1、动物细胞生物学动物细胞生物学实验技术实验技术主主 要要 内内 容容第一节第一节 培养细胞的生物学培养细胞的生物学第二节第二节 细胞培养基本实验室操作细胞培养基本实验室操作第三节第三节 细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术第二节、细胞培养第二节、细胞培养主主 要要 内内 容容（一）细胞培养所需条件（一）细胞培养所需条件（二）细胞培养所需用品（二）细胞培养所需用品（三）细胞培养液（三）细胞培养液（四）细胞的原代、继代培养（四）细胞的原代、继代培养（五）细胞的冻存和复苏（五）细胞的冻存和复苏（六）细胞污染（六）细胞污染（一）细胞培养所需条件（一）细胞培养所需条件 1 营养需要营养需要 2 细胞的生存
2、环境细胞的生存环境 温度温度:37 O2 CO2:5%CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-pH:7.2-7.4 渗透压渗透压 湿度湿度 3 无污染无污染 4 无毒无毒（二）细胞培养所需用品：（二）细胞培养所需用品：无菌间、超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸，紫外灯 CO2培养箱 倒置显微镜 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管1 1超净工作台超净工作台(Hood):A.水平流超净工作台水平流超净工作台(Horizontal air flow)B.垂直流超净工作台垂直流超净工作台(Lateral air flow)水平流超净工作
3、台背送风，但病毒是不实用的，容易对人有害垂直流超净工作台超净工作台的清洁维护：超净工作台的清洁维护：保持工作台上无死角，让空气得到充分过滤，即试验完毕后，将所有的用品收藏起来，工作台上只留有酒精灯及橡皮头。工作前和工作完毕都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培养液等物，实验结束后应先用水擦，然后用酒精再擦。还需定期检测工作台滤器过滤的效率。整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速正正 确确 错错 误误接种过程中尽可能达到悬空要求接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染正正 确确 错错 误误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正正 确确 错错 误误瓶盖朝上放，接种完
4、毕后立即盖好瓶口瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正正 确确 错错 误误2，CO2培养箱培养箱CO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37，100%湿度，湿度，5CO2。使用使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题培养箱培养细胞时应注意的问题 用用螺旋口瓶螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖培养细胞时，需将瓶盖微松微松，以保证通气。，以保证通气。保持培养箱内保持培养箱内空气干净空气干净。定期消毒定期消毒（90，14 h)。箱内箱内灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水，毫升蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。发。湿度以第二天第湿度以第二天第一次开门，能看一次开门，能看到
5、玻璃门上的水到玻璃门上的水珠珠3 3消毒设备：消毒设备：A.A.高压消毒锅（高压消毒锅（AutoclaveAutoclave）：）：110 110 C C，15 lb15 lb，20 20 分钟，分钟，适合于橡皮、纸、布、塑料制品和液体（适合于橡皮、纸、布、塑料制品和液体（9 lb9 lb，10 10 分钟）等。分钟）等。消毒后必须在烤箱中低温烤干。消毒后必须在烤箱中低温烤干。B.B.干热消毒箱：干热消毒箱：150-200 150-200 C C，2-32-3小时。小时。适合于玻璃器皿、金属器械等。适合于玻璃器皿、金属器械等。C.C.酒精消毒酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、动物皮毛解剖器械、塑料
6、器皿、动物皮毛 等，酒精浓度为等，酒精浓度为75759595。D.Co 60D.Co 60：放射性同位素：放射性同位素高压消毒锅高压消毒锅 D.D.滤膜过滤：滤膜过滤：正压过滤正压过滤:负压过滤：负压过滤：滤膜孔径为滤膜孔径为0.22m0.22m，为延长滤膜寿命可同时添，为延长滤膜寿命可同时添加加0.45 m0.45 m和和1.2 m 1.2 m 滤膜。滤膜。滤 膜 滤 器两种：1，一次性滤器；2，买滤膜自己装（需要消毒）4.4.蒸馏器与去离子纯水系统：蒸馏器与去离子纯水系统：1 1）用三蒸水，通过去离子纯水）用三蒸水，通过去离子纯水 系统，电阻需达到系统，电阻需达到170170万欧姆万欧姆以
