1、2023-5-14山东农业大学1讲课内容：讲课内容：植物转基因育种研究进展植物转基因育种研究进展 遗传转化中常用的标记基因遗传转化中常用的标记基因 转基因抗虫植物研究进展转基因抗虫植物研究进展 SARS病毒疫苗研制的策略病毒疫苗研制的策略 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 植物功能基因组研究技术植物功能基因组研究技术 蛋白质组学及其研究技术（蛋白质组学及其研究技术（1、2）作业：作业：每人提交课程论文每人提交课程论文1篇，并做报告篇，并做报告2023-5-14山东农业大学2一、植物育种的基本内涵一、植物育种的基本内涵变异变异=选择选择二、转基因育种的特点二、转基因育种的特点 1、转基因育种的基本概
2、念、转基因育种的基本概念 根据育种目标，从供体生物中分离或提取目的基因，经过DNA重组与遗传转化或直接运载，使目的基因进入受体植物，通过筛选获得目标性状发生定向变异的遗传工程体，经田间实验和大田选择，形成新品种或新种质资源。2、转基因育种的特点、转基因育种的特点与常规育种技术相比，转基因育种具有以下特点：打破生物分类界限，实现远缘遗传物质的渗透。可以定向创造变异。只改变个别性状，育种速度快。2023-5-14山东农业大学3植物转基因技术示意图2023-5-14山东农业大学4三、转基因育种的技术体系三、转基因育种的技术体系 重组重组DNA 入植物入植物 培养再生培养再生 选择转化体选择转化体 新
3、品种新品种技术体系包括：技术体系包括：1、重组、重组DNA技术：技术：目的基因的制备目的基因的制备 所用载体所用载体 A 克隆载体克隆载体：E.coli 的多拷贝小质粒，保存和克隆目的基因B 中间克隆载体中间克隆载体：在大肠杆菌质粒中插入T-DNA片段、目的基因和标记基因，是构建中间表达载体的基础。表达载体含植物特异启动子的中间载体，是作为构建转化载体的基础。C 卸甲载体：卸甲载体：解除Ti、Ri致瘤，构建转化载体的受体质粒D 转化载体：转化载体：导入目的基因的载体，由卸甲载体和中间表达载体构建而成。根据其结构特点又可分为一元载体系统和双元载体系统，T-DNA与Vir基因是否在两个独立的质粒上
4、2023-5-14山东农业大学5三、转基因育种的技术体系三、转基因育种的技术体系2、遗传转化技术、遗传转化技术重组重组DNA导入植物细胞或组织：导入植物细胞或组织：载体转化系统载体转化系统直接转化系统直接转化系统种质转化系统种质转化系统评价转化方法的指标：评价转化方法的指标：A转化率；转化率；B工作效率；工作效率；C适用范围；适用范围；D重复性；重复性；E操作；操作；F获得转基因植株的速度。获得转基因植株的速度。2023-5-14山东农业大学6农杆菌共培养侵染诱导愈伤组织分化生芽生根叶盘转化法(1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。2023-5-14山东农业大学7 植植物物遗遗传传转
5、转化化系系统统转化系统转化系统载体载体转化原理转化原理转化方法转化方法受体受体 载体转化系统 农杆菌Ti质粒 叶盘法共培养法共感染法各种受体Ri质粒 病毒RNADNA 直接转化系统 物理原理电激法 原生质体电泳法超声波法激光、离子微束法显微注射法基因枪法各种受体化学原理PEG法原生质体脂质体法 种质转化系统种质细胞茎尖细胞细胞转化法细胞 生殖细胞花粉粒花粉管通道法卵细胞浸泡法原生质体植物遗传转化系统总汇植物遗传转化系统总汇 2023-5-14山东农业大学8评价评价指标指标遗传转化方法遗传转化方法基因枪基因枪农杆菌农杆菌PEG法法电激法电激法注射注射花粉管通道花粉管通道受体受体材料材料完整细胞完
6、整细胞原生质体原生质体原生质体卵细胞寄主寄主范围范围无有无无无有性繁殖植物培养培养条件条件简单简单复杂复杂复杂无转化率转化率10-310-210-210-110-510-410-510-410-310-210-1101嵌合体嵌合体多有无无无无操作操作复杂简单简单复杂复杂简单设备设备要求要求昂贵便宜便宜昂贵昂贵便宜工作工作效率效率高高低低低低对单子对单子叶植物叶植物广泛（条件）可行可行可行可行广泛常用植物遗传转化方法比较常用植物遗传转化方法比较 2023-5-14山东农业大学9好的转化受体系统必须具备如下条件好的转化受体系统必须具备如下条件A 高效稳定的再生能力高效稳定的再生能力B 较高的遗传稳
