1、环状环状RNARNA研究进展研究进展ncRNAncRNA研究的兴起研究的兴起非编码非编码RNARNA 20世纪70年代，研究者发现拟病毒的遗传信息是一种环状单链RNA。它的侵染对象是植物病毒，包括马铃薯，绒毛烟、苜蓿、茛菪和地下三叶草等。1979年，Hsu 和Coca-Prados利用电子显微镜第一次观察到RNA可以以环状的形式存在于真核细胞的细胞质中。1980年，Arnberg等在酵母的线粒体中发现环状RNA。1993年，科学家在人细胞的转录本中也发现了一些由外显子构成的circRNA。然而随着测序技术的进步，使得生物学家们累积了大量的然而随着测序技术的进步，使得生物学家们累积了大量的RNA
2、序列数据集，序列数据集，其中一些来自无尾巴的其中一些来自无尾巴的RNA。2012年，斯坦福大学医学院的分子生物学家年，斯坦福大学医学院的分子生物学家Julia Salzman和同事们报道称在寻找用传统方法可能忽视的和同事们报道称在寻找用传统方法可能忽视的RNA过程中，发过程中，发现了过量的环状人类现了过量的环状人类RNAs。当。当Rajewsky和同事们挖掘环状和同事们挖掘环状RNA分子的数据库分子的数据库时，他们在线虫、小鼠和人类中发现了成千上万的环状时，他们在线虫、小鼠和人类中发现了成千上万的环状RNAs。（Circular RNAs are the predominant transcr
3、ipt isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.Salzman J,Gawad C,Wang PL,Lacayo N,Brown PO.PLoS One.2012;7(2):e30733.doi:10.1371/journal.pone.0030733.）丹麦奥胡斯大学的丹麦奥胡斯大学的Hansen TB和和 Kjems J领导的另一个独立研究小组完成了领导的另一个独立研究小组完成了第二篇第二篇Nature论文研究。这两篇论文都将焦点放在了由大约论文研究。这两篇论文都将焦点放在了由大约1500个核苷个核苷酸构成的一个
4、环状大酸构成的一个环状大RNA上，它表达于小鼠和人类的大脑中。研究人员上，它表达于小鼠和人类的大脑中。研究人员发现它包含了发现它包含了70个个miR-7的结合位点。的结合位点。MicroRNAs是一些通过结合和阻止是一些通过结合和阻止mRNA翻译阻断基因表达的短片段翻译阻断基因表达的短片段RNA。一直以来人们知道，。一直以来人们知道，MiR-7的靶的靶标与癌症和帕金森氏病存在着关联。标与癌症和帕金森氏病存在着关联。（Circular RNA and miR-7 in cancer.Hansen TB,Kjems J,Damgaard CK.Cancer Res.2013 Sep 15;73(1
5、8):5609-12.）（）（Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.Hansen TB,Jensen TI,Clausen BH,Bramsen JB,Finsen B,Damgaard CK,Kjems J.Nature.2013 Mar 21;495(7441):384-8.）虽然有多个证据证明环状虽然有多个证据证明环状RNA的存在，但是由于认知和技术手的存在，但是由于认知和技术手段的局限，环状段的局限，环状RNA的研究非常缓慢，一度有声音强烈质疑环状的研究非常缓慢，一度有声音强烈质疑环状RNA存在的真实性，认
6、为是由于遗传错误或人为干扰所导致。存在的真实性，认为是由于遗传错误或人为干扰所导致。直到直到-2012年，年，Salzman通过高通量测序技术通过高通量测序技术RNA-Seq首次报道了首次报道了80个环状个环状RNA。2013年，年，Jeck等在人类成纤维细胞中检测出了高达等在人类成纤维细胞中检测出了高达25,000多种多种circRNA；Memczak等鉴定出等鉴定出1,950种人类种人类circRNA、1,903 种小鼠种小鼠circRNA（其中（其中81种与人类种与人类circRNA 相同）和相同）和724种线种线虫虫circRNA。在生物信息学、生化分析和深度测序的帮助下，研究者们对神