7、上。以上。2 2）专门的去离子水系统）专门的去离子水系统5.5.倒置相差显微镜：倒置相差显微镜：需用需用相差镜头相差镜头和和滤光片滤光片，集光器的选择应与接物镜，集光器的选择应与接物镜的放大倍数一致。的放大倍数一致。纯水系统纯水系统 倒置相差显微镜1，物镜朝上2，工作距离大3，相差干涉5，培养器皿，培养器皿培养板与培养瓶培养板与培养瓶5，恒温水浴箱，血，恒温水浴箱，血清灭活，细胞解冻清灭活，细胞解冻6，移液管，移液管7 7，低速离心机，低速离心机RPMI-1640RPMI-1640（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-高糖高糖（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-低糖（标准型）、低
8、糖（标准型）、McCoys 5AMcCoys 5A、M199M199、F12F12等等Gibco干粉培养液液体培养液1，培养在使用之前需要加入的成分：血清、Na2CO3,丙酮酸钠、抗生素等Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根据需要的量进行分装，避免反复冻融，血清保存要放置20培养液的选择培养液的选择没有一定的标准，有几点建议可供参考没有一定的标准，有几点建议可供参考 选择培养选择培养这种细胞这种细胞首选的培养液。可以查阅参考文献，或在购买细首选的培养液。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。胞株时咨询。其它实验室其它实验室惯用的培养液惯用的培养液不妨一试，许多培养液可以适合
9、多种细胞。不妨一试，许多培养液可以适合多种细胞。用用多种培养液多种培养液培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。方法，但比较繁琐。总之，首选总之，首选MEM做粘附细胞培养、做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（培养基（SFM）。）。血清使用注意事项血清使用注意事项1.1.血清必须贮存于血清必须贮存于20 2
10、0 -70-70，若存放于，若存放于44，请勿超过一个月。，请勿超过一个月。1.1.血清血清解冻步骤解冻步骤(逐步解冻法逐步解冻法):-20):-20或或7070至至44冰箱冰箱溶解一天，至溶解一天，至室温室温下全溶后再分装。在溶解过程中须下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀规则摇晃均匀(小心勿造成气小心勿造成气泡泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由2020直接至直接至3737解冻，因温度改变太大，容易造成解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结蛋白质凝结而发生沉淀。而发生沉淀。1.1.热灭活（热灭活（heat-inactivati
11、onheat-inactivation）是指）是指56,30 56,30 分钟分钟加热已完全解冻之加热已完全解冻之血清。目的是使血清中之血清。目的是使血清中之补体成份补体成份(complement)(complement)去活化。除非必须，去活化。除非必须，一般不建议作此热处理一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物显著增多，且会影响血清，因为会造成沉淀物显著增多，且会影响血清之品质。之品质。1.1.勿将血清置于勿将血清置于3737太久，若在太久，若在3737放置太久，血清会变得混浊，同时放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较血清中许多较不稳定之成份不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之
12、品质亦会因此受到破坏，而影响血清之品质补体系统原指血清中引起免疫性细胞溶解（抗体包裹细胞溶解）的不耐热因子；现指至少由20种截然不同的血清蛋白组成的完整功能相关系统。补体系统主要的功能是通過 在病原体表面的作用，破坏其细胞膜或者“调理”病原体表面供巨噬细胞吞食，此外还能引起发炎反应。加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibri
13、n)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000 rpm,5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此“微生物“，但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。血清沉淀物血清沉淀物
