胞浆染粉红色，核形一叶（杆状核）至五叶不等，以三叶者多见，染成深紫红色，胞浆中有五叶不等，以三叶者多见，染成深紫红色，胞浆中有许多细小均匀紫红色颗粒。许多细小均匀紫红色颗粒。26q嗜酸性粒细胞（嗜酸性粒细胞（EoEo）：较中性粒细胞稍大，胞核多）：较中性粒细胞稍大，胞核多为两叶，呈眼镜、八字形，核染色质粗糙染深紫红为两叶，呈眼镜、八字形，核染色质粗糙染深紫红色，胞浆内充满粗大均匀的嗜酸性颗粒，瑞氏染色色，胞浆内充满粗大均匀的嗜
13、酸性颗粒，瑞氏染色时呈桔红色，有折光性。时呈桔红色，有折光性。27q嗜碱性粒细胞（嗜碱性粒细胞（BaBa）：）：胞浆胞浆中含有大小不等的中含有大小不等的嗜碱嗜碱性颗粒性颗粒，瑞氏染色时呈，瑞氏染色时呈兰黑色兰黑色。于光学显微镜下常。于光学显微镜下常见胞浆中有小空泡，乃因嗜碱性颗粒易溶于水或因见胞浆中有小空泡，乃因嗜碱性颗粒易溶于水或因功能活动而脱颗粒所致；功能活动而脱颗粒所致；核核呈呈淡紫红色常看不清淡紫红色常看不清，呈杆状或分叶状。呈杆状或分叶状。28q淋巴细胞（淋巴细胞（LyLy）：胞体呈圆形，直径介于）：胞体呈圆形，直径介于6 615m15m之间，之间，在成人血涂片中以小淋巴细胞为多见，
14、直径在成人血涂片中以小淋巴细胞为多见，直径6 69m9m，核大呈深紫色致密而浓染，胞浆量极少；大淋巴细胞核大呈深紫色致密而浓染，胞浆量极少；大淋巴细胞胞浆量较多，呈清澈的淡蓝色，可见少量嗜苯胺蓝颗胞浆量较多，呈清澈的淡蓝色，可见少量嗜苯胺蓝颗粒，胞核圆或椭圆，常偏向细胞一侧，染色较深。粒，胞核圆或椭圆，常偏向细胞一侧，染色较深。29q单核细胞（单核细胞（MoMo）：在瑞氏染色涂片上为）：在瑞氏染色涂片上为121220m20m，胞，胞体圆形、椭圆形或不规则形；核形多种多样，最重要体圆形、椭圆形或不规则形；核形多种多样，最重要的特点是染色质较细致疏松，呈丝网状或条缕状，着的特点是染色质较细致疏松，呈丝网状或条缕状，着色较淡胞浆较多，淡兰色，含大量细小尘土样颗粒。色较淡胞浆较多，淡兰色，含大量细小尘土样颗粒。30中性粒细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞淋巴细胞淋巴细胞嗜碱性粒细胞（右）嗜碱性粒细胞（右）单核细胞单核细胞血小板血小板31谢谢！32