7、秘在生物信息学、生化分析和深度测序的帮助下，研究者们对神秘的环状的环状RNA有了空前的认识。越来越多的证据表明，环状有了空前的认识。越来越多的证据表明，环状RNA具具有重要的生物学意义，而且它们的功能不同于线性有重要的生物学意义，而且它们的功能不同于线性RNA。2013年年Nature杂志发表的两项研究显示，环状杂志发表的两项研究显示，环状RNA可以起到可以起到microRNA海海绵的作用，可以结合并抑制绵的作用，可以结合并抑制microRNA的活性，进而调控的活性，进而调控microRNA的靶标发挥作用。的靶标发挥作用。（Circular RNAs are a large class of
8、animal RNAs with regulatory potency.Nature.Year published:(2013)DOI:doi:10.1038/nature11928）；（）；（atural RNA circles function as efficient microRNA sponges.NatureYear published:(2013)DOI:doi:10.1038/nature11993）这一发现再次提醒人们：这一发现再次提醒人们：RNA并不仅仅是并不仅仅是DNA与编码蛋白之间的一个与编码蛋白之间的一个平凡信使。在过去的平凡信使。在过去的20年里，研究人员发现了大量
9、的非常规年里，研究人员发现了大量的非常规RNA。一。一些长度意想不到的短，一些则长到令人感到惊讶，而另一些则颠覆常些长度意想不到的短，一些则长到令人感到惊讶，而另一些则颠覆常规具有阻止其他规具有阻止其他RNA链翻译形成蛋白质的功能。几乎所有的链翻译形成蛋白质的功能。几乎所有的RNA都是都是线性的，为数不多的关于植物和动物中的环状线性的，为数不多的关于植物和动物中的环状RNAs的记述，也被当做的记述，也被当做遗传意外或实验人为因素而遭到忽视。遗传意外或实验人为因素而遭到忽视。事实上，线性事实上，线性RNAs的优势有可能一直是假象。经典的的优势有可能一直是假象。经典的RNA测序方法只测序方法只能分
10、离具有特征性分子能分离具有特征性分子“尾巴尾巴”的那些分子。环状的那些分子。环状RNAs的末端连接在的末端连接在一起，缺乏这些尾巴，因此被普遍忽略掉。一起，缺乏这些尾巴，因此被普遍忽略掉。Hansen研究小组发现这一环状研究小组发现这一环状RNA的表达阻断了的表达阻断了miR-7。它使得。它使得miR-7活活性受到抑制，性受到抑制，miR-7靶基因表达增高，研究人员推测这是因为这一靶基因表达增高，研究人员推测这是因为这一RNA环环捕获和失活了捕获和失活了miR-7。Rajewsky研究小组证实，在斑马鱼中表达这一环状研究小组证实，在斑马鱼中表达这一环状RNA或敲除或敲除miR-7可以改变大脑发
11、育。可以改变大脑发育。Rajewsky认为，环状认为，环状RNAs也可能是细胞外也可能是细胞外microRNA的海绵。一些有可能的海绵。一些有可能具有病毒具有病毒microRNAs的结合位点，从而破坏了免疫应答。的结合位点，从而破坏了免疫应答。Rajewsky猜测，猜测，环状环状RNA可能甚至与可能甚至与RNA结合蛋白发挥了互作。结合蛋白发挥了互作。Salzman表示同意：表示同意：“它它们数量如此的丰富，可能扮演了多种功能角色。们数量如此的丰富，可能扮演了多种功能角色。”2013年我国陈玲玲研究员和杨力研究员合作，发现了来源于基因内含子年我国陈玲玲研究员和杨力研究员合作，发现了来源于基因内含
