1、波菜色素的提取和色素分离波菜色素的提取和色素分离extrction of pigments from spinach and chromagraphic isolation一、实验目的一、实验目的n1 1、通过绿色植物色素的提取和分离，、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；了解天然物质分离提纯方法；n2 2、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。理。二、实验原理二、实验原理n绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄
2、）等多种天然色素。（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。n叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素叶绿素 a(C55 H72O5N4Mg)和和叶绿素叶绿素 b(C 55H7O6N4Mg)，其差别，其差别仅是仅是 a 中一个甲基被中一个甲基被 b 中的甲酰基所取代。它们都中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素作用所必需的催化剂。植物中叶绿素 a 的含量通常的含量通常是是 b 的的 3 倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃
3、基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。性的溶剂。n胡萝卜素（胡萝卜素（C C4040H H5656 ）是具有长链结构的共轭多烯。是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即它有三种异构体，即 a-,-a-,-和和-胡萝卜素，胡萝卜素，其中其中-异构体含量最多，也最重要。在生物体异构体含量最多，也最重要。在生物体内，内，-体受酶催化氧化即形成维生素体受酶催化氧化即形成维生素 A A。目。目前前-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素素 A A 使用，也可作为食品工业中的色素。使用，也可作为食品工业中的色素。n
4、叶黄素（叶黄素（C C4040H H5656O O2 2 ）是胡萝卜素的羟基衍生物，是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。解度较小。NNNNMgCO2CH3CH2OCHH3CH3CRCH2CH3CH3CH2CH2COOCH3CH3CH3CH3CH3叶 绿 素 a(R=CH3)叶 绿 素 b(R=CHO)n本实验从菠菜中提取上述几各色素，并通过薄层层本实验从菠菜中提取上述几各色素，并通过薄层层析和柱层析进行分离析和柱层析进行分离 CH
5、3H3CRCH3CH3CH3CH3CH3RH3CCH3H3C-胡萝卜素（R=H）叶黄素（R=OH）CH2OH维 生 素 A三、主要仪器与试剂三、主要仪器与试剂n仪器仪器：研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直：研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸形冷凝管、层析缸 n试剂试剂：硅胶：硅胶 G G，中性氧化铝，甲醇，中性氧化铝，甲醇，石油醚（石油醚（60-90 60-90），丙酮，乙酸乙），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶。酯，菠菜叶。四、实验流程四、实验流程菠 菜菠 菜 汁萃 取 液研 磨过 滤石 油 醚-甲 醇萃 取浸 膏水洗 涤、蒸 馏薄 层 层 析柱 层 析Rf值色 带、溶 液五、操作步骤五、操作步骤
6、n1 1、菠菜色素的提取、菠菜色素的提取 n 称取称取 2g 2g 洗净后的新鲜的菠菜叶，用剪刀剪碎并与洗净后的新鲜的菠菜叶，用剪刀剪碎并与 10mL 10mL 甲醇拌匀，在研钵中研磨约甲醇拌匀，在研钵中研磨约 5min 5min 然后用布氏漏斗然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤渣。抽滤菠菜汁，弃去滤渣。n 将菠菜汁放回研钵，每次用将菠菜汁放回研钵，每次用 10mL 3:2 10mL 3:2（体积比）的石（体积比）的石油醚油醚 -甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤。甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤。合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用 5
7、mL 5mL 水洗涤水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。弃去水止产生乳化。弃去水 -甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为约为 1mL 1mL 为止。为止。n2 2、薄层层析、薄层层析 n 取四块显微载玻片，用硅胶取四块显微载玻片，用硅胶 G G 加加 0.5%0.5%羧甲基纤维素调制后制羧甲基纤维素调制后制板，晾干后在板，晾干后在 110 110 活化活化 1h 1h。n展开剂：展开剂：（a
8、 a）石油醚）石油醚 -丙酮丙酮 =8:2=8:2（体积比）（体积比）n （b b）石油醚）石油醚 -乙酸乙酯乙酸乙酯 =6:4=6:4（体积比）（体积比）n取活化后的层析板，点样后，小心放入预先加入选定展开剂的广取活化后的层析板，点样后，小心放入预先加入选定展开剂的广口瓶内，盖好瓶盖。待展开剂上升至规定高度时，取出层析板，口瓶内，盖好瓶盖。待展开剂上升至规定高度时，取出层析板，在空气中晾干，用铅笔做出标记，并进行测量，分别计算出在空气中晾干，用铅笔做出标记，并进行测量，分别计算出 RfRf 值。值。n分别用展开剂分别用展开剂 a a 和和 b b 展开，比较不同展开剂系统的展开效果。展开，比
9、较不同展开剂系统的展开效果。观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的 RfRf 值的大小次序。注意更换展开剂时，须干燥层析瓶值的大小次序。注意更换展开剂时，须干燥层析瓶n在层析柱中，加在层析柱中，加 3cm 3cm 高的石油醚。另取少量脱脂棉，先高的石油醚。另取少量脱脂棉，先在小烧杯用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析在小烧杯用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析柱底部，轻轻压紧，塞住底部。将柱底部，轻轻压紧，塞住底部。将 3g 3g 层析用的中性氧化层析用的中性氧化铝（铝（150150160 160 目），从玻璃漏
10、斗中缓缓加入，小心打开目），从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满溢，更不能干涸。装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开溢，更不能干涸。装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下 1 12mm 2mm 高时关上活塞（注意！在任何情况下，
11、氧化铝表面不得露高时关上活塞（注意！在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面）。出液面）。n将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部，将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部，加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上 1mm 1mm 左左右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复，使色素全部进入柱体。经几次反复，使色素全部进入柱体。n待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂石油醚石油醚 -丙酮溶液丙酮溶液 9:1 9:1（体积比
12、）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放（体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。胡萝卜素。n用石油醚用石油醚 -丙酮丙酮 7:3 7:3（体积比）作洗脱剂，分出第二个（体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素黄色带，它是叶黄素 （1 1）。再用丁醇。再用丁醇 -乙醇乙醇 -水水 3:1:1 3:1:1（体积比）洗脱叶绿素（体积比）洗脱叶绿素 a a（蓝绿色）和叶绿素（蓝绿色）和叶绿素 b b（黄绿色）。（黄绿色）。六、注释六、注释n（1 1）叶黄素易溶于醇而在石油醚中）叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分出黄色带。出黄色带。七、思考题七、思考题n1 1、试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素、试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？析柱中移动最快？