14、谷氨酰胺 脱掉氨基后，脱掉氨基后，L谷氨酰胺可作为培养细胞的谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源能量来源、参与参与蛋白质的合成蛋白质的合成和和核酸代谢核酸代谢。L谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解降解，但是确，但是确切的降解率一直没有最终确定。切的降解率一直没有最终确定。L谷氨酰胺的降解导致谷氨酰胺的降解导致氨的形成氨的形成，而氨对于一些细胞，而氨对于一些细胞具有毒性。具有毒性。谷氨酰胺 配制方法为：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装小瓶，-20-20保存保存，使用时可向100ml培养液
15、中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM l 由组织中分离细胞和细胞传代l 常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，单独或混合使用 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 主要作用：使细胞间的主要作用：使细胞间的蛋白质水解蛋白质水解，使细胞相互离散，使细胞相互离散 消化细胞时，加入一些消化细胞时，加入一些血清血清或含血清的培养液，能终止消或含血清的培养液，能终止消化作用化作用 EDTAEDTA4Na 4Na 溶液溶液 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为常用
16、工作液浓度为0.02%0.02%。注意：注意：使用使用EDTA EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的因残留的EDTA EDTA 会影响细胞生长会影响细胞生长（四）细胞的原代和传代培养（四）细胞的原代和传代培养 取材：取材：用用颈椎脱位法颈椎脱位法使使孕鼠孕鼠迅速死亡。迅速死亡。把把整个孕鼠整个孕鼠浸入盛有浸入盛有7575乙醇乙醇的烧杯中数秒钟的烧杯中数秒钟消毒消毒，取出后放在大平皿中携入，取出后放在大平皿中携入超净台超净台。用消过毒的剪刀用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开在躯干中部环行剪开皮肤，剖皮肤，剖腹取出腹取出子宫子宫置于无菌平皿中。置于无
17、菌平皿中。用消过毒的剪刀用消过毒的剪刀剪开子宫，剪开子宫，取出取出鼠胎，鼠胎，剪去剪去头、头、爪，爪，以以平衡盐溶液平衡盐溶液洗去血污洗去血污 切割：切割：用用PBSPBS将取出的将取出的组织块组织块清洗三次，清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎组织反复剪碎，直，直到成到成1mm1mm3 3左右的小块左右的小块，再用再用平衡盐溶液平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清上清 消化、接种培养：消化、接种培养：加入加入0.250.25胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化
18、液（5-105-10倍量倍量），与组织块混匀。），与组织块混匀。置置3737水浴，观察消化情况水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入静止，吸去上清，加入5 510ml10ml细胞培养液细胞培养液，用吸管吹打混匀，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养全量换液和半量换液全量换液和半量换液 换液时机的选择：细细 胞胞 换换 液液培养液培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多，质积累增多，pH值下降，营养液酸化变黄。值下降，营养液酸化变黄。
19、细胞状态细胞状态消化法传代培养步骤冷冻细胞注意事项冷冻细胞注意事项冻存液配制冻存液配制:现用现配，DMSO是易燃物冻存液体积冻存液体积：要小，0.5-1 ml冻存细胞数冻存细胞数：与正常传代细胞数目要相当，避免复苏后细胞传代比例发生变化冻存速度冻存速度：降温缓慢 4C，1030 min -20C，1-2 h -80C，1 hour 过夜 -196C，1-2 year 完善记录完善记录：冻存细胞名称，冻存日期，冻存人，存放位置，其它特殊信息等细胞冻存管，做好标记（六）细（六）细 胞胞 污污 染染 细菌污染 真菌污染 细菌和真菌的清除 支原体污染 支原体的清除细菌污染 细胞培养常见的污染细胞培养常
20、见的污染最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，培养液变混浊，pH改变改变。污染后细胞发生病理改变，污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落、增粗，最后变圆脱落死亡。死亡。真菌污染真菌污染 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。毒性作用而使细胞脱落死亡。白色念珠