12、子区域的环形区域的环形RNA新分子。他们在新分子。他们在Molecular Cell杂志上揭示了这种环状杂志上揭示了这种环状RNA（ciRNA）的成环机制及其在基因转录调控中的重要功能。研究表明，部）的成环机制及其在基因转录调控中的重要功能。研究表明，部分分ciRNA定位在转录位点附近，通过与定位在转录位点附近，通过与RNA转录聚合酶转录聚合酶复合物互相作用，复合物互相作用，顺式调节其本位基因的表达水平。顺式调节其本位基因的表达水平。2014年年09月陈玲玲和杨力的研究团队在月陈玲玲和杨力的研究团队在Cell杂志上发表文章指出，是内含杂志上发表文章指出，是内含子的互补序列介导了外显子环化。环状
13、子的互补序列介导了外显子环化。环状RNA的生成机制主要有两种模型：的生成机制主要有两种模型：套索驱动的环化和内含子配对驱动的环化。这项研究为内含子配对驱动套索驱动的环化和内含子配对驱动的环化。这项研究为内含子配对驱动环化提供了有力支持，证实是内含子的互补序列介导了外显子环化，生环化提供了有力支持，证实是内含子的互补序列介导了外显子环化，生成的选择性环化产物进一步扩大了哺乳动物转录后调控的复杂性。成的选择性环化产物进一步扩大了哺乳动物转录后调控的复杂性。2015年年2月中国科技大学、华中师范大学等处的研究人员鉴定了月中国科技大学、华中师范大学等处的研究人员鉴定了一类与一类与RNA聚合酶聚合酶相关
14、的环状相关的环状RNA，并将其命名为，并将其命名为EIciRNA。他。他们在们在Nature Structural&Molecular Biology杂志上发表了自己的研杂志上发表了自己的研究结果，展示了这些究结果，展示了这些EIciRNA对细胞核中转录过程的调控。对细胞核中转录过程的调控。2015年年4月，德国月，德国Max Delbrck分子医学中心的研究团队全面分析分子医学中心的研究团队全面分析了哺乳动物大脑内的环状了哺乳动物大脑内的环状RNA。他们在大脑不同区域、原代神经。他们在大脑不同区域、原代神经元、分离的突触、以及神经元分化过程中进行了元、分离的突触、以及神经元分化过程中进行了R
15、NA测序。这项测序。这项发表在发表在Molecular Cell杂志上的研究表明，环状杂志上的研究表明，环状RNA在哺乳动物大在哺乳动物大脑中丰度很高、相当保守而且存在动态表达。脑中丰度很高、相当保守而且存在动态表达。20162016年环状年环状RNARNA研究研究环状环状RNARNA功能研究功能研究 Many thousands of Circular RNAs(circRNAs)have recently been identified in metazoan genomes by transcriptome-wide sequencing.Most circRNAs are genera
16、ted by back-splicing events from exons of protein-coding genes.A great deal of progress has recently been made in understanding the genome-wide expression patterns,biogenesis,and regulation of circRNAs.（Emerging Functions of Circular RNAs.Corts-Lpez M,Miura P.Yale J Biol Med.2016 Dec 23;89(4):527-53
17、7.Review.）To date,however,few functions of circRNAs have been identified.CircRNAs are preferentially expressed in neural tissues and some are found at synapses,suggesting possible functions in the nervous system.circRNAs function：1、microRNA“sponges”to counteract microRNA mediated repression of mRNA.