7、定性较高的遗传稳定性C 具有稳定的外植体来源具有稳定的外植体来源D 对选择性抗生素的敏感性对选择性抗生素的敏感性E 对农杆菌感染的敏感性对农杆菌感染的敏感性 2023-5-14山东农业大学10三、转基因育种的技术体系三、转基因育种的技术体系2、遗传转化技术、遗传转化技术转化体的筛选：转化体的筛选：培养基中施加选择压培养基中施加选择压转化体的鉴定转化体的鉴定认可转基因植物的证据应包括以下几个方面认可转基因植物的证据应包括以下几个方面A 有严格的对照（包括阳性和阴性对照）有严格的对照（包括阳性和阴性对照）B 外源基因整合和表达的分子生物学证据（外源基因整合和表达的分子生物学证据（PCR、South
8、ern、Northern、Western杂交、杂交、ELISA）C 外源基因控制表型性状的证据外源基因控制表型性状的证据D 根据植物的繁殖方式提供遗传证据根据植物的繁殖方式提供遗传证据 2023-5-14山东农业大学11三、转基因育种的技术体系三、转基因育种的技术体系3、组织培养的再生技术、组织培养的再生技术 建立组织培养系统建立组织培养系统 转化体的筛选与植株再生转化体的筛选与植株再生外植体：幼年型；增殖能力强；萌动期；强再生能力基因型；遗传稳定性培养基：A 各类培养基的特点各类培养基的特点；B背景调查；C选择原则：物种；器官；营养成分与栽培条件的相似性；MS通用性；无机盐应作为主要参数；有
9、机成分种类、含量；蔗糖浓度；磷酸根；水解酪蛋白D激素：生长素和细胞分裂素 浓度和比例培养条件：光照和温度抗生素的敏感性试验：筛选、抑菌受体对农杆菌的敏感性 2023-5-14山东农业大学12类类型型培培养养基基及及其其研研制制者者特特点点富集元素平衡培养基MS（Murashige&Skoog 1962）LS（Linsmaier Skoog 1965）BL（Brown&Lawrence 1968）BM（Button 1975）ER（Eriksson 1965）1、无机盐浓度高，元素比例协调，缓冲性好，易保持离子平衡。2、营养丰富，不需再加入水解蛋白等有机物。3、微量元素种类齐全，浓度高。硝酸钾含
10、量较高培养基B5（Gamborg etal 1968）N6(朱至清等1975)SH(Sckenk&Hildebrandt)1、硝酸钾含量高。2、氨态N含量低。3、含有较高的盐酸硫胺素（VB1）中等无机盐含量培养基H(Bourgin&Nitsch 1967)Nitsch(1969)Miller(1963)Blaydes(1966)1、大量元素无机盐约为MS的一半。2、微量元素的种类减少，但含量增高。3、维生素种类比 MS 多，添加生物素、叶酸等。低无机盐含量培养基White(1943),HS(Heller 1953)WS(Wolter&Skoog 1966）改良Nitsch(1959)1、无机盐
11、含量很低，约为MS的1/4。2、有机成分含量也很低。3、多数情况下用于生根。培养基的类型及特点培养基的类型及特点2023-5-14山东农业大学13三、转基因育种的技术体系三、转基因育种的技术体系4、转化体的选择技术、转化体的选择技术 在得到转基因植株并确认目的基因稳定表在得到转基因植株并确认目的基因稳定表达后，在控制条件下的中间试验及与生产达后，在控制条件下的中间试验及与生产性试验相结合进行选择，既要考虑目的基性试验相结合进行选择，既要考虑目的基因的表达性状，又要兼顾优良的农艺性状，因的表达性状，又要兼顾优良的农艺性状，直至形成新品种，进行商品化生产。直至形成新品种，进行商品化生产。2023-