21、菌（倒置显微镜下）中间长梭型的是正在分裂的念珠菌 细菌和真菌的清除细菌和真菌的清除 使用抗生素使用抗生素 抗生素对杀灭细菌较有效。抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。污染后清除用药需采用大于常用量污染后清除用药需采用大于常用量5 51010倍药物冲洗倍药物冲洗法，于加药后作用法，于加药后作用24244848小时，再换常规培养液。此小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。法在污染早期有效。9595以上是以下四种支原体：以上是以下四种支原体：口腔支原体（口腔支原体（
22、M.oraleM.orale）精氨酸支原体（精氨酸支原体（M.argininiM.arginini）猪鼻支原体（猪鼻支原体（M.hyorhinisM.hyorhinis）牛莱氏无胆甾原体（牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawiiA.laidlawii）危害：危害：世界性问题，平均发生率达到世界性问题，平均发生率达到11%11%能改变细胞的能改变细胞的DNA,RNADNA,RNA及蛋白表达及蛋白表达不能通过可视法对其进行检测不能通过可视法对其进行检测对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染来源：来源：操作环境不良操作环境不良操作人员的疏失操作人员的疏失实验
23、器具不洁等实验器具不洁等已受污染的细胞已受污染的细胞已受污染的培养基、血清已受污染的培养基、血清支原体污染支原体污染荧光染色法荧光染色法电镜检查：扫描电镜、透射电镜电镜检查：扫描电镜、透射电镜支原体培养支原体培养聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)法法支原体污染检测支原体污染检测细胞营养液常常仍清亮但变黄细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓，部分细胞发细胞生长变缓，部分细胞发生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。支原体污染表现支原体污染表现 支原体的清除支原体的清除 支原体清除剂MRA（Mycoplasma Removal Agent）处理法每4天换
24、一次液，连续处理15天 清洗纯化法细胞营养驯化优质细胞群的筛选细胞清洗反复离心洗涤 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限.如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。药物辅助高温处理法先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。支原体特异性血清法 用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。共培养通常是一类细胞需要另一种细胞提供营养或者物理支持小鼠胚胎干细胞细胞运输 1.保存在干冰
25、或液氮中运输；2.培养在瓶中:当细胞生长至50汇合，瓶中 充满培液，瓶口封紧，运输途中培养瓶最好 呈直立状。细胞带至培养室后，在确保无污 染的情况下立即开封，用酒精消毒瓶口和瓶 身，吸出多余的培养液后将培养瓶平躺在培 养箱内。吸出的培液置于无菌容器中,可用 于同一种细胞的培养。血清的作用 1.血清中含有许多营养物质许多营养物质如：蛋白、激素、生长因子、细胞因子、维生素等；2.血清是很好的缓冲系统缓冲系统；3含有转运蛋白，如转铁蛋白、铜蓝蛋白等；4含有贴壁因子贴壁因子或粘附蛋白如纤粘连蛋白、胎球蛋白等可 以帮助细胞贴壁；5对于重金属有重金属有解毒的作用。血清的缺点1.1.血清成分复杂成分复杂，不
26、利于从培液中提取产物提取产物；2.有些物质能干扰实验结果干扰实验结果，如受体和C3片段的检测；难以研究各种因子作用的机制;3.血清能促使成纤维细胞过量生长，故对上皮细胞培养不利;4.每批血清中成分不同每批血清中成分不同，可以影响实验的结果，包括贴壁率等；5.易污染支原体易污染支原体。无血清培养的优点1便于研究激素、生长因子、细胞因子、维生素等对细胞生长和分泌功能的作用及其作用机理包括信号通路等。2作为选择性培养基，便于从原代培养细胞中选择目的细胞类型和较纯的上皮细胞。3.消除不同批号引起实验结果的不一致。5基因工程和细胞工程产物的后处理简单。6用于追踪肿瘤细胞的扩散。7.细胞工程临床治疗中降低免疫排斥。使用无血清培养的注意事项 1 p H 缓 冲 系 统 不 如 含 血 清 者 佳，培 液 中 加 HEPES、细胞培养在CO2 培养箱中。2细胞经胰蛋白酶消化后需加入血清、BSA 或大豆胰蛋白酶抑制剂。3 细胞的冻存液中一般可添加血清。使用无血清培养的注意事项 5进行药物筛选实验时，用药量比含血清者 低十倍左右。6根据各种细胞不同要求添加贴壁因子和生 长因子，也可以将细胞先培养在含血清的 培养液中，待细胞贴壁后换成无血清培养 液；或将成系的细胞培养在不断降低血清 浓度的培养液中(每传5次降低一次血清浓 度10510.1)。