18、2、protein sequestration,3、transcriptional regulation,4、potential functions in cancer.1、Multiple recent studies have uncovered cellular conditions and stresses that can modulate circRNA expression levels.specific factors involved in circRNA biogenesis and regulation.2、circRNAs might have functions re
19、lated to the mesenchymal phenotype.3、CircRNAs are dynamically expressed during development.4、CircRNAs appear to be regulated in response to aging.5、Additional stress events such as high versus low temperature,and oxidative stress can regulate circRNAs Factors Regulating CircRNA BiogenesisFactors Reg
20、ulating CircRNA Biogenesis direct back-splicing exon-skipping lariat-precursor Stable intronic lariats tissue-specific trans-factors that can regulate circRNA biogenesis or stability.RNA binding proteins(RBPs)；Muscleblind(MBL)is another recently uncovered regulator of circRNA biogenesis；RNA pol IIFu
21、nctions of CircRNAsFunctions of CircRNAs 1、Competition with Linear Splicing 2、MicroRNA Sponges 3、Sequestering Proteins 4、Some of the circRNAs arising from lariat precursors have been described as possible interacting partners with RBPs 5、EIciRNAs can function as regulators of transcription.6、class o
22、f circRNAs have been dubbed fusion-circRNAs(f-circRNAs)(Figure 4D).These originate from cancer-associated chromosomal translocations.a.套索剪接驱动的成环；通过外显子跳跃，上游外显子3端剪接供体与下游外显子5端剪接受体共价结合，随后内含子通过剪接体切除。b.内含子配对驱动的成环；内含子1和内含子3通过碱基互补配对成环，随后内含子被切除形成circRNA或保留形成EIciRNA。c.单个内含子直接成环；套索内含子通过剪接反应生成。5剪接位点附近的GU富集序列和分支
23、点附近的C富集序列使得内含子逃避去分支和降解。分支点3端下游尾巴被切除从而成环。d.RNA结合蛋白或反式元件驱动的成环。RNA结合蛋白或反式元件将侧翼的两个内含子连接，随后去除其中的内含子从而成环。环状环状RNARNA的生物学特征的生物学特征 闭合环状结构，不具有闭合环状结构，不具有5末端和末端和3末端；末端；非编码，不能翻译蛋白质，不与多聚核糖体结合；非编码，不能翻译蛋白质，不与多聚核糖体结合；稳定性高，不易被核酸外切酶稳定性高，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性降解，比线性RNA更稳定；更稳定；表达特异性，环状表达特异性，环状RNA的表达具有组织、时序和疾病特异性；的表达具有组织、时
24、序和疾病特异性；广泛存在，动物（人、小鼠、果蝇、线虫、斑马鱼等）、植物（拟南广泛存在，动物（人、小鼠、果蝇、线虫、斑马鱼等）、植物（拟南芥）、真菌（酿酒酵母等）、原生生物（疟原虫等）中的环状芥）、真菌（酿酒酵母等）、原生生物（疟原虫等）中的环状RNA存在存在明显差异。明显差异。环状环状RNARNA的功能的功能竞争性内源竞争性内源RNARNA（ceRNAceRNA）或）或miRNAmiRNA海绵海绵（miRNA spongemiRNA sponge）2013年，连续两篇Nature杂志同时报道，环状RNACDR1as/ciRS-7，在其序列上有超过60个保守的miR-7结合位点，可以大量结合mi