12、5-14山东农业大学14四、转基因改良的性状四、转基因改良的性状 自从自从1983年得到第一个烟草转基因植物年得到第一个烟草转基因植物至今，通过转基因改良的植物性状已达至今，通过转基因改良的植物性状已达40多种，主要有抗除草剂、多种，主要有抗除草剂、抗逆性抗逆性（抗虫、抗虫、抗病毒病、抗真菌病、抗细菌病、抗旱与抗病毒病、抗真菌病、抗细菌病、抗旱与耐盐耐盐）、品质性状、经济性状、标记抗性。）、品质性状、经济性状、标记抗性。2023-5-14山东农业大学15转转 基基 因因 改改 良良 植植 物物 抗抗 性性 常常 用用 的的 目目 的的 基基 因因改改 良良 性性 状状基基 因因 产产 物物常常
13、 用用 基基 因因来来 源源受受 体体 举举 例例杀 虫 晶 体 蛋 白cry苏 云 金 杆 菌玉 米、棉 花、马 铃 薯蛋 白 酶 抑 制Cpt I PII 巯 基 蛋 白 酶 抑 制豇 豆、马 铃 薯、水 稻烟 草、水 稻、油 菜植 物 凝 集 素W GA、GN A、P-lec小 麦、雪 花 莲、豌 豆烟 草、莴 苣、玉 米、水 稻抗抗虫虫淀 粉 酶 抑 制AI小 麦、大 麦烟 草外 壳 蛋 白CP烟 草、番 茄、马 铃 薯、水 稻复 制 酶TMV 54kD、PEBV 221kD烟 草卫 星 RN ACM V、TRV卫 星 RNA植 物 病 毒烟 草抗抗病病毒毒病病核糖体失活蛋白PAP商
14、陆烟 草、马 铃 薯几 丁 质 酶CH5B、chi5A烟 草、番 茄、水 稻-1,3-葡聚糖酶-1,3-葡 聚 糖 酶植 物、细 菌、真 菌番 茄植 物 抗 毒 素编 码 3,4,5三 羟 芪葡 萄烟 草抗抗真真菌菌病病核糖体灭活蛋白RIP大 麦烟 草杀 菌 肽Sarcotox1A、SB-37、Shiva-1天 蚕马 铃 薯、烟 草溶 菌 酶溶 菌 酶细 菌烟 草抗抗 细细 菌菌 病病LRR和 激 酶Xa21水 稻水 稻EPSPS（莽 草 酸羟 基 转 移 酶）AroA（草 甘 膦）大 肠 杆 菌乙 酰 乳 酸 盐 合成 酶ALS（磺 酰 脲 和 咪 唑 啉 酮）烟 草、拟 南 芥QB蛋 白p
15、sb A（阿 特 拉 津）细 菌PAT（草 丁 膦 乙酰 转 移 酶）Bar（草 丁 膦）潮 湿 霉 菌腈 水 解 酶bxn（溴 苯 腈）细 菌抗抗除除草草剂剂2,4-D加 氧 酶tfd A（2,4-D）细 菌烟 草、番 茄、马 铃 薯、大 豆、棉 花、水 稻、油 菜、玉 米、甜 菜、苜 蓿、抗 冻 蛋 白AFP鱼 类烟 草、番 茄抗 氧 化 酶 类Cu/Zn/Mn-SOD矮 牵 牛、番 茄、豌 豆烟 草、番 茄、马 铃 薯抗抗 非非生生 物物胁胁 迫迫相 溶 性 溶 质MtlD、GutD、BADH、ProA/B、SacB、LEA植 物、细 菌烟 草、水 稻2023-5-14山东农业大学16五
16、、转基因植物的安全性评价五、转基因植物的安全性评价 安全性评价的必要性目前科学技术发展水平不能精确地预测转基因可能产生的所有表型效应（基因工程产品对人类及环境的安全性），要求采取必要措施，防患于未然。美国及一些发达国家对此项工作开展的较早，我国在进入九十年代后才开始重视此问题。1993年12月国家科委颁布了基因工程安全管理办法办法，1996年7月农业部颁布了农业生物基因工程安全管理实施办法。2002.3.20 新规定 2023-5-14山东农业大学171、目的：、目的：促进研究与开发，防止遗传工程体及其产品对人类促进研究与开发，防止遗传工程体及其产品对人类健康、人类赖以生存的环境和农业生态平衡
17、可能造成的危害健康、人类赖以生存的环境和农业生态平衡可能造成的危害。2、项目类别：、项目类别：实验研究、中间试验、环境释放、生产性实验、实验研究、中间试验、环境释放、生产性实验、安全证书安全证书3、申请转基因植物进入田间试验或环境释放应提供的、申请转基因植物进入田间试验或环境释放应提供的资料：资料：A受体植物的生物学特性；受体植物的生物学特性；B基因操作的安全性；基因操作的安全性；C转转基因植物的生物学特性；基因植物的生物学特性；D释放地点的生态、环境资料；释放地点的生态、环境资料；E检检测方法及控制措施。测方法及控制措施。2023-5-14山东农业大学184、安全性等级及审批、安全性等级及审
18、批5、结果反馈、结果反馈受理日期：每年6/31和12/31反馈：受理后三个月通知结果项项目目类类型型及及审审批批权权限限等等级级划划分分标标准准实实验验研研究究中中间间试试验验生生产产性性试试验验商商品品化化安安全全证证书书I尚不存在危险农业行政部门报农业部备案农业部农业部农业部II具有低度危险农业行政部门报农业部备案农业部农业部农业部III具有中度危险单位审查，主管部门农业部农业部农业部农业部IV具有高度危险农业部农业部农业部农业部农业部2023-5-14山东农业大学19六、转基因植物的商品化六、转基因植物的商品化 1983年得到第一个转基因烟草年得到第一个转基因烟草 转基因成功的植物种类已
19、达转基因成功的植物种类已达35科科120多种多种 覆盖植物类别：粮食作物、蔬菜、观赏植物、药覆盖植物类别：粮食作物、蔬菜、观赏植物、药用植物、水果、林木和牧草植物等。用植物、水果、林木和牧草植物等。1986年首批转基因植物进入田间试验年首批转基因植物进入田间试验 1994年首先批准了转基因延迟成熟番茄的商品化年首先批准了转基因延迟成熟番茄的商品化生产生产 1998年底美国已有年底美国已有30个转基因植物品种得到应用个转基因植物品种得到应用 2001 年全球有年全球有5百百50万农民种植，面积突破万农民种植，面积突破5000万万公顷公顷 2008年全球转基因作物种植面积增至年全球转基因作物种植面
20、积增至125亿亿hm2 2023-5-14山东农业大学201、转基因植物的田间试验 v美国转基因植物的田间试验情况美国转基因植物的田间试验情况(USDA Database)Phenotype:10Genes:399 Organisms:109Institutions:206 Notifications:7292Release Permits:11172023-5-14山东农业大学212023-5-14山东农业大学22YearReceivedApprovedDelayed ApprovalTotal Approved1987954919881812618198938241438199058372
21、158199110769381071992161122281501993374277293061994608555385931995706666146801996654590356251997808730137431998120610612510861999106196025985200010128993793620011190104270111220023991340134Total8409718339775802023-5-14山东农业大学232023-5-14山东农业大学24 3412 10:3710:14;4-9:14;10:14;4-9:14;4:39Field Trials of
22、Different Transgenic Plants in European Commission(4/23,2001）2023-5-14山东农业大学2919971998年年农农业业部部批批准准的的转转植植物物类类型型9 98 8年年9 97 7年年性性状状申申报报数数 中中间间试试验验 环环境境释释放放 商商品品化化合合计计性性状状申申报报数数 中中间间试试验验 环环境境释释放放 商商品品化化 合合计计抗病148221 12 2抗病1721421 18 8抗虫24731 10 0抗虫162921 13 3耐盐222 2耐贮存3213 3抗冻222 2抗除草剂222 2耐贮存111 1抗冻2
23、22 2抗除草剂111 1品质2112 2转座子111 1花色111 1合合计计4 45 52 20 07 72 229合合计计437 72 28 86 6391997-1998年我国转基因植物的田间实验情况年我国转基因植物的田间实验情况2023-5-14山东农业大学3019971998年年农农业业部部批批准准的的转转植植物物种种类类1 19 99 98 8年年1 19 99 97 7年年植植物物中中间间试试验验环环境境释释放放商商品品化化合合计计植植物物中中间间试试验验 环环境境释释放放商商品品化化合合计计水稻7301 10 0棉花072 29 9棉花5106 6水稻1506 6番茄211