25、R-7，从而降低发挥功能的miR-7的数量，间接促进了miR-7靶基因的稳定性。由于环状RNA的高稳定性，使得其发挥miRNA sponge功能的潜力远高于其他RNA分子。调控来源基因的表达调控来源基因的表达 circRNA可以与RNA结合蛋白相互结合，特别是转录相关因子，如RNA聚合酶II，转录因子等，将其募集到亲本基因，从而影响亲本基因的表达。另有研究表明，环状RNA和线性RNA的转录后加工之间存在竞争关系，影响mRNA的表达。疾病生物标志物疾病生物标志物 环状RNA稳定性高，容易进入体液（全血，血清，血浆，脑脊液，尿液等），并且其表达模式具有组织、时空和疾病特异性，使得环状RNA成为有潜
26、力的疾病生物标志物。cANRIL作为INK4A0ARF的反义转录本，其表达与INK4/ARF的转录和心血管硬化疾病风险相关。2015年，研究者发现环状RNA在外泌体中大量富集，并且circ-KLHDC10在结肠癌患者血清中的表达水平显著高于正常人。2013年，发现细胞囊泡运输调节机制的科学家们，荣获了当年诺贝尔生理学或医学奖。作为人体内一类重要囊泡，外泌体（exosomes）已成为科研热点。环状RNA是最新发现的一类广泛存在的非编码RNA类型，其抗RNA外切酶的能力尤为突出。大量证据表明核酸和蛋白质分子存在于外泌体中，受外泌体介导在细胞间进行传递。但是环状RNA与外泌体之间的联系尚处于空白。最
27、新的Cell research报道了复旦大学肿瘤研究所黄胜林及何祥火课题组首次发现了exosomes内含有大量circRNA。研究人员收集了MHCC-LM3肝癌细胞培养上清中的exosomes，利用高通量测序（RNA-seq）分别检测细胞和exosomes中的环状RNA，通过SRPBM(spliced reads per billion mapping)计算环状RNA特异性回切位点，数据分析结果显示癌细胞和exosomes中分别含有5,484和6,751个circRNAs。大量文献表明大量文献表明miRNA在在exosomes富集，研究人员进一步对富集，研究人员进一步对exosomes中的中的
28、circRNA与与miRNA之间的关系进行探索。环状之间的关系进行探索。环状RNACDR1as 可以作为可以作为miR-7海绵发挥作用，研究人员转染海绵发挥作用，研究人员转染miR-7 mimics并检测并检测CDR1as在细胞和在细胞和exosomes中的丰度。结果显示中的丰度。结果显示miR-7显著下调显著下调exosomes中中CDR1as的丰度，但在细胞中的丰度，但在细胞中作用不显著，表明作用不显著，表明exosomes对对circRNA有一定的分选功能。有一定的分选功能。血清中含有大量血清中含有大量exosomes，研究人员对人血清，研究人员对人血清exosomes进行进行RNA-s
29、eq检检测，结果发现，血清来源的测，结果发现，血清来源的exosomes中含有中含有1,215个个circRNAs，其中，其中90%以上以上的的circRNA含有外显子序列。含有外显子序列。肿瘤和正常血清来源的肿瘤和正常血清来源的exosomes中中circRNAs是否有差异成为一个是否有差异成为一个非常有趣的课题。研究人员随后将人肝癌细胞非常有趣的课题。研究人员随后将人肝癌细胞MHCC-LM3移植到移植到小鼠模型，分别检测肿瘤移植小鼠和对照小鼠血清来源的小鼠模型，分别检测肿瘤移植小鼠和对照小鼠血清来源的exosomes，qPCR结果显示结果显示circ-CDYL在肿瘤移植小鼠中的表达水平在肿
30、瘤移植小鼠中的表达水平显著高于对照小鼠。进一步，研究人员对结肠癌患者和正常人血显著高于对照小鼠。进一步，研究人员对结肠癌患者和正常人血清清exosomes中的中的circRNA进行检测，结果显示进行检测，结果显示circ-KLHDC10在结肠在结肠癌患者癌患者exosomes中的表达水平显著高于正常人，表明外泌体来源中的表达水平显著高于正常人，表明外泌体来源的的circRNA可以作为理想的癌症诊断生物标记物。可以作为理想的癌症诊断生物标记物。轰动遗传界的环状轰动遗传界的环状RNARNA环状环状RNARNA的稳定性高的稳定性高环状环状RNARNA的细胞定位的细胞定位 环状环状RNARNA的组织特
31、异性的组织特异性环状环状RNARNA与疾病密切相关与疾病密切相关 环状环状RNARNA广泛调节基因表达广泛调节基因表达环状环状RNARNA功能功能1 1：miRNAmiRNA海绵海绵 环状环状RNARNA功能功能2 2：Host geneHost gene转录转录环状环状RNARNA功能功能3 3：Pre-mRNAPre-mRNA剪接剪接 环状环状RNARNA研究思路研究思路 环状环状RNARNA胎猪脑组织表达谱检测胎猪脑组织表达谱检测环状环状RNARNA是理想的新型是理想的新型biomarker biomarker 环状环状RNARNA是理想的新型是理想的新型biomarker biomarker BiomarkerBiomarker研究思路研究思路环状环状RNARNA功能机制研究思路功能机制研究思路 环状环状RNARNA研究思路研究思路 高效去除线性高效去除线性RNA RNA 生物信息学分析生物信息学分析 信息注释信息注释 聚类分析聚类分析 环状环状RNARNA来源基因分析来源基因分析环状环状RNARNA可视化展示可视化展示 miRNAmiRNA海绵海绵环状环状RNA-miRNARNA-miRNA相互作用相互作用 环状环状RNA-miRNA-mRNARNA-miRNA-mRNA相互作用相互作用 生物标记物筛选分析生物标记物筛选分析 验证验证鉴定鉴定功能功能机制机制