24、14 4马铃薯0606 6烟草2103 3烟草0404 4玉米1001 1番茄021 13 3马铃薯0101 1黄瓜0202 2花生1001 1玉米1102 2甜瓜1001 1大豆0101 1甜椒001 11 1线辣椒0101 1白菜1001 1小麦1001 1番木瓜1001 1矮牵牛001 11 1杨树0101 1广藿香1001 1合合计计2 20 07 72 22 29 9合合计计5 53 30 04 43 39 92023-5-14山东农业大学31已已 实实 现现 商商 品品 化化 的的 转转 基基 因因 植植 物物 品品 种种作 物特 性研 制 者抗 除 草 剂A grE vo、C i
25、ba、D ekalb、P ion eer H i-B red抗 虫C iba-G eig y、M on san to、M yco gen/C iba、N orth ru p K in g、玉 米雄 性 不 育P G S抗 除 草 剂C algen e、D u P on t棉 花抗 虫M on san to、中 国 农 科 院 生 物 中 心抗 除 草 剂A grE vo、M on san to、P G S、P ion eer H i-B red改 善 油 份C algen e、P G S油 菜雄 性 不 育P G S大 豆抗 除 草 剂A grE vo、M on san to、P ion ee
26、r H i-B red马 铃 薯抗 虫M on san to、抗 病 毒 病中 国番 茄迟（改）熟A gritope、C algen e、D N A P、M on san to、Z en eca、Z en eca/P eto、中 国抗 病 毒 病中 国烟 草抗 除 草 剂S E ITA西 葫 芦抗 病 毒 病A sgrow甜 椒抗 病 毒 病北 京 大 学亚 麻抗 除 草 剂U of S a katech番 木 瓜抗 病 毒 病A grE vo、C orn ell U.&U.H aw aii延 长 插 花 期F loigen e康 乃 馨改 变 花 色F loigen e矮 牵 牛改 变 花
27、色北 京 大 学2、转基因植物的商品化、转基因植物的商品化 2023-5-14山东农业大学3219961997年年转转基基因因作作物物品品种种种种植植的的面面积积各各国国家家种种植植面面积积所所占占比比例例（%）年年份份总总面面积积（百百万万公公顷顷）美国加拿大澳大利亚墨西哥中国阿根廷5141139419962.85743641011411199712.77525各各转转基基因因作作物物植植面面积积所所占占比比例例（%）烟草棉花大豆玉米油菜番茄马铃薯19962.835271810541199712.713114025101不不同同性性状状的的转转基基因因作作物物植植面面积积所所占占比比例例（%
28、）抗病毒病抗虫抗除草剂品质19962.84037231199712.714315412023-5-14山东农业大学331998-2001年全球转基因作物种植面积年全球转基因作物种植面积39.939.944.244.252.652.60 0101020203030404050506060199819981999199920002000年份年份种植面积(百万公顷)种植面积(百万公顷)性状性状抗除草剂抗除草剂抗虫抗虫抗(虫+除草 剂)抗(虫+除草 剂)合计合计种植面积种植面积40.640.67.87.84.24.252.652.6占%占%777715158 81001002001年转不同基因作物的全
29、球种植情况年转不同基因作物的全球种植情况2023-5-14山东农业大学34作物作物大豆大豆玉米玉米棉花棉花油菜油菜合计合计种植面积种植面积33.39.86.82.752.652.6占比例占比例6319135100100国家国家美国美国阿根廷阿根廷加拿大加拿大中国中国合计合计种植面积种植面积35.735.711.811.83.23.21.51.552.252.2占比例占比例686822226 63 399992023-5-14山东农业大学35七、转基因植物研究中应注意的问题七、转基因植物研究中应注意的问题 农艺性状变异农艺性状变异 目标性状表现的稳定性目标性状表现的稳定性 标记基因标记基因 生态安全性生态安全性 食品安全性食品安全性
